摘要：采用等離子體裝置激發(fā)產(chǎn)生的臭氧和氮氧化合物處理接種青霉菌的索邦百合（Lilium spp.）鱗片，以探究等離子體對百合青霉菌的殺菌效果及臭氧處理百合種球?qū)χ仓晟L發(fā)育的影響。結(jié)果表明，2種等離子體氣體間隔2 d或4 d處理20 min均能有效抑制百合青霉菌，發(fā)病率可控制在11.11%～22.22%。等離子體發(fā)生的臭氧能有效抑制青霉菌的發(fā)生，同時不影響百合的生長發(fā)育。本研究是等離子體技術(shù)在百合種球青霉菌防治中的首次報道，有利于促進百合種球國產(chǎn)化，助推綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)。

關(guān)鍵詞：百合（Lilium spp.）；青霉菌；等離子體；臭氧；氮氧化合物

中圖分類號：S436.8" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）08-0081-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.08.012 開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Fungicidal effect of plasma on Penicillium of lily

LIU Cui-cui， GAO Si-fan， WU Shen-zhong， NING Guo-gui， HE Yan-hong

（National Key Laboratory of Germplasm Innovation and Utilization of Fruit and Vegetable Horticultural Crops/College of Horticulture and Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University， Wuhan" 430070， China）

Abstract：Bulb scales of Lilium oriental hybrids Sorbonne inoculated with Penicillium were treated with ozone and nitrogen oxides generated by the plasma device to explore the bactericidal effect of plasma on Penicillium of lily and the effect of ozone treatment on plant growth and development. The results showed that both plasma gases treated for 20 min every two days or four days effectively inhibited Penicillium of lily， and the incidence rate could be controlled to 11.11%～22.22%. The ozone generated by plasma could effectively inhibit the occurrence of Penicillium without affecting the growth and development of lily. This study was the first report of plasma technology in the control of Penicillium in lily bulbs， which was beneficial to promote the domestic localization of lily bulbs and green ecological agriculture.

Key words： lily（Lilium spp.）； Penicillium； plasma； ozone； nitrogen oxides

百合（Lilium spp.）是世界六大切花之一，被譽為球根花卉之王，也是國內(nèi)重要的切花之一。中國生產(chǎn)切花所用的百合種球長期依賴進口，2020年國內(nèi)百合種球進口量高達3.6億粒［1-3］。國內(nèi)學者一直致力于百合種球國產(chǎn)化，但百合種球在貯藏過程中細菌、真菌、病毒頻發(fā)［4，5］，且許多病害的病因復雜，發(fā)病后影響種球的大小、緊實度等，嚴重影響百合種球質(zhì)量和百合植株的生長發(fā)育，并導致百合種球退化嚴重［1］，因此百合病害防治的研究對百合種球國產(chǎn)化意義重大。青霉病是百合種球貯藏期的主要病害之一，中國百合種球生產(chǎn)貯藏期間主要依賴化學方法進行防治［6-8］，多采用多菌靈、撲海因等藥劑浸泡種球殺菌，長期使用會導致病菌抗藥性增強，并產(chǎn)生環(huán)境污染［9］。此外，也采用一些物理方法進行百合病害的防治，例如溫湯處理法，但溫湯處理法對溫度控制要求高，溫度過高對百合種球自身造成傷害，溫度過低又無法徹底殺菌，不適合大規(guī)模使用［10］。

隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，利用等離子體技術(shù)對植物進行消毒滅菌的方法備受關(guān)注。1857年，西門子第一次展示了非熱介質(zhì)阻擋放電產(chǎn)生等離子體裝置，為人們探究等離子體技術(shù)提供了有力的工具［11］。等離子體是指空氣在受到特定裝置產(chǎn)生的高能粒子作用時電離產(chǎn)生的微小粒子［12］。高頻電場或輝光放電產(chǎn)生的等離子體可在真空狀態(tài)或正常大氣壓下產(chǎn)生抗微生物的活性自由基粒子，其中含有大量活性氧粒子、含氧自由基基團等活性物質(zhì)［13，14］。研究表明等離子體具有消毒滅菌的作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可作為殺菌劑殺滅病原微生物，防治害蟲等［15］。等離子體技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于果蔬的貯藏保鮮［16，17］，但是在花卉中的應(yīng)用較少。

本研究以百合青霉菌為試驗對象，采用等離子體技術(shù)，研究等離子體發(fā)生裝置激發(fā)的臭氧、氮氧化合物對百合青霉菌的抑制效果，為百合生產(chǎn)提供理論和技術(shù)依據(jù)。旨在建立基于等離子體技術(shù)的百合種球青霉病高效防控技術(shù)，從而提高國產(chǎn)百合種球質(zhì)量，減少農(nóng)藥化學污染，助推綠色、生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

選用冷庫貯藏發(fā)生典型青霉病變的索邦百合種球分離青霉致病菌；采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)青霉致病菌［18］；選擇生長飽滿、健壯、無病蟲害的索邦百合種球接種青霉致病菌。采用華中科技大學強電磁工程與新技術(shù)國家重點實驗室研制的等離子體發(fā)生裝置模型激發(fā)臭氧和氮氧化合物。

1.2 方法

1.2.1 青霉菌的分離與鑒定 在超凈工作臺中，選擇具有典型青霉病癥狀的百合鱗片，在病健交界處取3 mm×3 mm小方塊置于PDA培養(yǎng)基上［19］，于室溫條件下培養(yǎng)7 d后通過平板劃線法及點接法進行分離純化和繼代培養(yǎng)［20］。將分離的病原菌點接于PDA培養(yǎng)基上［21］，培養(yǎng)7 d后觀察菌落特征，拍照記錄，并在顯微鏡下觀察不同菌株分生孢子梗及分生孢子的形態(tài)特征。在形態(tài)學鑒定的基礎(chǔ)上，將分離獲得的菌株采用CTAB法提取青霉菌的基因組DNA進行分子鑒定［22，23］，以提取的青霉菌DNA為模板，使用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）（由上海生物工程有限公司合成）擴增青霉菌的ITS序列［20］。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×Taq PCR Mix（aidlab）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL。PCR擴增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物送由上海生物工程有限公司進行測序，測序結(jié)果通過NCBI的Blast功能（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行比對，獲得病菌種類。

1.2.2 病原菌的致病性檢測 挑選健康、無病害、大小一致的索邦百合的內(nèi)層鱗片，清水洗凈備用。將純化培養(yǎng)7 d的青霉孢子懸浮于無菌水，血球計數(shù)板計數(shù)，配成1×106 CFU/mL的孢子懸浮液［24］，用移液槍槍頭（1 000 μL）刺傷百合鱗片的內(nèi)側(cè)中心部位，確保傷口位置和深度一致且不穿透鱗片。每個傷口接種50 μL孢子懸浮液，每6片鱗片為1組，置于墊有濕潤濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，25 ℃恒溫保濕培養(yǎng)，觀察青霉菌的致病情況。通過觀測百合鱗片的發(fā)病率、發(fā)病鱗片的病斑直徑和菌落直徑等確定青霉菌菌種致病能力強弱，選出致病能力最強的青霉菌菌種進行后續(xù)試驗。

1.2.3 等離子體激發(fā)氣體對百合青霉菌的抑制效果 挑選健康、無病害、大小一致的索邦百合的內(nèi)層鱗片，清水洗凈備用。用移液槍槍頭（1 000 μL）刺傷百合鱗片的內(nèi)側(cè)中心部位，確保傷口位置和深度一致且不穿透鱗片。每個傷口接種50 μL濃度為1×106 CFU/mL的Penicillium sublectaticum孢子懸浮液，每6片鱗片為1組，置于墊有濕潤濾紙的9 cm× 9 cm培養(yǎng)皿中，25 ℃恒溫保濕培養(yǎng)。菌落長出后，每隔 2 d或4 d，采用等離子體發(fā)生裝置激發(fā)的臭氧或氮氧化合物處理5、10 min或20 min，處理3次，共6個處理，每個處理6片鱗片，3次重復。處理完成后繼續(xù)置于墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，在25 ℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)，14 d后統(tǒng)計百合鱗片的發(fā)病率，測定發(fā)病鱗片的病斑直徑和菌落直徑，確定等離子體處理的最優(yōu)時間和最優(yōu)頻率。

1.2.4 等離子體激發(fā)臭氧處理對百合生長發(fā)育的影響 挑選健康、無病害、大小一致的索邦百合種球，清水洗凈備用。種球接種青霉菌通過移液槍（1 000 μL）刺傷百合種球的3個部位，確保傷口深度一致且不穿透鱗片。種球的每個傷口接種50 μL濃度為1×106 CFU/mL的Penicillium sublectaticum孢子懸浮液后置于常溫黑暗無菌條件下培養(yǎng)。待種球長出菌落后，每隔2 d或4 d，采用等離子體發(fā)生裝置激發(fā)的臭氧處理20、30 min或40 min，處理3次；以不經(jīng)臭氧處理的百合種球為對照。每個處理3個種球，4次重復。處理后的百合種球種植在華中農(nóng)業(yè)大學花卉基地溫室內(nèi)進行養(yǎng)護管理，每盆種植3個種球，基質(zhì)為泥炭土∶珍珠巖=3∶1，待百合成熟進入盛花期后，測定株高、莖粗、葉長、葉寬、花數(shù)、花徑形態(tài)指標，明確等離子處理對百合生長發(fā)育的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離鑒定與致病性檢測

通過菌落形態(tài)學鑒定（圖1A 至圖1C）以及分子鑒定，結(jié)果表明，從百合種球上分離純化得到3種青霉菌，分別為多生青霉（Penicillium hirsutum）、Penicillium sublectaticum和洋蔥青霉（Penicillium albocoremium）。將3種青霉菌分別接種至健康的百合鱗片上進行致病性檢測，觀察菌落的生長情況，發(fā)現(xiàn)Penicillium sublectaticum的致病能力最強，多生青霉次之，洋蔥青霉最弱（圖1D至圖1F）。

2.2 等離子體激發(fā)臭氧對青霉菌的抑制效果

如表1所示，同一處理頻率下，隨著臭氧處理時間延長，青霉菌的發(fā)病率顯著降低；間隔2 d和間隔4 d處理條件下，均是處理20 min的抑菌效果最佳，其中間隔2 d臭氧處理20 min的青霉菌發(fā)病率僅為14.44%，顯著優(yōu)于其他處理。但各處理中發(fā)病鱗片的菌落直徑和病斑直徑均無顯著差異，說明臭氧處理可顯著降低百合鱗片青霉病的發(fā)病率，減少百合鱗片腐爛的發(fā)生，但不能顯著抑制發(fā)病鱗片菌落和病斑的擴展。

2.3 等離子體激發(fā)氮氧化合物對青霉菌的抑制效果

如表2所示，同一處理頻率下，隨著氮氧化合物處理時間的延長，青霉菌的發(fā)病率整體上呈下降趨勢，均是處理20 min的抑菌效果最佳。其中，間隔2 d采用氮氧化合物處理20 min，與處理5、10 min相比，能顯著抑制青霉菌的生長，青霉菌的發(fā)病率為13.33%；而間隔4 d采用氮氧化合物處理20 min，與處理5 min相比，同樣顯著抑制了青霉菌的生長，發(fā)病率僅為11.11%。但各處理之間發(fā)病鱗片的菌落直徑和病斑直徑均無顯著差異，說明氮氧化合物處理可有效降低百合鱗片青霉病的發(fā)病率，減少百合鱗片腐爛的發(fā)生，但不能顯著抑制發(fā)病鱗片菌落和病斑的擴展。

2.4 等離子體激發(fā)臭氧處理百合種球?qū)Π俸仙L發(fā)育的影響

由于氮氧化合物對百合青霉菌的抑制效果與臭氧處理的效果無顯著差異，考慮到2種氣體在使用過程中的安全性和環(huán)保性，選用臭氧作為抑菌氣體。每隔2 d和4 d采用等離子體發(fā)生裝置激發(fā)臭氧處理接種青霉菌的百合種球20、30 min和40 min，與不經(jīng)臭氧處理的百合種球進行對比，結(jié)果表明，臭氧處理的百合種球?qū)Π俸现旮摺⑶o粗、葉長、葉寬、花數(shù)、花徑影響均不顯著（表3），表明等離子體發(fā)生的臭氧處理百合種球一定時間不影響百合植株的生長發(fā)育。

3 小結(jié)與討論

本研究表明，等離子體發(fā)生裝置激發(fā)的臭氧、氮氧化合物均能顯著降低百合鱗片青霉菌的發(fā)病率，抑制百合青霉病的發(fā)生。由于氮氧化合物會對大氣造成嚴重的污染，引起酸雨、光化學煙霧等危害［25］，且其在滅菌上的報道較少，不適合廣泛用于滅菌，因此，本研究選擇臭氧進行進一步試驗，結(jié)果表明，臭氧處理百合種球?qū)Π俸系纳L發(fā)育無顯著影響。

臭氧是一種廣譜殺菌劑，其殺菌速度快、使用簡便、無二次污染［26］，對柑橘青霉病、黃瓜枯萎病菌、立枯絲核病菌等多種植物病原菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)都有強烈的抑制作用［27，28］。臭氧可以有效防治蔬菜、花卉的病害，目前在黃瓜、甜瓜、茄子、萵苣、百合、月季、洋桔梗等溫室作物品種的病害防治中有應(yīng)用，防治的病害包括所有氣傳和少部分土傳病害［29］。張鴻等［30］證明了臭氧水對蘋果表面的微生物殺滅有明顯的效果；龍君［27］研究表明臭氧氣體處理能夠有效抑制柑橘青霉病的發(fā)病并延緩病斑的擴展；劉煥軍［31］研究表明臭氧處理能顯著抑制擴展青霉菌和灰葡萄孢霉病菌對獼猴桃果實的致病力，降低其發(fā)病率，延緩發(fā)病時間。本研究結(jié)果表明，等離子體激發(fā)產(chǎn)生的臭氧和氮氧化合物均能有效抑制百合青霉菌的發(fā)生，減少百合鱗片腐爛的發(fā)生，且不影響百合植株的生長發(fā)育。等離子體高效、綠色、環(huán)保的殺菌優(yōu)勢適用于百合的工廠化生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景，對助推綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要作用。

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收稿日期：2022-07-11

基金項目：財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-23-C10）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目（202010504040）

作者簡介：劉翠翠（2000-），女，江西南康人，在讀本科生，（電話）18079785678（電子信箱）2029609956@qq.com；通信作者，寧國貴（1979-），教授，博士，主要從事園林植物遺傳育種研究，（電子信箱）ggning@mail.hzau.edu.cn；何燕紅（1982-），副教授，博士，主要從事園林植物遺傳育種研究，（電話）18607188213（電子信箱）hyh2010@mail.hzau.edu.cn。