摘 " " "要：以豬膽汁為原料，利用水解法提取膽紅素，研究抗氧劑用量、堿水解pH、水解溫度、保溫時間和酸化pH等單因素對膽紅素的提取率和含量影響。結果表明：用水解法提取膽紅素的最佳條件是：抗氧劑用量為0.5%，堿水解pH 11.0～11.5，水解溫度75～80 ℃，保溫時間10 min，酸化pH 5.5～6.0，膽紅素的提取率為95%，含量大于98.0%。

關 "鍵 "詞：豬膽汁；膽紅素；抗氧劑；pH值；水解法

中圖分類號：TQ041 " " "文獻標識碼： A " " "文章編號： 1004-0935（2023）04-0506-04

膽紅素為血紅蛋白分解代謝后的還原產物，是一個直鏈的四吡咯化合物，屬于兒戲膽素類，是從動物的膽汁中提取的膽色素， 是體外培育牛黃的主要原料[1]。為淡橙色或深紅棕色單斜晶體，在堿液中或遇三價鐵離子極不穩(wěn)定，很快被氧化。膽紅素在肝臟內與葡萄糖醛酸結合成膽紅素酯，它在膽汁中約占80%，其中70%～80%為二葡萄糖醛酸酯，20%～30%為單葡萄糖醛酸酯[2]。目前，報道最多都是鈣鹽法、乙醇法、樹脂法和水解法等[3-5]。而在工業(yè)化生產中，快速法具有生產工藝簡單，周期短，試劑消耗少等優(yōu)點，被廣泛使用[6]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現膽紅素的堿水解的過程中如何保護膽紅素不被氧化為膽綠素，是膽紅素提取的關鍵。因此，本試驗研究了抗氧劑的添加量及堿水解的pH和溫度，對膽紅素收率和純度的影響，優(yōu)化最佳工藝條件，切實提高膽紅素生產企業(yè)的效益。

1 "材料與試劑

1.1 "原料與試劑

冷凍豬膽購于金鑼集團有限公司；膽紅素標準品，購于中國藥品檢驗所；亞硫酸氫鈉、氫氧化鈉、醋酸、三氯甲烷等均為工業(yè)級，購于山東信達化工有限公司，對氨基苯磺酸、濃鹽酸、亞硝酸鈉均為分析純，購于西隴科學股份有限公司。

1.2 "儀器

SZCL-3A型平板加熱磁力攪拌器、DHG-9140A電熱鼓風干燥箱購于鞏義市予華儀器有限責任公司、BSA224S型電子天平購于賽多利斯科學儀器有限公司、PHS-3C酸度計，購于上海精密科學儀器有限公司、TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計，購于北京普析通用儀器有限公司，R-1005旋轉蒸發(fā)儀購于鄭州長城科工貿有限公司。

2 "實驗方法

2.1 "水解

取車間經破碎過濾后的膽汁并檢測含量，稱重加入0.3%～0.6%亞硫酸氫鈉，然后加熱至 40 ℃，33.3%氫氧化鈉溶液調節(jié) pH 值為 10.5～12，繼續(xù)加熱到65～85℃， 保溫5～20 min，降溫冷卻至35～45 ℃。

2.2 "萃取

向上述降溫后膽汁中加入冰醋酸，調節(jié)pH 4.5～6.5，再加入膽汁量50％的氯仿，攪拌3 min，靜置10 min，再攪拌3 min，靜置60 min，分去下層氯仿層，再向膽汁中加氯仿，重復萃取2次，合并氯仿層。

2.3 "濃縮

將氯仿層吸入到旋轉蒸發(fā)儀內，控制水溫50 ℃，減壓濃縮至無氯仿流出，加適量無水乙醇，加熱至75 ℃。

2.4 "醇洗抽濾

將上述含膽紅素的乙醇液體用布氏漏斗抽濾至干時，用沸騰的無水乙醇沖洗至流出液無色清澈，取出得到膽紅素濕品。

2.5 "干燥

將膽紅素濕品，放入鼓風干燥箱內，溫度80 ℃，干燥2 h，得膽紅素干品。

2.6 "標準曲線的繪制

重氮化試劑的配制：溶液Ⅰ：對氨基苯磺酸

1.0 g，加濃鹽酸15 mL，加入蒸溶液Ⅱ：0.5%的亞硝酸鈉水溶液。用時取105 mLⅠ液加0.35 mLⅡ液，混合均勻即可。餾水985 mL，混合均勻。

精確稱取膽紅素標準品10.0 mg，用少量氯仿在100 mL棕色容量瓶中溶解后，加氯仿至刻度，搖勻，取氯仿液10 mL移入到50 mL棕色容量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度，即為標準品溶液，標準品溶液每毫升相當于0.000 02 g膽紅素。

精密量取標準品溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于帶塞比色管中，分別加入95%乙醇

9 mL、8 mL 、7 mL、6 mL、5 mL、4 mL，使每個比色管中量均為9 mL，再分別加入重氮化試劑

1 mL，混勻，再20 ℃暗處靜置60 min后，于波長520 nm處測定吸收度（光密度值OD）。以吸收度為縱坐標，各管中所含的膽紅素濃度值為橫坐標，繪制出標準曲線圖，見圖1。

2.7 "膽汁中膽紅素含量的測定

取新鮮膽汁1 mL，放入10 mL棕色容量瓶中，用氯仿、乙醇混合液（配比為4∶6）稀釋至刻度，取1 mL放入帶塞的試管中，加8 mL乙醇及1 mL重氮化試劑，其他操作同上，最后在標準曲線上查得的質量（mg），按下式計算：

膽汁中膽紅素含量=標準曲線上查得的質量/1 000×100%。

3 "結果與討論

3.1 "抗氧劑加入量對膽紅素提取率和含量的影響

以3 000 g豬膽汁為原料，膽汁中膽紅素的含量為0.051%，膽紅素的理論量為1.53 g，堿水解 pH值為 11.3，水解溫度77 ℃，保溫反應10 min，酸化 pH值5.8條件下，抗氧劑加入量為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%對膽紅素的提取率和含量的影響，見表1。

3.2 "堿水解pH對膽紅素提取率和含量的影響

以3 000 g豬膽汁為原料，膽汁中膽紅素的含量為0.051%，膽紅素的理論量為1.53 g，抗氧劑加入量0.5%，水解溫度77 ℃，保溫反應10 min，酸化 pH值5.8條件下，堿水解 pH值為10.5～12.0對膽紅素的提取率和含量的影響，見表2。

6 96.6

從表2中，可以看出pH值對生產影響很大，pH值必須符合工藝要求，當水解的pH 11.0～11.5，膽紅素的提取率93.3%和含量98.9%都最高。當水解pH 10.5～11.0時，膽汁中膽紅素水解不完全，有少部分膽紅素仍是結合態(tài)膽紅素形式存在，從而影響提取率；當水解pH 11.5～12.0時，膽紅素很不穩(wěn)定，容易被氧化成膽綠素，過量的堿也會與膽汁酸鹽形成膠體，對后面酸化分層造成困難，氯仿的分層非常慢，從而降低膽紅素的提取率和含量。這與陳士朋等[8]報道結果相一致。

3.3 "水解溫度對膽紅素提取率和含量的影響

以3 000 g豬膽汁為原料，膽汁中膽紅素的含量為0.051%，膽紅素的理論量為1.53 g，抗氧劑加入量0.5%，堿水解pH 11.3，，保溫反應10 min，酸化 pH值5.8條件下，水解溫度65～85 ℃對膽紅素的提取率和含量的影響，見表3。

從表3中可以看出，溫度在75～80 ℃時，膽紅素的提取率94.7%和含量98.5%都最高，當溫度低，pH 11.0～11.5時，膽紅素容易被氧化，溫度過高時，會使膽汁中的油脂類雜質被水解，當萃取酸化時形成乳化層，使得分層非常慢，同時也會帶走含膽紅素的氯仿液，影響膽紅素的提取率和含量，這與徐敏[9]等報道的溫度結果相一致。

3.4 "保溫時間對膽紅素提取率和含量的影響

以3 000 g豬膽汁為原料，膽汁中膽紅素的含量為0.051%，膽紅素的理論量為1.53 g，抗氧劑加入量0.5%，堿水解pH 11.3，水解溫度77 ℃，酸化 pH值5.8條件下，保溫反應5～20 min對膽紅素的提取率和含量的影響，見表4。

從表4中可以看出，保溫反應時間10～15 min時，膽紅素的提取率為93.4%和含量98.8%都最高，當水解時間低于10 min時，溫度77 ℃，水解不完全；當水解時間超過15 min時，膽紅素在pH 11.3條件下會被部分氧化，因此，確定水解時間范圍10～15 min，這與李良玉[10]等報道的結果相一致。

3.5 "酸化pH對膽紅素提取率和含量的影響

以3 000 g豬膽汁為原料，膽汁中膽紅素的含量為0.051%，膽紅素的理論量為1.53 g，抗氧劑加入量0.5%，堿水解pH 11.3，水解溫度77 ℃，保溫反應10 min酸化 pH值4.5～6.5對膽紅素的提取率和含量的影響，見表5。

從表5中可以看出，當酸化pH 5.0～6.0時，膽紅素的提取率95.4%和含量98.7%都最高，若酸化不足，溶液中部分膽紅素陰離子不能和氫離子結合成游離型膽紅素分子，即使分層下層氯仿層溶液顏色變淡，產品提取率明顯下降；當酸化過度時，容易引起氧化，另外粗結合型膽汁酸將部分沉淀出來，包裹嚴重，不但分層困難，而且氯仿層顏色由棕黃色變?yōu)樽睾稚?，膽紅素成品為暗紅色，因此，酸化最適pH在5.5～6.0。這與許強華[11]等報道結果相一致。

表5 "酸化pH對膽紅素的提取率和含量的影響

4 "結 論

以豬膽為原料，采用水解法提取膽紅素，提取膽紅素的最佳提取條件為：抗氧劑用量為0.5%，堿水解pH 11.0～11.5，水解溫度75～80 ℃，保溫時間10 min，酸化pH 5.5～6.0，膽紅素的提取率為95%，含量大于98.0%。

參考文獻：

［1］黃仁術，倪菊芳.膽紅素提取工藝中的皂化水解條件[J].生物加工過程，2010，8（3）：18-22.

［2］王玉田.動物性副產品加工利用[M].北京：化學工業(yè)出版社， 2009： 79-81.

［3］林桂金.醋酸法提取膽紅素的工藝研究[J].中國醫(yī)藥導報，2007， 4（ 27） ： 104-105.

［4］夏小慶，王素華，方駿.膽汁中提取膽紅素的最佳實驗條件探討[J].皖南醫(yī)學院學報，1996，15（ 3 ）：201-203.

［5］劉榮華，汪洋，陳蘭英.CDA-40大孔樹脂提取膽紅素工藝研究[J].中成藥，2000，22（3） ： 187-190.

［6］謝湘.直接快速法提取膽紅素[J].零陵學院學報，2004，2（4）：220-222.

［7］王嘉琳，周迎春，張迪.從豬膽中提取膽紅素[J].化工中間體，2015，2：49-50.

［8］陳士朋，姜健，光斌熊，等.從豬膽中提取膽紅素的研究[J].江西化工，2018，5：116-117.

［9］徐敏，陳良勇，楊彬，等.膽紅素的提取工藝及條件的探索[J].廣東化工，2014，41（24）：18-20.

[10] 李良玉，楊楠，李玲，等.響應面法優(yōu)化膽汁中膽紅素提取條件的研究[J].2009，30（5）：242-244.

[11] 許強華，周世評.膽紅素的提取和含量測定[J].安徽化工， 2005， 4：31-32.

Study on Extraction Technology of Bilirubin From Pig Bile

LYU Hong-bao1， LI Kai2， GUO Qing2*

（1. Suzhou Yifan Pharmaceutical Co.， Ltd.， Suzhou Anhui 234000， China;

2. Anhui Kebao Bioengineering Co.， Ltd.， Huaibei Anhui 235025， China）

Abstract： "Bilirubin was extracted from pig bile by hydrolysis. The effects of antioxidant dosage， alkaline hydrolysis pH， hydrolysis temperature and time， acidification pH on the extraction rate and content of bilirubin were studied. The results showed that the optimal extraction conditions of bilirubin by hydrolyzing method were as follows： dosage of antioxidant was 0.5%， pH of alkaline hydrolysis was 11.0～11.5， hydrolysis temperature was 75～80 ℃， time was 10 min， pH of acidification was 5.5～6.0， the extraction rate of bilirubin was 95%， the content was more than 98.0%.

Key words： "Pig bile; Bilirubin; Antioxidants; pH; Hydrolysis method