摘 要：【目的】為快速篩選出聚合抗白粉病、抗枯萎病基因的甜瓜材料?！痉椒ā恳钥拱追鄄』颍≒m-2、Pm-6）和抗枯萎病基因（Fom-1）的甜瓜材料與優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)甜瓜材料進(jìn)行復(fù)合雜交，采用早代抗病性鑒定及分子標(biāo)記抗病基因檢測(cè)的方法?！窘Y(jié)果】篩選出聚合Pm-2、Pm-6和Fom-1基因的材料2個(gè)（21T41、21T53），聚合Pm-6、Fom-1基因的材料2個(gè)（21T33、21T50），聚合Pm-2、Fom-1基因的材料1個(gè)（21T9）?！窘Y(jié)論】旨在為解決本地主要病害，培育多抗、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)新品種奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甜瓜; 白粉病; 枯萎病; 抗病基因; 基因聚合; 分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S652"""""""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A""""" 文章編號(hào)：1002-204X（2023）06-0005-04

doi：10.3969/j.issn.1002-204x.2023.06.003

Molecular Marker-Assisted Selection of Melon Disease Resistance Gene Cluster

Feng Xihong1， Shen Tairong1， Wang Yangang1， Sun Dexiang1，

Jing Tao1， Zhang Xiaoli1， Dong Jianli1，2*

（1.Ningxia Zhongqing Agricultural Science and Technology Co.， Ltd.， Yinchuan， Ningxia 750001; 2.Agricultural Biotechnology Research Center， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，

Yinchuan， Ningxia 750002）

Abstract [Objective] In order to quickly select melon materials with clustered resistance genes against powdery mildew and fusarium wilt. [Method] Composite crosses were made between melon materials carrying powdery mildew resistance genes （Pm-2， Pm-6） and fusarium wilt resistance gene （Fom-1） and high-quality， high-yielding melon materials. Through early generation disease resistance identification and molecular marker-based testing of disease resistance genes. [Result] Two materials with a cluster of Pm-2， Pm-6， and Fom-1 genes （21T41， 21T53）， two materials with a cluster of Pm-6 and Fom-1 genes （21T33， 21T50）， and one material with a cluster of Pm-2 and Fom-1 genes （21T9） were screened. [Conclusion] This study aims to lay the foundation for solving major local diseases and breeding new varieties with multiple resistance， high quality， and high yield.

Key words Melon; Powdery mildew; Fusarium wilt; Disease resistance gene; Gene cluster; Molecular marker

寧夏農(nóng)林科技， Ningxia Journal of Agri. and Fores. Sci.amp;Tech. 2023， 64（06）：5-8

基金項(xiàng)目：寧夏回族自治區(qū)重大科技項(xiàng)目（2017DC55）、寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2020AAC03503）。

作者簡介：馮錫鴻（1982—），男，山東濟(jì)南人，園藝師，研究方向?yàn)楣喜擞N栽培。

*通信作者：董建力（1956—），男，山西萬榮人，研究員，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)育種。

收稿日期：2022-04-24" 修回日期：2022-09-01

甜瓜（Cucumis melo L.）果實(shí)香甜，深受廣大消費(fèi)者喜愛。白粉病、枯萎病是甜瓜生產(chǎn)中影響其品質(zhì)和產(chǎn)量的主要病害，在甜瓜的露地栽培、保護(hù)地栽培中廣泛發(fā)生，使得甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降[1-3]。僅僅依靠化學(xué)制劑已不能根除諸多病原菌;且隨著用藥時(shí)間的延長，病原菌已產(chǎn)生耐藥性，即使加大用藥劑量也無濟(jì)于事。針對(duì)白粉病、枯萎病的為害，培育抗病的甜瓜新品種迫在眉睫。因受到致病菌株和發(fā)病條件的限制，采用傳統(tǒng)育種方法難以選擇到聚合多個(gè)抗病基因的品種，更難以鑒定抗病基因的聚合體[4-6]。研究表明，利用與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記輔助聚合多個(gè)抗性基因，可以提高選擇的準(zhǔn)確性，這是培育具有持久抗性和綜合抗性品種（系）的方法[7-8]。目前，甜瓜抗蔓枯病基因聚合體的選育成功已有報(bào)道，而甜瓜抗白粉病基因聚合體的研究尚未見報(bào)道。本研究將甜瓜抗白粉病基因、抗枯萎病基因聚合轉(zhuǎn)入優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)甜瓜品種中，利用分子標(biāo)記技術(shù)選擇2個(gè)以上抗白粉病基因聚合為新種質(zhì)新品系，從而解決傳統(tǒng)方法因接種失敗或發(fā)病不明顯而造成表型鑒定難以準(zhǔn)確、快速篩選出抗病基因聚合體的難題，減少抗病育種選擇的盲目性，縮短抗病育種的年限，提高抗病育種的效率。通過本研究獲得抗白粉病基因、抗枯萎病基因聚合體材料，為甜瓜抗病育種提供新種質(zhì)，為分子標(biāo)記輔助選擇育種提供新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甜瓜材料K7-1含有抗白粉病基因Pm-2，由中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所提供;甜瓜材料MR-1含有抗白粉病基因Pm-6和抗枯萎病基因Fom-1，引自山東魯青種苗有限公司;甜脆香含糖量高（17%），口感甜脆、風(fēng)味好，高產(chǎn)，感白粉和枯萎病，引自山東魯青種苗有限公司。以K7-1和MR-1材料為母本，以甜脆香材料為父本進(jìn)行雜交，形成（K7-1×甜脆香）、（MR-1×甜脆香）2個(gè)雜交組合F1代材料，再以雜交組合（K7-1×甜脆香）F1代材料為母本，（MR-1×甜脆香）F1代材料為父本進(jìn)行復(fù)合雜交，形成[（K7-1×甜脆香）×（MR-1×甜脆香）]復(fù)合雜交組合F1代材料，復(fù)合F1雜交組合材料由寧夏中青農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。復(fù)合F1雜交組合材料種植后形成復(fù)合雜交組合F2代材料，從F2代材料中選抗病單株100株，編號(hào)為21T1～21T100，進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

親本材料每個(gè)種植20株，株距30 cm，行距1.5 m，小區(qū)面積9 m2，單行種植，單蔓整枝。復(fù)合雜交F1代材料每個(gè)組合種植20株，復(fù)合雜交F2代材料每個(gè)種植200株，株行距同親本。隨機(jī)排列。以K7-1為抗白粉病對(duì)照（CK1），甜脆香為感白粉病對(duì)照（CK2），MR-1為抗白粉病對(duì)照（CK3）和抗枯萎病對(duì)照（CK4）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

甜瓜DNA的提取參照王懷松等[9]CTAB法。SSR反應(yīng)條件參照許云華等[10]的研究方法，并加以優(yōu)化。

1.3.2 引物合成

甜瓜抗白粉病基因Pm-2、Pm-6和抗枯萎病基因Fom-1引物（表1）由上海生物工程有限公司合成。

1.3.3 分子標(biāo)記檢測(cè)

PCR總反應(yīng)體積為20 μL： ddH2O12.1 μL，10×PCR Buffer2.0 μL，2 mmol.L-1Dntp1.5 μL，25 mmol·L-1

MgCL21.2 μL，10 μmol/L3'和5'引物各1.0 μL，5 U/μL

Taq聚合酶0.2 μL，30 ng/μL模板DNA1.0 μL。

抗白粉病基因Pm-2、Pm-6序列擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，35個(gè)循環(huán){94 ℃變性45 s，64 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min}72 ℃后延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

抗枯萎病基因Fom-1序列擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，35個(gè)循環(huán){94 ℃變性45 s，64 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min}72 ℃后延伸5 min，4 ℃保存。所用模板的濃度統(tǒng)一調(diào)至100 ng/μL。

抗枯萎病基因Fom-2序列擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，35個(gè)循環(huán){94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s}72 ℃后延伸10 min，4 ℃保存。所用模板的濃度統(tǒng)一調(diào)至100 ng/μL。

1.3.4 人工接種及抗性鑒定

單一接種法：將枯萎病和白粉病2種病害分別接種在同一品種不同甜瓜植株上，白粉病采用子葉噴霧接種法，枯萎病采用蘸根接種法，待西瓜苗長到一葉一心時(shí)接種。為了避免白粉病植株與枯萎病植株互相侵染，搭小拱棚將2種植株隔離開。接種第12～15天，待植株充分發(fā)病后，調(diào)查發(fā)病情況。抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)采用國家蔬菜工程技術(shù)研究中心植保課題的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[11]：高抗（HR），DI≤15;抗?。≧），15lt;DI≤35;中抗（MR），35lt;DI≤55;感病（S），55lt;DI≤75;高感（HS），DIgt;75。白粉病病情指數(shù)計(jì)算方法同枯萎病。以病情指數(shù)最高的方法作為最優(yōu)的鑒定方法。

病情指數(shù)（DI）=

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白粉病抗性基因Pm-2的SSR標(biāo)記檢測(cè)

利用甜瓜抗白粉病基因（Pm-2）SSR特異引物對(duì)聚合材料[（K7-1×甜脆香）×（MR-1×甜脆香）]、抗病對(duì)照（CK1）及感病對(duì)照（CK2）DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，抗白粉病對(duì)照K7-1（CK1）能擴(kuò)增出1條175 bp的擴(kuò)增帶，感病對(duì)照甜脆香（CK2）未檢測(cè)到該帶，說明該帶是與抗性基因Pm-2緊密連鎖的特異條帶（圖1）。在72株F2代中，5株擴(kuò)增出175 bp的特異條帶，推測(cè)這5株可能攜帶Pm-2基因（圖1、表2）。

2.2 白粉病抗性基因Pm-6的SSR標(biāo)記檢測(cè)

利用甜瓜抗白粉病基因（Pm-6）SSR特異引物對(duì)聚合材料[（K7-1×甜脆香）×（MR-1×甜脆香）]、抗白粉病對(duì)照（CK3）及感病對(duì)照（CK2）甜脆香的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，抗白粉病對(duì)照MR-1（CK3）能擴(kuò)增出1條110 bp的擴(kuò)增帶， 感病對(duì)照甜脆香（CK2）未檢測(cè)到該帶，說明該帶是與抗性基因Pm-6緊密連鎖的特異條帶（圖2）。在72株F2代中，6株擴(kuò)增出110 bp的特異條帶，推測(cè)這6株可能攜帶Pm-6基因（圖2、表2）。

2.3 枯萎病抗性基因Fom-1的SSR標(biāo)記檢測(cè)

利用甜瓜抗枯萎病基因（Fom-1）SSR特異引物對(duì)聚合材料[（K7-1×甜脆香）×（MR-1×甜脆香）]、抗病對(duì)照（CK4）及感病對(duì)照（CK2）甜脆香的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，在72株F2代中，6株擴(kuò)增出570 bp的特異條帶，推測(cè)這6株可能攜帶Fom-1基因（圖3、表2）。

2.4 優(yōu)良材料鑒選

對(duì)抗源后代材料進(jìn)行農(nóng)藝性狀考察，以及綜合抗性、品質(zhì)、產(chǎn)量等鑒定，篩選出高抗白粉病、抗枯萎病的材料2個(gè)，分別為21T41、21T53;篩選出高抗白粉病、優(yōu)質(zhì)的材料1個(gè)，為21T28;篩選出抗枯萎病、優(yōu)質(zhì)的材料1個(gè)，為21T37。

2.5 不同抗病基因聚合效應(yīng)研究

不同基因材料復(fù)合雜交后代的抗性鑒定結(jié)果表明，不同基因聚合的抗性差異明顯，兩個(gè)抗白粉病基因聚合的后代材料的抗性強(qiáng)于單基因的抗性，Pm-6與Fom-1基因聚合的后代抗病性強(qiáng)于Pm-2與Fom-1基因聚合的后代（表3）。

3 討論與結(jié)論

白粉病和枯萎病是影響甜瓜生產(chǎn)的兩大病害，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致甜瓜大面積減產(chǎn)和絕收?？拱追鄄『涂箍菸∮N成為甜瓜育種的重點(diǎn)。本研究將甜瓜抗白粉病基因和抗枯萎病基因聚合在優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)甜瓜材料中，利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)聚合體早代材料進(jìn)行抗病基因分子檢測(cè)，篩選出具有不同抗病基因的聚合體材料，取得了較理想的結(jié)果。利用甜瓜抗病基因特異分子標(biāo)記在雜交育種早代檢測(cè)目的基因，可準(zhǔn)確篩選出多抗、優(yōu)質(zhì)基因聚合體材料，極大地提高了選擇效率，為加快多抗、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)新品種選育奠定了基礎(chǔ)。

前人的研究結(jié)果多為單一性狀單一基因的導(dǎo)入，或是單一性狀多基因的聚合，番茄多抗基因聚合及分子標(biāo)記輔助選擇育種取得成功[12]。甜瓜兼抗兩種不同抗病基因的聚合鮮有報(bào)道。本研究以抗白粉病基因的K7-1和抗枯萎病基因的MR-1為供體親本，與優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)感病的甜瓜品種甜脆香進(jìn)行復(fù)合雜交，其后代利用分子標(biāo)記輔助選擇和田間抗性鑒定，篩選出聚合抗白粉病基因Pm-2、Pm-6、抗枯萎病基因Fom-1的材料2個(gè)，聚合Pm-6和Fom-1的材料2個(gè)，聚合Pm-2、Fom-1基因和Pm-2、Pm-6基因的材料各1個(gè)，為培育兼抗白粉病和枯萎病的甜瓜新品種提供了育種材料。

分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果表明，篩選出3種基因聚合材料很難，篩選出2種抗病基因聚合的材料很少。因此，在多抗基因聚合雜交F2要擴(kuò)大群體，增加目的基因聚合體材料的出現(xiàn)概率，通過嚴(yán)格的病菌接種抗性鑒定，選出抗病材料F2，通過分子標(biāo)記輔助選擇，可提高抗病基因聚合體檢測(cè)的效率。不同抗病基因聚合抗性鑒定結(jié)果表明，聚合抗病基因可以提高甜瓜的抗性，這與朱明濤等[12]及MATSUMOTO Y等[13]在番茄中的研究結(jié)果一致，再次證實(shí)了分子標(biāo)記輔助聚合甜瓜抗白粉病基因、抗枯萎病基因的有效性。

本研究在檢測(cè)甜瓜抗病基因時(shí)，將高濃度的聚丙烯酰胺凝膠改為較高濃度的瓊脂糖凝膠電泳，雖然只有1條帶，但它的片段大小與聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果中目的基因條帶完全相同，符合檢測(cè)目的。因此，在檢測(cè)抗病基因時(shí)用瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，成本低，省時(shí)，特別適合育種單位對(duì)大批量材料進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王祿星，王曉敏，宋建宇，等. 寧夏甜瓜白粉病室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法及抗性種質(zhì)資源篩選[J]. 中國瓜菜，2020，33（8）：11-15.

[2] 劉慧青，謝麗瓊，王賢磊，等. 精細(xì)定位甜瓜白粉病抗性基因Pm-M[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2022，23（1）：217-225.

[3] 顧美玲，白雪，周默，等. 防治甜瓜枯萎病藥劑配方篩選及盆栽防效測(cè)定[J]. 北方園藝，2019（20）：40-45.

[4] 畢研飛，徐兵劃，錢春桃，等. 分子標(biāo)記輔助甜瓜抗蔓枯病基因的聚合及品種改良[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（3）：523-533.

[5] WOLUKAU J N， ZHOU X H， LI Y， et al. Resistance to gummy stem blight in melon（Cucumis melo L.） germplasm and inheritance of resistance from plant introductions 157076， 420145， and 323498[J]. HortScience， 2007，42（2）：215-221.

[6] KEINATH A P， HOLMES G J， EVERTS K L， et al. Evaluation of combinations of chlorothalonil with azoxystrobin， harpin， and disease forecasting for control of downy mildew and gummy stem blight on melon[J].

Crop Protection， 2007，26（2）：83-88.

[7] 許勇，張海英，康國斌，等. 分子標(biāo)記技術(shù)在西瓜甜瓜上的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中國西瓜甜瓜，1999（4）：34-38.

[8] 危文亮，趙應(yīng)忠. 分子標(biāo)記在作物育種中的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2000（2）：12-16，22.

[9] 王懷松，賀超興，張志斌，等. 甜瓜白粉病抗性AFLP連鎖標(biāo)記的初步研究[J]. 中國瓜菜，2009，22（2）：4-6.

[10] 許云華，沈潔. DNA分子標(biāo)記技術(shù)及其原理[J]. 連云港

師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2003（3）：78-82.

[11] 馬鴻艷，祖元?jiǎng)?，欒非時(shí). 甜瓜種質(zhì)資源苗期抗白粉病鑒定[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40（12）：18-23.

[12] 朱明濤，孫亞林，鄭莎，等. 分子標(biāo)記輔助聚合番茄抗病基因育種[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2010，37（9）：1416-1422.

[13] MATSUMOTO Y， WATANABE N， KUBOYAMA T. Cross-species transferability of 86 cucumber （Cucumis sativus L.） microsatellite markers to gherkin （C. anguria L.）[J]. Scientia Horticulturae， 2012，136：110-114.

責(zé)任編輯：達(dá)海莉