馬慧，馬海杰，焦晨，李紅葉*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物病蟲分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省作物病蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江農(nóng)林大學(xué)園藝科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

柑橘褐斑?。ˋlternaria brown spot, ABS）是由鏈格孢菌橘致病型（Alternaria alternatapathotypetangerine）引起的真菌性病害，主要為害一些橘類和由這些橘類雜交而來的柑橘。該病菌主要為害幼嫩新梢和果實(shí)，引起大量的落葉、落果和枯梢，嚴(yán)重時(shí)可造成春梢?guī)缀跞靠菟?，果?shí)落光，顆粒無收，使果農(nóng)損失嚴(yán)重[1]，是紅橘、貢柑、甌柑、椪柑、甜橘柚、愛媛等柑橘品種的重要病害之一。

作為死體營養(yǎng)型病原真菌，柑橘褐斑病菌產(chǎn)生的寄主選擇性毒素——柑橘鏈格孢毒素[Alternaria citritoxin（ACT），一類環(huán)氧癸三烯酸類化合物]是重要的致病因子，在該病菌孢子萌發(fā)過程中即可產(chǎn)生，通過破壞寄主細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞電解質(zhì)快速滲漏，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，進(jìn)而死亡的細(xì)胞為病原菌定植生長提供能量[2]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)該病菌分泌的細(xì)胞壁降解酶（cell wall-degrading enzymes,CWDEs）和活性氧解毒酶等也是致病因子，可幫助其成功定植和參與致病[3-5]。已有研究表明：合成ACT的基因都是多拷貝基因，除編碼烯酰輔酶A水合酶的基因ACTT6外，其余毒素基因構(gòu)成簇分布在條件非必要染色體（conditionally dispensable chromosome,CDC）上；ACTT6有2 個(gè)拷貝，對其進(jìn)行敲除或者沉默可導(dǎo)致褐斑病菌無法合成ACT，同時(shí)喪失對感病葉片的致病力[6-7]。

前人關(guān)于柑橘對褐斑病菌的侵染或毒素響應(yīng)機(jī)制也有一些研究。SHISHIDO 等[8]應(yīng)用抑制消減雜交手段比較了對ACT 不敏感的粗檸檬（Citrus jambhiriLush.）對褐斑病菌產(chǎn)毒菌株和不產(chǎn)毒菌株的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)粗檸檬對產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的防御反應(yīng)比對不產(chǎn)毒菌株的更強(qiáng)烈；YAMASAKI 等[9]從粗檸檬中鑒定到一個(gè)定位于葉綠體的萜類合酶（terpene synthase, TPS）基因RlemTPS3，證實(shí)其可參與抗菌化合物單萜香葉醇的合成。針對不同褐斑病抗性的柑橘，接種褐斑病菌6 h 和12 h 的蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，相比感病品種，抗病品種有更多的差異表達(dá)蛋白顯著富集在解毒和免疫等生物過程中[10]。唐科志等[11]通過RNA 測序（RNA sequencing, RNA-Seq）解析了感病品種紅橘接種柑橘褐斑病菌28 h 后基因轉(zhuǎn)錄水平的變化和功能通路的富集，共鑒定出11 728 個(gè)差異表達(dá)基因（differentially expressed genes, DEGs），發(fā)現(xiàn)受病原菌誘導(dǎo)的基因多富集在植物防御反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor, TF）調(diào)控、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、活性氧清除等通路上，為柑橘響應(yīng)褐斑病的免疫反應(yīng)、功能基因表達(dá)及代謝通路等研究提供了一定的理論依據(jù)。但是，不同抗性品種對關(guān)鍵致病因子ACT 轉(zhuǎn)錄響應(yīng)機(jī)制是否相同及其與寄主對褐斑病抗性的關(guān)系，仍有待研究。為解決上述問題，本研究將產(chǎn)毒的野生型菌株和ACT合成受阻菌株（ΔΔACTT6雙敲除突變體）分別接種于抗褐斑病柑橘克里曼丁和感病柑橘丹西紅橘上，通過轉(zhuǎn)錄組手段分析比較ACT對抗病、感病柑橘基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，從而探討抗病、感病柑橘的防御響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，以期挖掘受ACT激活或抑制的防御關(guān)鍵基因和代謝通路，在分子水平上為改良柑橘對褐斑病的抗性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理

柑橘褐斑病菌野生型菌株Z7 由本實(shí)驗(yàn)室于2012 年自浙江省溫州市發(fā)病甌柑葉片上分離得到，保存于－80 ℃甘油中，其基因組已測序發(fā)表[12]。褐斑病菌毒素合成基因簇上ACTT6的2 個(gè)同源基因的雙敲除突變體菌株ΔΔACTT6由本實(shí)驗(yàn)室保存，通過高效液相色譜法（high performance liquid chromatography, HPLC）檢測確認(rèn)該突變體已喪失ACT合成能力[13]?？共∑贩N為克里曼丁（Citrus clementinaHort.ex Tan.cv.Clementine），感病品種為丹西紅橘（Citrus reticulataBlanco cv.Dancy），均盆栽于浙江大學(xué)紫金港校區(qū)設(shè)施溫室內(nèi)。

將野生型菌株Z7 和雙敲除突變體菌株ΔΔACTT6在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar, PDA）培養(yǎng)基平板上進(jìn)行活化，26 ℃培養(yǎng)4～5 d 后，拆開封口膜并倒置培養(yǎng)3～4 d，待其產(chǎn)生足夠孢子后在每個(gè)平板中加入適量無菌水，用滅菌過的三角棒輕輕刮擦菌落，過濾得到孢子懸浮液，然后使用血球計(jì)數(shù)板將孢子濃度稀釋為1×105mL－1。正常產(chǎn)毒菌株接種處理：將野生型菌株Z7 的孢子懸浮液均勻噴灑在大小和成熟度基本一致的克里曼丁和丹西紅橘離體葉片上，于保鮮盒內(nèi)保濕，置于26 ℃培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)孢子萌發(fā)侵染。不產(chǎn)毒菌株接種處理：按照上述實(shí)驗(yàn)步驟，將雙敲除突變體菌株ΔΔACTT6的孢子懸浮液進(jìn)行同樣的接種和培養(yǎng)。各處理組3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分別在接種24 h 和48 h后取樣。

1.2 RNA 提取和轉(zhuǎn)錄組測序

采用植物總RNA提取試劑盒（浙江易思得生物科技有限公司）提取柑橘樣品葉片RNA，并交由北京諾禾致源科技股份有限公司建庫測序，測序平臺(tái)為Illumina NovaSeq，讀長模式為雙端150 bp。轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)已上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），項(xiàng)目編號(hào)為PRJNA922240。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 原始序列質(zhì)控

為保證后續(xù)分析的可靠性，對RNA-Seq 的原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制。使用Trimmomatic[14]（v0.38）去除低質(zhì)量和帶有接頭的序列，使用Bowtie v1.3.0 比對rRNA 數(shù)據(jù)庫以去除核糖體rRNA 序列，得到高質(zhì)量讀長（clean reads）[15]，并用FastQC v0.11.9（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc）對過濾后的測序樣本進(jìn)行質(zhì)量檢測。

1.3.2 基因序列比對

將質(zhì)控后的數(shù)據(jù)用HISAT[16]（v2.1.0）比對至目前拼接質(zhì)量最高的柑橘基因組——甜橙參考基因組[17]上，并用HTSeq[18]（v0.11.3）對基因的表達(dá)進(jìn)行定量，通過Perl腳本計(jì)算基因的FPKM值。

1.3.3 差異表達(dá)基因計(jì)算

為鑒定柑橘對毒素的差異響應(yīng)基因，使用DESeq2[19]（v1.32.0）對不產(chǎn)毒的雙敲除突變體菌株處理樣品和產(chǎn)毒的野生型菌株處理樣品的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較，將表達(dá)差異在2 倍以上且校正后p值≤0.05的基因定義為顯著差異基因。其中，在野生型菌株處理樣品中表達(dá)顯著升高的基因?yàn)楫a(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)基因，在不產(chǎn)毒菌株處理樣品中表達(dá)顯著升高的基因?yàn)椴划a(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)基因。

1.3.4 基因功能注釋和富集分析

對甜橙基因組進(jìn)行功能注釋，使用DIAMOND[20]（v2.0.11.149）將參考基因序列在Swiss-Prot、TrEMBL和Araport11數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，預(yù)測基因功能和保守結(jié)構(gòu)域。用iTAK[21]（v1.7）預(yù)測全基因組轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和蛋白激酶。

使用Blast2GO[22]（Omicsbox v2.0.36）和Blast-KOALA[23]將甜橙參考基因組比對到基因本體（gene ontology, GO）及京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）中進(jìn)行注釋，并分別采用GOATOOLS[24]（v1.1.6）和Cluster-Profiler 4.0[25]進(jìn)行基因數(shù)據(jù)集的GO 功能和KEGG通路的富集分析[錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate）≤0.05]。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果，隨機(jī)選取6 個(gè)差異表達(dá)基因（表1）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）擴(kuò)增，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的可靠性。

表1 用于qRT-PCR驗(yàn)證的基因及引物序列Table 1 Genes and primer sequences for qRT-PCR

使用Primer3Plus設(shè)計(jì)基因特異性引物（相關(guān)信息如表1所示），并利用瓊脂糖凝膠電泳和qRT-PCR熔解曲線驗(yàn)證引物特異性。qRT-PCR 反應(yīng)體系：SYBR Green Ⅰ qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）10 μL，上、下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），模板cDNA 1 μL，使用ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3 次，使用肌動(dòng)蛋白（actin）基因作為內(nèi)參基因。采用2－ΔΔCT法計(jì)算基因的相對表達(dá)量和表達(dá)變化倍數(shù)（經(jīng)log2轉(zhuǎn)換）。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種觀察

使用野生型菌株Z7 的孢子懸浮液（濃度為1×105mL－1）或相同濃度的雙敲除突變體菌株ΔΔACTT6的孢子懸浮液噴霧接種抗病品種克里曼丁和感病品種丹西紅橘的離體葉片，保濕，分別在接種24 h 和48 h 后取樣觀察。結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)：抗病品種克里曼丁在接種菌株Z7和ΔΔACTT6實(shí)驗(yàn)中均未表現(xiàn)出癥狀；感病品種丹西紅橘在接種野生型菌株24 h后出現(xiàn)了零星的褐色病斑，在接種48 h后出現(xiàn)了明顯的黑褐色點(diǎn)狀病斑；而接種ΔΔACTT6的丹西紅橘葉片在24 h和48 h均沒有癥狀出現(xiàn)，證實(shí)該突變體已喪失致病力。

圖1 抗病柑橘克里曼丁和感病柑橘丹西紅橘葉片接種后的癥狀表現(xiàn)Fig.1 Symptoms on Clementine (resistant) and Dancy (susceptible) leaves after inoculation

2.2 測序數(shù)據(jù)結(jié)果

測序的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾質(zhì)控后，各轉(zhuǎn)錄組文庫的高質(zhì)量讀長都占原有測序產(chǎn)生的原始讀長（raw reads）的90%以上（附表1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2022.12.221）。將高質(zhì)量讀長與甜橙參考基因組進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，平均有97.32%的RNA-Seq 序列被成功比對上，說明測序結(jié)果較好，可用于后續(xù)分析。此外，總計(jì)有23 581 個(gè)基因在樣品中被檢測到轉(zhuǎn)錄，占參考基因組總數(shù)的78.93%。根據(jù)主成分分析結(jié)果（附圖1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2022.12.221），不同品種在第一主成分（principal component 1, PC1）軸上可以區(qū)分開，在第二主成分（PC2）軸上可以區(qū)分2 組菌株接種情況，表明實(shí)驗(yàn)接種成功且生物學(xué)重復(fù)性高。

2.3 差異表達(dá)基因

通過比較柑橘葉片在接種產(chǎn)毒和不產(chǎn)毒菌株后的基因表達(dá)情況，分別計(jì)算抗病和感病品種中的差異表達(dá)基因（DEGs）。將不同實(shí)驗(yàn)組所包含的DEGs 數(shù)目和不同實(shí)驗(yàn)組間產(chǎn)生交集的DEGs 數(shù)目繪制成UpsetR 圖。結(jié)果（圖2）表明：接種24 h 后，在克里曼丁中檢測到190 個(gè)產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)的DEGs，132 個(gè)不產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)的DEGs；在丹西紅橘中檢測到1 298 個(gè)產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)的DEGs，683 個(gè)不產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)的DEGs。接種48 h 后，在克里曼丁中檢測到595 個(gè)產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)的DEGs，1 263 個(gè)不產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)的DEGs；在丹西紅橘中檢測到3 555個(gè)產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)的DEGs，4 343個(gè)不產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)的DEGs。隨著侵染時(shí)間的延長，柑橘對2種菌株的響應(yīng)差異增大，大量基因被產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)，且在感病品種中更明顯。在所有DEGs 數(shù)據(jù)集中，有1 636 個(gè)DEGs 在克里曼丁和丹西紅橘中都能被檢測到，有307 個(gè)DEGs 僅在克里曼丁中被檢測到，有6 637個(gè)DEGs僅在丹西紅橘中被檢測到。

圖2 不同處理組間差異表達(dá)基因（DEGs）比較Fig.2 Comparisons of DEGs among different treatment groups

2.4 GO 功能富集分析

使用GO 富集分析比較2 個(gè)柑橘品種對產(chǎn)毒和不產(chǎn)毒菌株的整體轉(zhuǎn)錄響應(yīng)模式，結(jié)果如圖3所示。

圖3 差異表達(dá)基因的GO富集Fig.3 GO enrichment of DEGs

在接種早期（24 h），抗病品種克里曼丁顯著富集到的GO 較少，且都是受產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)的基因，主要富集了α-氨基酸代謝、羧酸代謝等GO；在接種后期（48 h），克里曼丁受產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)的基因顯著富集在與植物防御反應(yīng)相關(guān)的GO 中，包含外來異質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、茉莉酸代謝過程、穿膜運(yùn)輸異質(zhì)解毒等，受不產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)的基因顯著富集在光合電子傳遞鏈、光刺激反應(yīng)等GO中。

在接種早期（24 h），感病品種丹西紅橘富集的GO 主要涉及代謝調(diào)控的生物過程，其中受產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)的基因顯著富集在芳香族氨基酸代謝、α-氨基酸代謝、含氧酸代謝等GO中，受不產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)的基因主要富集在含氮化合物代謝過程調(diào)控、初級代謝過程調(diào)控等GO 中；在接種后期（48 h），與病原物互作過程中，丹西紅橘受產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)的基因顯著富集在三羧酸循環(huán)等生物過程中，受不產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)的基因顯著富集在光合作用、轉(zhuǎn)移酶活性調(diào)控等生物過程中。

GO富集結(jié)果顯示，在病原真菌互作后期，相較于不產(chǎn)毒菌株處理，與光合作用相關(guān)的基因在產(chǎn)毒菌株處理組中表達(dá)受到抑制，這一結(jié)果與之前的研究相符，即植物在遭受生物脅迫時(shí)參與光合作用的相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)[26]。在毒素存在時(shí)，克里曼丁主要顯著富集了與細(xì)胞解毒生物過程相關(guān)的GO，丹西紅橘則顯著富集了很多與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等大分子降解生物過程相關(guān)的GO；同時(shí)，茉莉酸代謝過程在克里曼丁受產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)基因中也檢測到了顯著富集，推測茉莉酸激素信號(hào)通路是侵染后期主要的抗病信號(hào)途徑。另外，有5個(gè)GO在接種產(chǎn)毒菌株48 h后的克里曼丁中均顯著富集，涉及穿膜運(yùn)輸異質(zhì)的生物過程，且相關(guān)基因受到誘導(dǎo)表達(dá)的趨勢不同，說明轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能在柑橘防御褐斑病菌毒素反應(yīng)中起著重要作用。

2.5 KEGG 通路富集分析

接種早期（24 h），克里曼丁僅在產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)的基因中出現(xiàn)了顯著富集的代謝通路，與脅迫相關(guān)的通路為植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信號(hào)通路；接種后期（48 h），克里曼丁受產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)正調(diào)控表達(dá)的基因只富集了1 個(gè)KEGG 通路，即氨基糖和核苷酸糖代謝，受不產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)的基因顯著富集了光合作用、光合作用-天線蛋白等通路（表2）。

表2 差異表達(dá)基因的KEGG通路富集Table 2 KEGG pathway enrichment of DEGs

丹西紅橘在與病原真菌互作中，接種早期和后期均受產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)的基因共顯著富集了9個(gè)KEGG通路，主要有硫代葡萄糖苷生物合成、谷胱甘肽代謝、苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸生物合成、植物MAPK 信號(hào)通路等；有13 個(gè)通路僅在丹西紅橘接種后期受產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)基因富集，最顯著的通路是三羧酸循環(huán)。丹西紅橘接種不產(chǎn)毒菌株后誘導(dǎo)表達(dá)的基因在早期和后期有2 個(gè)通路均被檢測到顯著富集，其中：植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)這一代謝通路相關(guān)基因的表達(dá)趨勢與克里曼丁在接種早期相反，丹西紅橘包含一些激素代謝相關(guān)基因，如乙烯響應(yīng)因子、茉莉酸鋅指花序分生組織結(jié)構(gòu)域蛋白[jasmonate zinc-finger-inflorescence meristem (ZIM)domain, JAZ]等基因的差異表達(dá)；另一個(gè)顯著富集的代謝通路為光合作用-天線蛋白，與在克里曼丁中的表達(dá)趨勢一致。

2.6 柑橘對褐斑病產(chǎn)毒菌株和不產(chǎn)毒菌株響應(yīng)的差異

2.6.1 先天免疫反應(yīng)

當(dāng)植物感知到病原菌入侵時(shí)，會(huì)啟動(dòng)一系列的防御反應(yīng)。植物通過細(xì)胞質(zhì)膜上的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors, PRRs）識(shí)別病原物/微生物相關(guān)分子模式（pathogen/microbe-associated molecular patterns, PAMPs/MAMPs）激活一系列的基礎(chǔ)免疫反應(yīng)，如PAMPs觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMPstriggered immunity, PTI）[27]，即初級防御反應(yīng)。圖4顯示了初級防御反應(yīng)中的差異表達(dá)基因。在數(shù)據(jù)集中，有6 個(gè)被注釋為受體樣蛋白激酶的DEGs，包括幾丁質(zhì)激發(fā)子受體激酶1（chitin elicitor receptor kinase 1, CERK1）和細(xì)胞壁相關(guān)的類受體激酶（wall-associated kinase, WAK），均表現(xiàn)為產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)，其中2個(gè)DEGs在克里曼丁接種野生型菌株48 h 后顯著上調(diào)表達(dá)，而全部DEGs 在丹西紅橘接種野生型菌株48 h后均顯著正調(diào)控表達(dá)。

植物還會(huì)通過核苷酸結(jié)合域和富含亮氨酸重復(fù)序列蛋白（nucleotide-binding domain and leucinerich repeat proteins, NLRs）與病原物效應(yīng)子互作激活特異性次級免疫反應(yīng)——效應(yīng)子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（effector-triggered immunity, ETI），即次級防御反應(yīng)。在數(shù)據(jù)集（圖4）中，檢測到51 個(gè)屬于NLRs 家族的DEGs，其中克里曼丁接種菌株24 h 后均無差異表達(dá)，接種48 h后檢測到6個(gè)DEGs；有9個(gè)DEGs在丹西紅橘接種菌株24 h 后差異表達(dá)，而大多數(shù)NLRs家族基因在丹西紅橘接種48 h后出現(xiàn)差異表達(dá)（43 個(gè)DEGs），其中22 個(gè)基因受不產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)，21 個(gè)基因受產(chǎn)毒菌株顯著誘導(dǎo)表達(dá)，這43 個(gè)DEGs 中受產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)變化最大的是Cs5g020260基因（5.5倍），編碼腺苷二磷酸-核糖基環(huán)化酶。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，與植物防御反應(yīng)相關(guān)的受體蛋白被病原菌激活，觸發(fā)了PTI與ETI。

2.6.2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

轉(zhuǎn)錄因子參與基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控和各類上下游信號(hào)通路中信號(hào)分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在植物的生長發(fā)育、免疫防御等方面起著重要的作用。本研究選擇在參與植物應(yīng)答死體營養(yǎng)型真菌免疫反應(yīng)中最有代表性的高等植物特有轉(zhuǎn)錄因子WRKY 家族進(jìn)行分析。在數(shù)據(jù)集（圖4）中，共鑒定到16個(gè)屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的DEGs。丹西紅橘接種產(chǎn)毒菌株48 h后，這些DEGs均被顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；WRKY75轉(zhuǎn)錄因子基因（Cs2g024430）作為表達(dá)倍數(shù)變化最顯著的基因，相比不產(chǎn)毒菌株處理組，在丹西紅橘接種產(chǎn)毒菌株24 h 后表達(dá)上調(diào)了9.7 倍，在48 h 后表達(dá)上調(diào)了7.6倍?？死锫〗臃N菌株24 h后大多數(shù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因無差異表達(dá)，唯一響應(yīng)產(chǎn)毒菌株顯著正調(diào)控表達(dá)的是WRKY72 轉(zhuǎn)錄因子基因（Cs7g025980）；相比不產(chǎn)毒菌株處理組，克里曼丁接種產(chǎn)毒菌株48 h 后有7 個(gè)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子基因被顯著誘導(dǎo)表達(dá)。

2.6.3 病程相關(guān)蛋白

當(dāng)植物處于脅迫環(huán)境中時(shí)，有一類蛋白會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)并在植物體內(nèi)積累，參與植物的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性以抵御病原物侵染，被稱為病程相關(guān)蛋白（pathogensis-related proteins, PRs）[28]。在數(shù)據(jù)集（圖4）中，共檢測到10個(gè)屬于PRs家族的DEGs。丹西紅橘在接種24 h后檢測到5個(gè)由產(chǎn)毒菌株顯著誘導(dǎo)表達(dá)的DEGs，在接種48 h后全部DEGs被產(chǎn)毒菌株強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，在2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)最顯著的基因被預(yù)測為PR-4基因（Cs8g010240），相比不產(chǎn)毒菌株處理組其表達(dá)量均上調(diào)了5 倍以上。PR-4是一種抗真菌活性蛋白，說明丹西紅橘接種褐斑病菌野生型產(chǎn)毒菌株后顯著激活了PRs的表達(dá)，而在接種不產(chǎn)毒雙敲除突變體菌株后其表達(dá)下調(diào)。克里曼丁接種產(chǎn)毒菌株24 h后，相比不產(chǎn)毒菌株處理組，只檢測到1個(gè)PR-4基因（Cs8g010220）顯著上調(diào)表達(dá)；接種48 h后，檢測到4個(gè)受產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)的PRs基因，同樣，表達(dá)倍數(shù)變化最大的仍是PR-4基因。

2.6.4 植物激素

植物響應(yīng)死體營養(yǎng)型病原真菌的防御主要依賴茉莉酸（jasmonic acid, JA）和乙烯介導(dǎo)的信號(hào)通路[29]。在數(shù)據(jù)集（圖4）中，與植物激素代謝途徑相關(guān)的GO富集包含了茉莉酸代謝通路和赤霉素代謝通路。丹西紅橘差異表達(dá)基因顯著富集了α-亞麻酸代謝，而α-亞麻酸是一種多元不飽和脂肪酸，可作為茉莉酸合成的前體物質(zhì)。在接種菌株48 h后，在克里曼丁和丹西紅橘中有8 個(gè)DEGs 均富集到了茉莉酸代謝通路上，并響應(yīng)產(chǎn)毒菌株正調(diào)控表達(dá)，它們都編碼甲基酯酶（methyl esterase, MES），具有催化茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）生成JA 的功能。相比不產(chǎn)毒菌株處理組，2個(gè)DEGs在克里曼丁接種產(chǎn)毒菌株24 h后顯著上調(diào)表達(dá)，5個(gè)DEGs在接種產(chǎn)毒菌株48 h后顯著上調(diào)表達(dá)；3個(gè)DEGs在丹西紅橘接種產(chǎn)毒菌株24 h后顯著上調(diào)表達(dá)，8個(gè)DEGs在接種產(chǎn)毒菌株48 h 后顯著上調(diào)表達(dá)，其中FPKM值變化最顯著的由Cs1g025560 基因編碼的MES1同源蛋白參與了茉莉酸、水楊酸代謝等生物過程。

2.6.5 次生代謝

在植物響應(yīng)病原物防御的過程中，次生代謝也起到了重要的作用。次生代謝產(chǎn)物可分為酚類、萜類和含氮化合物類。丹西紅橘在接種24 h 和48 h后均檢測到被產(chǎn)毒菌株強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)的DEGs，分別參與硫代葡萄糖苷生物合成、苯丙素類化合物生物合成，以及與莽草酸途徑相關(guān)的芳香族氨基酸苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸生物合成。木質(zhì)素生物合成途徑中的首個(gè)關(guān)鍵酶為苯丙氨酸氨裂合酶（phenylalanine ammonia-lyase, PAL），有4 個(gè)編碼該酶蛋白的DEGs在克里曼丁和丹西紅橘中均表現(xiàn)為被產(chǎn)毒菌株顯著誘導(dǎo)表達(dá)；4-香豆酸-輔酶A 連接酶（4-coumarate-CoA ligase, 4CL）為苯丙素代謝途徑中最后一個(gè)關(guān)鍵酶，有10個(gè)DEGs編碼4CL，主要在丹西紅橘接種病原菌48 h 后表現(xiàn)出不同程度的差異表達(dá)（圖4）。木質(zhì)素作為植物細(xì)胞骨架的主要成分之一，可以增強(qiáng)細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度，抵御各種生物脅迫和非生物脅迫。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明，受到病原菌侵染后，植物的木質(zhì)素合成相關(guān)基因表達(dá)量上升，有利于積累木質(zhì)素來增強(qiáng)植物的抗病性。

與萜類合成途徑相關(guān)的大部分基因如萜類合酶（TPS）基因在不同處理組中也呈現(xiàn)差異表達(dá)。在克里曼丁接種后期檢測到5個(gè)編碼TPS的DEGs，其中1個(gè)受產(chǎn)毒菌株顯著誘導(dǎo)表達(dá)（4倍以上）；在丹西紅橘接種早期檢測到6 個(gè)DEGs 受產(chǎn)毒菌株顯著誘導(dǎo)表達(dá)，在接種后期有5個(gè)DEGs受產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)，6 個(gè)DEGs 受不產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)。這些DEGs可能參與了柑橘和褐斑病菌的互作。

2.6.6 植物解毒蛋白

在GO 富集結(jié)果中，克里曼丁接種48 h 后顯著富集了外來異質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等5個(gè)共有GO，涉及多藥及毒素化合物外排蛋白（multidrug and toxic compound extrusion protein, MATE）基因的顯著差異表達(dá)。MATE作為一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有運(yùn)輸次生代謝產(chǎn)物、陽離子化合物、毒素化合物的功能，能夠維持植物的生理生化穩(wěn)態(tài)[30]。

基于以上GO 富集結(jié)果和MATE 的功能，本研究掃描了甜橙基因組中的MATE 家族基因，發(fā)現(xiàn)共35個(gè)被預(yù)測為MATE家族基因的DEGs轉(zhuǎn)錄表達(dá)有顯著變化，受產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)的趨勢大于受不產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)的趨勢（圖4）。丹西紅橘接種48 h后的基因表達(dá)模式仍然是變化最顯著的，有29 個(gè)MATE基因差異表達(dá)，而克里曼丁接種24 h 后只有4 個(gè)MATE基因差異表達(dá)。其中，Cs5g040590 基因編碼解毒蛋白，相較于不產(chǎn)毒菌株處理組，在抗、感品種的2個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理組中受產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)后其表達(dá)倍數(shù)變化值均最大，在丹西紅橘接種48 h后更是響應(yīng)產(chǎn)毒菌株上調(diào)表達(dá)了8倍以上。這表明柑橘對褐斑病菌毒素的響應(yīng)顯著激活了MATE 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。

在這些DEGs 中，Cs7g016240 基因在抗病品種克里曼丁接種48 h后被產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)；而在感病品種丹西紅橘接種48 h 后受不產(chǎn)毒菌株誘導(dǎo)表達(dá)，即產(chǎn)毒菌株處理抑制了該基因的表達(dá)。推測該基因參與了柑橘對褐斑病的抗病調(diào)控。

2.7 qRT-PCR 驗(yàn)證

在轉(zhuǎn)錄響應(yīng)更強(qiáng)烈的感病品種中進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。隨機(jī)挑選6 個(gè)基因（包含了編碼病程相關(guān)蛋白、幾丁質(zhì)酶和果膠酯酶抑制劑等基因），通過qRTPCR 驗(yàn)證數(shù)據(jù)的可靠性和真實(shí)性。結(jié)果（圖5）顯示，供試基因的相對表達(dá)倍數(shù)變化與轉(zhuǎn)錄組測序表達(dá)趨勢基本一致。

圖5 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證Fig.5 Verification of DEGs by qRT-PCR

3 討論

柑橘鏈格孢毒素（ACT）作為柑橘褐斑病菌重要的致病因子，破壞感病植物細(xì)胞質(zhì)膜，造成胞內(nèi)鉀離子外流，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。對ACTT6進(jìn)行雙拷貝敲除可使其不產(chǎn)毒且不致病，相比于可以正常產(chǎn)毒和致病的野生型菌株，本實(shí)驗(yàn)所用ΔΔACTT6突變體菌株未被檢測到ACT產(chǎn)生[13]，并且無傷接種感病品種丹西紅橘葉片后也沒有病斑產(chǎn)生。

褐斑病菌作為典型的死體營養(yǎng)型病原真菌，通過分泌寄主?；远舅貧⑺兰?xì)胞和組織，并從死亡的細(xì)胞中獲得養(yǎng)分來實(shí)現(xiàn)侵染和定植。相應(yīng)地，植物激活免疫反應(yīng)來抑制病原菌的發(fā)展，這涉及復(fù)雜的生理生化反應(yīng)和分子水平的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。死體營養(yǎng)型病原真菌入侵后激活了植物的免疫反應(yīng)[31]，無論是抗病品種克里曼丁還是感病品種丹西紅橘，都通過模式識(shí)別受體（PRRs）識(shí)別柑橘褐斑病菌分泌的幾丁質(zhì)等保守物質(zhì)來激活PTI，在接種后期，有大量的抗病基因在植物與病原菌互作過程中被誘導(dǎo)表達(dá)?？死锫≡诮臃N后期顯著富集了茉莉酸代謝通路，多個(gè)參與該通路的基因顯著響應(yīng)產(chǎn)毒菌株表達(dá)，表明植物受到鏈格孢菌橘致病型侵染后，茉莉酸激素信號(hào)通路被激活，進(jìn)而激活了下游的防御基因表達(dá)。楊樹接種鏈格孢菌后，與茉莉酸（JA）生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的DEGs 被持續(xù)激活，通過過表達(dá)脂氧合酶基因PdbLOX2增強(qiáng)了楊樹對鏈格孢菌的抗性[32]。同時(shí)，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子作為正調(diào)控或者負(fù)調(diào)控因子，在不同水平參與調(diào)節(jié)植物防御基因的表達(dá)，在本研究中多個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子被證實(shí)參與調(diào)節(jié)JA介導(dǎo)的反應(yīng)。在菊花中，構(gòu)建過表達(dá)WRKY33基因植株增強(qiáng)了對鏈格孢菌的敏感性[33]。在擬南芥中，WRKY75可以與ORA59啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合來直接調(diào)節(jié)其表達(dá)，還可以與JAZ 8 蛋白互作來抑制其表達(dá)，過表達(dá)WKY75可增強(qiáng)JA 介導(dǎo)的響應(yīng)和下游防御基因PDF1.2的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)擬南芥對灰霉菌和蕓薹生鏈格孢（Alternaria brassicicola）的抗性[34]。在本研究中，受野生型褐斑病菌脅迫，克里曼丁和丹西紅橘激活了WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，某些在丹西紅橘中受產(chǎn)毒菌株顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)而在克里曼丁產(chǎn)毒菌株處理組中穩(wěn)定表達(dá)的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可以作為候選的柑橘褐斑病抗性負(fù)調(diào)控因子。

多個(gè)基因編碼的PRs受褐斑病菌誘導(dǎo)后被激活表達(dá)，包括PR-4 等具有幾丁質(zhì)結(jié)合域的抗真菌活性蛋白。菊花葉片被鏈格孢菌侵染后激活了PR-3類蛋白的表達(dá)[33]，蘋果被鏈格孢菌蘋果致病型侵染后的轉(zhuǎn)錄組分析也表明多個(gè)PRs 轉(zhuǎn)錄調(diào)控被激活[35]。以上研究表明，PRs 在應(yīng)對病菌脅迫方面起著重要的作用。

植物次生代謝類物質(zhì)也積極參與對鏈格孢菌的防御響應(yīng)。煙草接種鏈格孢菌煙草致病型后會(huì)在侵染點(diǎn)積累大量的香豆素類植保素和倍半萜類植保素[36-37]。本研究的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，柑橘接種鏈格孢菌橘致病型后在苯丙素類化合物生物合成和硫代葡萄糖苷生物合成途徑中出現(xiàn)了大量的差異表達(dá)基因，這些次生代謝產(chǎn)物受野生型病原菌誘導(dǎo)合成，參與了寄主的免疫調(diào)控。

MATE 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白廣泛分布于所有生物體中，植物中的MATE 家族基因有著多種生物學(xué)功能，比如次生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)、異質(zhì)解毒、激素轉(zhuǎn)運(yùn)等，參與調(diào)控植物對生物和非生物脅迫的響應(yīng)[38]。擬南芥中AtDTX1 蛋白可作為植物源性生物堿、抗生素和其他有毒化合物的外排載體[39]。在菊花接種鏈格孢菌后期（24 h或36 h），鑒定到2個(gè)MATE基因顯著上調(diào)表達(dá)，推測在侵染后期，菊花通過表達(dá)MATE基因抵御鏈格孢菌，減少寄主特異性毒素的產(chǎn)生[33]。在本研究中檢測到多個(gè)編碼MATE 蛋白的差異表達(dá)基因，接種后期，克里曼丁受產(chǎn)毒菌株顯著誘導(dǎo)表達(dá)的MATE基因有11個(gè)，丹西紅橘顯著響應(yīng)產(chǎn)毒菌株表達(dá)的MATE基因有15 個(gè)?；谝陨辖Y(jié)果，推測MATE基因在柑橘中參與了褐斑病菌的毒素外排過程，且在克里曼丁中存在與褐斑病抗性相關(guān)的特異性毒素誘導(dǎo)的MATE基因。

4 結(jié)論

本研究選擇克里曼丁和丹西紅橘2種抗、感褐斑病柑橘，以離體葉片接種柑橘褐斑病菌毒素合成受阻雙敲除突變體菌株ΔΔACTT6和野生型產(chǎn)毒菌株Z7，通過RNA-Seq解析了抗、感柑橘葉片在接種早期和后期對褐斑病菌產(chǎn)毒和不產(chǎn)毒菌株侵染的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)差異。結(jié)果表明，接種后期比前期擁有更多的差異表達(dá)基因，且丹西紅橘對病原菌的響應(yīng)更強(qiáng)烈。產(chǎn)毒菌株在抗、感柑橘品種中均能抑制植物的部分生長發(fā)育及代謝活動(dòng)，同時(shí)，也可激活2種柑橘中的防御相關(guān)基因，包含了次生代謝、免疫反應(yīng)、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等，涉及WRKY轉(zhuǎn)錄因子和萜類合酶等基因的表達(dá)。在產(chǎn)毒菌株接種后期，丹西紅橘富集了脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等大分子降解過程，說明感病植株不能抵御毒素，從而導(dǎo)致細(xì)胞完整性遭到破壞；而克里曼丁則主要富集了異質(zhì)解毒和茉莉酸代謝等生物過程，其中抗性柑橘特異激活表達(dá)的MATE基因可能與其抵御褐斑病菌毒素的能力相關(guān)。

致謝感謝浙江省柑橘研究所柯甫志副研究員提供克里曼丁和丹西紅橘材料！