潘義宏,周芳芳,黃 坤,冀新威,單雙呂,張曉龍,張加研

(1.西南林業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院,昆明 650224;2.云南五佳生物科技有限公司,昆明 650106;3.云南省煙草公司紅河州公司,云南 彌勒 652300)

【研究意義】烤煙是中國重要的經(jīng)濟作物之一,也是農(nóng)民增收的特色作物之一[1]?？緹熓羌蛇B作作物,但由于耕地資源、交通條件和經(jīng)濟效益的限制,導(dǎo)致部分煙區(qū)輪作、休耕等耕作模式難以實現(xiàn),連作現(xiàn)象一直存在。研究連作烤煙根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物與烤煙品質(zhì)間的關(guān)系,明確根系關(guān)鍵次生代謝產(chǎn)物,可為烤煙連作障礙的消減提供新思路?！厩叭搜芯窟M展】研究發(fā)現(xiàn),烤煙連作通常會導(dǎo)致土壤養(yǎng)分失衡[2]、土壤生態(tài)環(huán)境失衡[3]、土傳病害加重[4]、烤煙產(chǎn)量和質(zhì)量下降[5],造成連作障礙。連作障礙已成為制約煙農(nóng)收入和煙草產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素?；形镔|(zhì)被認為是植物中的次生代謝物[6],連作導(dǎo)致這些物質(zhì)在植物根際土壤或根系內(nèi)累積,對植物造成毒害作用[7]?；形镔|(zhì)進入土壤主要是通過植物根系分泌,根系分泌物中含有大量具有化感活性的物質(zhì),會對植物造成影響[8]。目前,針對烤煙根際土壤化感物質(zhì)對土壤的影響開展了大量研究,如對根際土壤理化性質(zhì)[2]、土壤微生物[9]、土壤酶活性[10]等的影響,但對于連作烤煙根系內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物與烤煙品質(zhì)的相關(guān)性研究關(guān)注度不夠,鮮見相關(guān)報道?！颈狙芯壳腥朦c】對連作烤煙根系內(nèi)確定出的14種次生代謝產(chǎn)物進行因子分析,并對烤煙品質(zhì)(外觀質(zhì)量、物理特性、常規(guī)化學(xué)成分、感官質(zhì)量)進行典型相關(guān)分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探究連作條件下烤煙根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物積累情況及其對烤煙品質(zhì)的綜合影響,明確影響烤煙品質(zhì)的根系內(nèi)關(guān)鍵次生代謝產(chǎn)物,以期揭示根系內(nèi)關(guān)鍵次生代謝產(chǎn)物在連作障礙中所起的作用,為連作烤煙品質(zhì)的改善提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗條件

試驗于2019年在瀘西縣白水鎮(zhèn)大孟澤村開展,供試烤煙品種為云煙87。試驗地點土壤類型為紅壤。于該試驗地點連片地塊選取烤煙連作2年、3年、4年、5年的地塊?？緹熐安鐬槎e處理?？緹熃y(tǒng)一采取漂浮育苗、膜下小苗移栽(4月18日統(tǒng)一移栽)的方式。

不同連作年限處理烤煙按純氮105 kg/hm2進行施肥,其中商品有機肥占比30%,煙草專用復(fù)合肥[m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=12∶8∶25]占比70%?？緹熞圃詴r,按30%有機肥和50%煙草專用復(fù)合肥進行塘施,烤煙移栽后第20天將剩下的20%煙草專用復(fù)合肥用水稀釋澆施追肥,移栽后第30天澆施K2SO4(K2O≥52%)150 kg/hm2。各處理烤煙成熟后進行掛牌烘烤,烤煙其他管理措施按照瀘西縣煙草分公司生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范統(tǒng)一操作。

1.2 烤煙根系樣品采集及次生代謝產(chǎn)物分析

于烤煙封頂后第7天進行烤煙根系樣品采集,每個處理地塊選取長勢相近且能代表該處理80%煙株長勢的9株煙株(每3株根系混合成一個樣品),合計36株。將烤煙根系挖出、洗凈后于干燥箱中40 ℃烘干至恒重,并研磨過100目篩,混勻密封保存。

稱取5.00 g樣品加濃度為0.194 mg/mL的丙酸苯乙酯內(nèi)標工作液1.0 mL,加入20.0 mL的混合溶液[v(二氯甲烷)∶v(乙酸乙酯)∶v(甲醇)=(1∶1∶1)],室溫下浸泡24 h,于3000 r/min離心10 min,取上清液過濾至帶1.0 mL尾管的濃縮瓶中,并于50 ℃抽真空濃縮至1.0 mL。再經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾,棄去前0.5 mL濾液,濾入進樣瓶中,待上機檢測。使用氣質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent 6890-5973N)分析樣品,并采用SIM(Selected Ion Monitoring)模式質(zhì)譜定性、內(nèi)標法定量分析根系內(nèi)14種次生代謝產(chǎn)物[11]。儀器分析條件參數(shù)設(shè)定參考潘義宏等[12]的方法。

1.3 初烤煙葉樣品采集及品質(zhì)分析

按照國標GB 2635—1992,煙葉烤后進行分級,并分別選取C3F和B2F煙葉各3.0 kg用于品質(zhì)指標的檢測分析。分析項目包括煙葉常規(guī)化學(xué)成分(總植物堿、鉀離子、總氮、總糖、還原糖、氯離子)、外觀質(zhì)量(煙葉的成熟度、色度、顏色、油分、身份、組織結(jié)構(gòu))、物理特性(煙葉平衡含水率、抗張力、含梗率、厚度和葉面密度)和感官質(zhì)量(煙氣的香氣量、香氣質(zhì)、雜氣、灰色、燃燒性、刺激性、余味、濃度和勁頭),檢測方法參照李柘錦等[13]的方法進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

烤煙外觀質(zhì)量、物理特性和感官質(zhì)量等品質(zhì)因子均采用賦值權(quán)重指數(shù)法進行評價[14]?？緹煶Ｒ?guī)化學(xué)成分因子采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)進行評價[13],將上述烤煙4種品質(zhì)指標進行賦值權(quán)重指數(shù)法或模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)評價得出綜合指數(shù)后,分別與烤煙根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物各因子進行典型相關(guān)分析。因子分析和典型相關(guān)分析使用SPSS 22.0軟件,顯著性水平P值取0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 烤煙根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物自相關(guān)分析

連作烤煙根系內(nèi)共鑒定出14種次生代謝產(chǎn)物,涵蓋酯、酸、酰胺、醛、酚5大類,其中以酸類物質(zhì)種類最多。具體包括苯甲酸、軟脂酸、花生酸、亞麻酸、香草醛、鄰苯二甲酸二辛酯、莨菪亭、肉豆蔻酸、棕櫚酸甲酯、十七酸、硬脂酸、亞油酸、2,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、芥酸酰胺。

根系內(nèi)14種次生代謝產(chǎn)物的自相關(guān)分析結(jié)果(表1)顯示,莨菪亭和肉豆蔻酸、軟脂酸,亞麻酸和亞油酸,花生酸和軟脂酸、硬脂酸、亞麻酸、亞油酸,鄰苯二甲酸二辛酯和香草醛之間呈極顯著相關(guān)(r>0.8,P<0.01)。

表1 烤煙根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物自相關(guān)系數(shù)Table 1 Autocorrelation coefficient of secondary metabolites in flue-cured tobacco roots

2.2 烤煙根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物因子分析

巴特利特球形度檢驗結(jié)果顯示,根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物含量顯著性P值遠小于0.01,KMO值為0.583,可進一步做因子分析。采用主成分分析法,提取特征根大于1的因子,并采用正態(tài)化斜交法進行旋轉(zhuǎn),對烤煙根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物進行因子分析。如表2所示,分析提取到的4個主要因子的累計貢獻率為85.74%,對4個主成分因子的方差貢獻率分別為33.46%、18.80%、17.60%和15.87%。

表2 提取因子特征值、方差貢獻率、累計貢獻率Table 2 Eigenvalue, variance contribution rate and cumulative contribution rate of extract factor

因子載荷能夠評估根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物與因子間的關(guān)聯(lián)度。如表3～4所示,第一因子在變量總方差中的貢獻率為33.46%,軟脂酸、花生酸和莨菪亭具有較高正載荷,且三者間存在正相關(guān)。肉豆蔻酸具有較大負載荷,與第一因子呈負相關(guān),依據(jù)該因子中物質(zhì)組成,將其命名為酚酸類因子。其表達式為:F1=+0.194軟脂酸-0.260肉豆蔻酸+0.142花生酸+0.130亞麻酸+0.303莨菪亭+0.0642,2’-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)+0.007芥酸酰胺-0.037苯甲酸- 0.191棕櫚酸甲酯- 0.049十七酸- 0.098鄰苯二甲酸二辛酯+0.057硬脂酸+0.144亞油酸- 0.017香草醛。

表3 4個主成分因子載荷矩陣Table 3 Load matrix for four principal component factor

表4 4個主成分因子得分系數(shù)矩陣Table 4 Factor scores for four principal component factors

第二因子在變量總方差中的貢獻率為18.81%,依據(jù)該因子中物質(zhì)組成,將其命名為醛酯類因子。其表達式為:F2=0.136亞麻酸+0.285芥酸酰胺+0.330香草醛- 0.0532,2’-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)- 0.109亞油酸+0.167苯甲酸- 0.400鄰苯二甲酸二辛酯+0.020軟脂酸+0.050棕櫚酸甲酯+0.005硬脂酸- 0.080肉豆蔻酸- 0.056十七酸- 0.010花生酸- 0.033莨菪亭。

對于第三因子,其對變量總方差的貢獻率為17.60%,依據(jù)該因子中物質(zhì)組成,將其命名為酸酯類因子。其表達式為:F3=0.1492,2’-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)+0.246硬脂酸- 0.231莨菪亭+0.578棕櫚酸甲酯+0.326十七酸+0.204肉豆蔻酸+0.104花生酸+0.037香草醛- 0.096芥酸酰胺+0.040亞麻酸+0.030軟脂酸- 0.103苯甲酸+0.0048鄰苯二甲酸二辛酯- 0.032亞油酸。

最后,對于第四因子,其對變量總方差的貢獻率為15.87%,依據(jù)該因子中物質(zhì)組成,將其命名為酚類因子。表達式為:F4=0.133肉豆蔻酸- 0.4922,2’-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)+0.245芥酸酰胺+0.129亞麻酸+0.369苯甲酸- 0.195棕櫚酸甲酯+0.190亞油酸+0.144鄰苯二甲酸二辛酯- 0.004莨菪亭- 0.077硬脂酸- 0.093香草醛+0.048十七酸- 0.096軟脂酸- 0.028花生酸。

2.3 烤煙根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物主成分因子與烤煙品質(zhì)因子典型相關(guān)分析

以上述主成分因子F1、F2、F3和F4為自變量,烤煙常規(guī)化學(xué)成分綜合指數(shù)(y1)、烤煙感官質(zhì)量綜合指數(shù)(y2)、烤煙外觀質(zhì)量綜合指數(shù)(y3)和烤煙物理特性綜合指數(shù)(y4)為因變量,進行典型相關(guān)分析,分析結(jié)果如表5所示。

表5 烤煙根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物主成分因子與烤煙品質(zhì)因子典型相關(guān)系數(shù)Table 5 Canonical correlation coefficients between principal component factor of root secondary metabolites and quality factors of flue-cured tobacco

次生代謝產(chǎn)物與烤煙品質(zhì)因子的第1典型變量和第2典型變量均具有極顯著的相關(guān)性(P<0.01),與烤煙品質(zhì)因子的第3典型變量具有顯著相關(guān)性(P<0.05),因此針對前3對典型變量參照表6數(shù)據(jù)進行分析。

表6 集合標準化相關(guān)系數(shù)Table 6 Correlation coefficients of set standardization

第1對典型變量中,U1=-0.448 ×F1+0.656 ×F2-0.282 ×F3+0.538 ×F4;V1=0.488 ×y1-1.092 ×y2-0.288 ×y3- 0.095 ×y4。U1為根際次生代謝產(chǎn)物的綜合情況,V1為烘烤后的烤煙品質(zhì)因子綜合情況。載荷矩陣顯示,第1對典型變量中,烤煙根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物中的醛酯類因子和酚類因子對烤煙外觀質(zhì)量、感官質(zhì)量和常規(guī)化學(xué)成分等品質(zhì)因子貢獻較大?？緹煾祪?nèi)2,2’-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、鄰苯二甲酸二辛酯與香草醛含量高,對提高烤煙化學(xué)成分因子具有積極作用,但對烤煙的物理特性、感官質(zhì)量和外觀質(zhì)量等品質(zhì)因子具有負面效應(yīng)。

第2對典型變量中,U2=-0.627 ×F1+0.059 ×F2-0.263 ×F3-0.731 ×F4;V2=1.094 ×y1-1.421 ×y2+0.337 ×y3+0.669 ×y4。烤煙根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物中的酚類因子和酚酸類因子對烤煙常規(guī)化學(xué)成分、感官質(zhì)量和物理特性等品質(zhì)因子貢獻較大。提高烤煙根系內(nèi)莨菪亭、軟脂酸、花生酸含量,或減少2,2’-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚) 和肉豆蔻酸含量,可以改善烤煙感官質(zhì)量,但對烤煙物理特性、外觀質(zhì)量和化學(xué)成分等品質(zhì)因子會產(chǎn)生不利影響。

第3對典型變量中,U3=0.307 ×F1+0.728 ×F2+0.482 ×F3-0.379 ×F4;V3=1.421 ×y1-0.288 ×y2-0.463 ×y3- 0.575 ×y4。烤煙根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物中的醛酯類因子和酸酯類因子對烤煙常規(guī)化學(xué)成分、物理特性等品質(zhì)因子貢獻較大?？緹煾祪?nèi)香草醛、鄰苯二甲酸二辛酯、棕櫚酸甲酯和十七酸含量的提高,可以提高烤煙化學(xué)成分品質(zhì)因子,但對烤煙物理特性和外觀質(zhì)量等品質(zhì)因子會產(chǎn)生負面影響。

3 討 論

土壤中的化感物質(zhì)主要來源于植物的次生代謝產(chǎn)物,通過多種運輸途徑分泌至根際,進而影響植株的生長發(fā)育。由于研究對象不同,不同植物及不同品種根系內(nèi)鑒定到的次生代謝產(chǎn)物也存在差異。研究發(fā)現(xiàn),不同作物根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的種類不同,甜瓜根際土壤中檢測到化感物質(zhì)16種[15],花生根系內(nèi)檢測到24種次生代謝產(chǎn)物[16]。本研究在烤煙根系內(nèi)檢測到了5類14種次生代謝產(chǎn)物。

本研究通過因子分析將根系內(nèi)14種次生代謝產(chǎn)物分為4類因子,分別為酚酸類因子、醛酯類因子、酸酯類因子和酚類因子,其主成分因子的方差貢獻率分別為33.46%、18.81%、17.60%和15.87%。其中酚酸類因子方差貢獻率遠高于其他3個主成分因子。張克勤等[17]研究發(fā)現(xiàn),酚酸類物質(zhì)是煙草根系分泌物的主要成分,且該類物質(zhì)是造成烤煙連作障礙的重要化感物質(zhì)。

將根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物與烤煙4個品質(zhì)因子進行典型相關(guān)分析,結(jié)果表明,有2組典型相關(guān)變量關(guān)系達極顯著水平(P≤ 0.01),1組典型相關(guān)變量關(guān)系達顯著水平(P≤0.05),說明根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物對烤煙品質(zhì)因子有較大影響?？緹煾祪?nèi)鄰苯二甲酸二辛酯、棕櫚酸甲酯、香草醛、十七酸和2.2’-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)含量越高,烤煙化學(xué)成分的協(xié)調(diào)性越好,但烤煙外觀質(zhì)量、物理特性和感官質(zhì)量等因子較差。而根系內(nèi)莨菪亭、軟脂酸、花生酸含量越高,2,2’-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)和肉豆蔻酸的含量越低,烤煙感官質(zhì)量因子越優(yōu),但其他品質(zhì)因子越差。植物的部分次生代謝產(chǎn)物(如醇類、有機酸類和萜烯等)為烤后烤煙中的香氣物質(zhì),這些物質(zhì)對提高烤煙感官質(zhì)量中的香氣質(zhì)和香氣量具有重要作用[18]。已報道的烤煙中莨菪亭[19]、軟脂酸[20]、花生酸[21]等對煙氣感官質(zhì)量具有正向影響,這可能是根系內(nèi)這3種物質(zhì)能提高烤煙感官質(zhì)量因子的原因;另據(jù)報道,這3種植物根際分泌物在土壤中作為化感物質(zhì),對作物具有抑制作用[22-24]。本研究也說明,這3種根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的積累對烤煙外觀質(zhì)量、物理特性和常規(guī)化學(xué)成分等品質(zhì)因子有負面影響。而香草醛、鄰苯二甲酸二辛酯、2,2’-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、棕櫚酸甲酯和十七酸含量對提高烤煙化學(xué)成分品質(zhì)因子具有積極作用,但對烤煙其他3類品質(zhì)因子質(zhì)量的提高具有負面作用。一定濃度的鄰苯二甲酸二辛酯會對西芹產(chǎn)生抑制作用[25],2,2’-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)作為主要化感物質(zhì)對生菜、萵筍、小麥、玉米、高粱、油菜、決明子和半夏等8種作物均有抑制作用[26],香草醛和十七酸作為化感物質(zhì),分別會抑制胡楊和茄子的正常生長[27-28]。植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的積累會一定程度促進植物體內(nèi)相關(guān)酶活性的提高[29],而烤煙體內(nèi)轉(zhuǎn)化酶、淀粉還原酶、硝酸還原酶等活性的提高能分別促進烤煙蔗糖代謝、淀粉代謝以及氮代謝[30],進而促進烤煙糖、淀粉、氮、煙堿等化學(xué)成分的協(xié)調(diào)性。這有可能是這些次生代謝產(chǎn)物的積累能改善烤煙化學(xué)協(xié)調(diào)性的原因之一。本研究結(jié)果表明,不同連作年限(連作2 ～ 5年)烤煙均會對烤煙品質(zhì)帶來負面影響,烤煙綜合品質(zhì)較輪作對照平均下降17.57%[13],而根系內(nèi)關(guān)鍵次生代謝產(chǎn)物的積累是造成烤煙品質(zhì)下降的重要因素之一。結(jié)合烤煙品質(zhì)評價,深入開展烤煙根系內(nèi)不同次生代謝產(chǎn)物代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,可能揭示次生代謝產(chǎn)物對烤煙品質(zhì)的影響機制。

鄰苯二甲酸二辛酯、香草醛、十七酸、2,2’-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、棕櫚酸甲酯、莨菪亭、軟脂酸、花生酸和肉豆蔻酸這9種根系內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的部分物質(zhì)含量增加或降低,僅僅只能改善烤煙4類品質(zhì)因子中的某1類,而對其他3類品質(zhì)因子均呈現(xiàn)抑制作用,說明總體上根系關(guān)鍵次生代謝產(chǎn)物對烤煙品質(zhì)表現(xiàn)抑制作用,不利于提升煙農(nóng)的收益和烤煙的工業(yè)可用性。因此,如何有效降低根內(nèi)有害次生代謝產(chǎn)物[如:香草醛、2,2’-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、鄰苯二甲酸二辛酯等]積累,或促進對烤煙感官質(zhì)量有利的根部次生代謝產(chǎn)物(如:莨菪亭、軟脂酸、花生酸等)向地上部葉片中運輸,可能是解決烤煙連作障礙的另一途徑,為緩解烤煙連作障礙提供技術(shù)思路。

4 結(jié) 論

連作烤煙根系內(nèi)共檢測鑒定到14種主要次生代謝產(chǎn)物。通過因子分析提取4個主成分因子,分別是酚酸類因子、醛酯類因子、酸酯類因子和酚類因子,變量總方差占比分別為33.46%、18.81%、17.60%和15.87%。4個主成分因子與烤煙品質(zhì)因子典型相關(guān)分析顯示,烤煙根系內(nèi)鄰苯二甲酸二辛酯、棕櫚酸甲酯、香草醛、十七酸和2,2’-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)含量對改善烤煙化學(xué)成分的協(xié)調(diào)性具有促進作用,但不利于烤煙其他品質(zhì)的提升。而根系內(nèi)莨菪亭、軟脂酸、花生酸含量越高,2,2’-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)和肉豆蔻酸含量越少,對烤煙感官質(zhì)量因子有改善作用,但對其他品質(zhì)因子有負面影響。