吳朝昕,張習(xí)春,龍武華,朱速松

(貴州省水稻研究所,貴陽 550006)

【研究意義】水稻是重要的糧食作物之一,我國1/2以上人口以水稻為主食。秈粳亞種間雜交有著較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì),但秈粳之間因存在生殖隔離而導(dǎo)致雜交后代結(jié)實(shí)率低,限制了雜種優(yōu)勢(shì)的利用。在雜交水稻育種中利用雜種優(yōu)勢(shì)是提高水稻產(chǎn)量的重要選擇之一[1],篩選含有廣親和基因的水稻品種是克服秈粳雜交不育的重要手段。貴州地處云貴高原,存在秈粳交錯(cuò)地帶,擁有豐富的稻種資源,在國家資源庫保存的貴州本土水稻資源占全國水稻資源10%[2-5]。貴州禾是貴州特有的水稻資源,主要分布在貴州黔東南地區(qū),多生長在谷間,具有耐冷、耐澇抗旱、耐瘠性、易倒伏特性,其稻米氣味清香、口感軟糯深受當(dāng)?shù)匕傩障矏?屬于聯(lián)合國糧農(nóng)組織國際稻作委員會(huì)界定的“特種稻”范疇[2-5]。因此,篩選具有廣親和基因的貴州地方水稻資源,有助于秈粳雜交的雜種優(yōu)勢(shì)利用,對(duì)合理開發(fā)利用貴州地方稻種資源具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】IKehashi等[6-7]率先提出廣親和理論,并將廣親和基因S5n定位在6號(hào)染色體的色素基因C和糯性基因Wx之間。Qiu等[8]將S5n定位在40 Kb內(nèi),Ji等[9]也將S5n精細(xì)定位在50 Kb內(nèi)。Qiu等[8]和Ji等[9]研究發(fā)現(xiàn)S5n定位區(qū)域有24.8 Kb的重疊,其中包含OFR4和OFR5基因。Chen等[10]通過遺傳轉(zhuǎn)化確定,由于S5位點(diǎn)上編碼天冬氨酸蛋白酶的OFR5基因缺失136 bp,造成其功能喪失,因此與ORF5i或ORF5j表現(xiàn)雜交親和。Yang等[11]進(jìn)一步對(duì)S5位點(diǎn)上的OFR3、OFR4和OFR5基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),OFR3、OFR4與ORF5構(gòu)成一個(gè)“殺手-護(hù)衛(wèi)”系統(tǒng)共同參與了S5位點(diǎn)的功能。楊杰等[12]利用S5位點(diǎn)上的3個(gè)復(fù)等位基因S5n、S5i和S5j的序列差異設(shè)計(jì)功能標(biāo)記S5136,對(duì)多個(gè)水稻資源材料進(jìn)行驗(yàn)證。姚國新等[13]和徐華山等[14]利用S5136功能標(biāo)記分別篩選出多個(gè)廣親和水稻資源。米甲明[15]研究發(fā)現(xiàn),606份水稻種質(zhì)材料的祖先S5位點(diǎn)3個(gè)連鎖基因(ORF3、ORF4和ORF5)的等位基因ORF3+、ORF4+和ORF5+的頻率從野生稻至栽培稻逐漸遞減,ORF3-、ORF4-和ORF5-/n的等位基因頻率在栽培稻中顯著上升,說明“-”和“n”類型等位基因起源時(shí)間較晚,可能由“+”類型等位基因突變產(chǎn)生,即ORF3+、ORF4+和ORF5+為祖先等位基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】貴州多次對(duì)地方水稻種質(zhì)資源進(jìn)行收集,但鮮見對(duì)收集資源進(jìn)行廣親和基因篩選的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】根據(jù)S5n、S5i和S5j的序列差異設(shè)計(jì)新的分子標(biāo)記qh,利用該標(biāo)記對(duì)488份地方稻種和121份貴州禾資源進(jìn)行廣親和品種篩選,以期為更好地應(yīng)用貴州優(yōu)質(zhì)稻種資源于秈粳雜交提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

參試材料包括南京11(對(duì)照)、N22(對(duì)照)、02428(對(duì)照)、9311(對(duì)照)、488份貴州水稻資源和121份貴州禾(AC1～AC123)。其中,488份貴州水稻資源由貴州省品種資源研究所提供,121份貴州禾由貴州省水稻研究所提供(表1)。

表1 供試貴州地方水稻品種Table 1 Tested local rice varieties in Guizhou

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理 所有材料于2022年5月種植于貴州省水稻研究所貴陽基地,行距30 cm,株距27 cm,常規(guī)田間管理。

1.2.2 廣親和分子標(biāo)記qh2的引物設(shè)計(jì)與合成 在NCBI中收索S5n(登錄號(hào)EU889293)、S5i(登錄號(hào)EU889295)和S5j(登錄號(hào)EU889294)的基因序列,根據(jù)S5n與S5i、S5j間存在136 bp序列差異,用Primer Premier 6設(shè)計(jì)引物,使其擴(kuò)增的產(chǎn)物大小適中。引物由擎科生物公司合成。

1.2.3 貴州禾種質(zhì)資源S5n的篩選 (1)DNA提取、PCR擴(kuò)增及電泳。采幼嫩葉片利用CTAB法提取植物DNA。利用分子標(biāo)記qh進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,進(jìn)行聚丙稀酰胺電泳,1%瓊脂糖凝膠電泳,再以紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。

(2)PCR產(chǎn)物測(cè)序。為明確qh引物擴(kuò)增的產(chǎn)物為廣親和基因S5n的特異性擴(kuò)增,由擎科生物公司使用qh引物對(duì)篩選出的8份材料的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果與NCBI中下載的S5n(登錄號(hào)EU889293)和S5j(登錄號(hào)EU889295)序列進(jìn)行比對(duì)。

(3)S5基因型分析標(biāo)記。ORF3-F(5′-ACCCACCTTGGTTCATCGTC-3′),ORF3-R(5′-TTCCCG TCCTCTACCTGTTG-3′),基因型為“+”PCR產(chǎn)物大小為133 bp,基因?yàn)椤?”PCR產(chǎn)物大小為120 bp;ORF4-F(5′-GAACACCTCGAATAAGCT-3′),ORF4-R(5′-CTGCTGCCTCTGTGTCTA-3′),基因型為“+”PCR產(chǎn)物大小為128 bp,基因型為“-”PCR產(chǎn)物大小為117 bp。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣親和分子標(biāo)記qh的開發(fā)

根據(jù)S5n與S5i、S5j序列之間存在的136 bp序列差異,在基因序列缺失兩側(cè)使用Primer Premier 6設(shè)計(jì)引物qh-F(5′-CAACCCATTTCCTTTCCTAC-3′)

和qh-R(5′-TATAATATCTTCTCC GATCC-3′),含有廣親和基因S5n的材料擴(kuò)增片段為389 bp,不含廣親和基因S5n的材料擴(kuò)增片段為525 bp。合成引物后,使用02428、9311及92、98、224、233、282等試驗(yàn)材料進(jìn)行擴(kuò)增及瓊脂糖電泳,qh分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果如圖1,能明顯區(qū)分含有S5n基因的02428和不含有S5n基因的9311;明顯檢測(cè)出試驗(yàn)材料中含S5n基因的糯旱谷-1(編號(hào)98)、旱谷(編號(hào)233)和八百粒(編號(hào)282),及不含S5n基因的糯谷-5(編號(hào)92)和紅麻粘(編號(hào)224)等材料。說明,qh分子標(biāo)記能很好地區(qū)分S5n基因。

M為Marker,編號(hào)與表1序號(hào)對(duì)應(yīng)。下同。M:Marker. The number in the figure corresponds to table 1. The same as below.圖1 qh分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果圖譜Fig.1 Mapping of qh molecular marker test result

2.2 貴州水稻種質(zhì)資源S5n的篩選

2.2.1 貴州禾種質(zhì) 從圖2看出,貴州禾資源的電泳條帶與不含S5n基因的對(duì)照9311相同。說明,121份貴州禾中不存在含有S5n基因的資源。

圖2 qh引物對(duì)部分貴州禾資源PCR擴(kuò)增結(jié)果圖譜Fig.2 Mapping of PCR amplification results of qh primers on selecting Guizhou rice resources

2.2.2 地方水稻 利用qh引物對(duì)488份貴州種質(zhì)資源進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從中篩選出糯旱谷-1(98)、本地燕麥谷(151)、旱谷(233)、納包糯旱稻2號(hào)(239)、弼佑旱稻(244)、雙江旱稻(249)、八百粒(282)和旱禾-3(365)共8份含有S5n基因的材料(圖3)。

圖3 qh引物對(duì)部分貴州種質(zhì)資源PCR擴(kuò)增結(jié)果圖譜Fig.3 Mapping of PCR amplification results of qh primers on selecting Guizhou germplasm resources

2.3 8份貴州種質(zhì)資源的廣親和基因分析

從圖4看出,8份篩選出的材料攜帶的S5n基因序列與NCBI上登錄的S5n基因序列完全一致,表明,qh分子標(biāo)記篩選結(jié)果準(zhǔn)確。對(duì)8份材料的S5n基因全長序列測(cè)序發(fā)現(xiàn),其中編號(hào)282材料在第二外顯子連續(xù)缺失10 bp。從圖5看出,使用ORF3引物擴(kuò)增的8份廣親和材料條帶與02428相同,同為“+”類型;使用ORF4引物擴(kuò)增的8份廣親和材料中僅有八百粒(編號(hào)282)與Nanjing11和N22相同,為“-”類型,其余7份廣親和材料與02428相同,同為“+”類型。即8份材料的S5基因型分別為糯旱谷-1(++n)、本地燕麥谷(++n)、旱谷(++n)、納包糯旱稻2號(hào)(++n)、弼佑旱稻(++n)、雙江旱稻(++n)、八百粒(+-n)和旱禾-3(++n)。

圓點(diǎn)表示S5n缺失的堿基。The dot indicates the deletion in S5n.圖4 親和材料與S5n和S5j的共線性Fig.4 Collinearity among compatibility materials, S5n and S5j

圖5 8份親和材料S5位點(diǎn)ORF3和ORF4基因型擴(kuò)增結(jié)果圖譜Fig.5 Mapping of amplification results of ORF3 and ORF4 PCR genotype of 8 wide-compatibility materials at S5 site

3 討 論

廣親和品種與秈、粳稻雜交可產(chǎn)生育性正常的后代,篩選含有廣親和基因的品種對(duì)水稻秈粳雜交是十分重要的工作。米甲明[15]將S5位點(diǎn)的各類等位基因組合進(jìn)行雜交發(fā)現(xiàn),基因型ORF3+ORF4-ORF5-/n能與S5位點(diǎn)的12類等位基因組合雜交親和,因此將基因型ORF3+ORF4-ORF5-/n命名為“廣譜性廣親和基因(Broad-WCG)”。本研究中篩選出的8份廣親和材料中,八百粒(編號(hào)282)的基因型為ORF3+ORF4-ORF5n,是廣譜性廣親和品種。

Chen等[10]報(bào)道,S5n基因缺少136 bp導(dǎo)致基因功能喪失功能,因此含有S5n基因的品種與秈粳雜交的雜種胚囊可育,并預(yù)測(cè)S5n基因其余位置如何突變均不影響其克服秈粳雜交不育。仝靜飛等[16]根據(jù)48份材料的S5n序列多態(tài)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果,將S5n變異分為16類;對(duì)第二外顯子10堿基缺失材料進(jìn)行秈粳雜交測(cè)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),第二外顯子10堿基的缺失不會(huì)影響秈粳雜交后代育性。本研究對(duì)八百粒S5n基因進(jìn)行全長測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),八百粒(編號(hào)282)的S5n基因變異類型屬仝靜飛等[16]報(bào)道的第14類,說明八百粒(編號(hào)282)是廣譜性廣親和品種,不會(huì)因?yàn)槠涞诙怙@子10堿基的缺失而影響其克服秈粳雜交不育,表明八百粒(編號(hào)282)是應(yīng)用于秈粳雜交的潛在優(yōu)良材料。

4 結(jié) 論

貴州地處云貴高原,存在秈粳交錯(cuò)地帶,擁有豐富的稻種資源。對(duì)收集到的609份貴州地方水稻資源,以qh廣親和基因標(biāo)記進(jìn)行篩選,從中篩選出糯旱谷-1、本地燕麥谷、旱谷、納包糯旱稻2號(hào)、弼佑旱稻、雙江旱稻、八百粒和旱禾-3共8份含有廣親和基因的品種。其中,八百粒(編號(hào)282)為廣譜性廣親和品種,是應(yīng)用于秈粳雜交的潛在優(yōu)良材料。