郝愛平,韓雪楊,薛巨坤,魏繼承,任如意

(牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,黑龍江 牡丹江 157011)

【研究意義】鋅指轉(zhuǎn)錄因子是植物中最重要的家族之一,參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育代謝及抵抗生物和非生物脅迫途徑。鋅指TF根據(jù)其個(gè)體成員的結(jié)構(gòu)和功能特征分為幾個(gè)亞家族。其中,B-box蛋白(B-box proteins,BBX蛋白)由于具有多種功能,近年來(lái)備受關(guān)注。BBX蛋白包含1個(gè)或2個(gè)靠近N-末端的保守B盒結(jié)構(gòu)域,有些在靠近C-末端的地方有一個(gè)額外的CCT(CONSTANS,CO-like和TOC1)保守結(jié)構(gòu)域。B-box分為兩類,分別為B-box1(B1)和B-box2(B2)。2個(gè)B-box保守結(jié)構(gòu)域根據(jù)其一致序列和鋅結(jié)合殘基之間的距離被識(shí)別[1]。進(jìn)化過(guò)程中的片段復(fù)制和刪除事件導(dǎo)致2個(gè)B盒結(jié)構(gòu)域中的一致序列存在差異[2]。高度保守的CCT結(jié)構(gòu)域由42～43個(gè)氨基酸組成,對(duì)功能性轉(zhuǎn)錄和核蛋白運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)非常重要[3]。在擬南芥中,已鑒定出14個(gè) BBX 蛋白,這些成員根據(jù) B-BOX 結(jié)構(gòu)域和 CCT 結(jié)構(gòu)域的存在分為5個(gè)亞組[4]。越來(lái)越多的證據(jù)表明植物 BBX 蛋白在多種生理和生化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,例如開花誘導(dǎo)、光形態(tài)發(fā)生、避蔭反應(yīng)、類胡蘿卜素生物合成、生物和非生物應(yīng)激反應(yīng)[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】BBX蛋白參與植物激素信號(hào)反應(yīng)。脫落酸 (ABA) 是一種植物激素,當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)會(huì)被激活[6]。微矩陣分析檢測(cè)到薔薇中BBX基因的表達(dá)模式對(duì)ABA的響應(yīng)不同[7]。此外,在番茄中發(fā)現(xiàn)BZS1/BBX20還參與油菜素類脂 (BR) 和光通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。馬鈴薯BBX蛋白在赤霉素 (GA) 信號(hào)通路中發(fā)揮潛在作用[9]。BBX18蛋白可以通過(guò)上調(diào)GA的表達(dá)水平來(lái)增強(qiáng)梨樹下胚軸的生長(zhǎng),同時(shí)在不同光照情況下能夠促進(jìn)相關(guān)代謝基因的活性[10]。當(dāng)白菜經(jīng)生長(zhǎng)素、GA和細(xì)胞分裂素處理時(shí),不同的白菜BBX基因表達(dá)水平不同,并且白菜BBX基因在其啟動(dòng)子中具有激素響應(yīng)順式作用元件[11]。BBX 蛋白在果實(shí)發(fā)育中也具有重要作用,在花青素和類胡蘿卜素的生物合成中,MdBBX22蛋白參與 MdHY5介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)節(jié)蘋果皮中花青素的積累[12],SlBBX20蛋白通過(guò)直接激活乙烯合成相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)番茄葉綠體發(fā)育和類胡蘿卜素積累[13]。表明,BBX蛋白可能參與植物激素信號(hào)傳導(dǎo)。BBX基因也顯示它們?cè)诜巧飸?yīng)激反應(yīng)中的作用。在擬南芥中,初步鑒定耐鹽蛋白 (STO,AtBBX24) 可以提高酵母細(xì)胞耐鹽性[14],也可在高鹽度條件下促進(jìn)擬南芥根的生長(zhǎng)。STO蛋白可以作為廣泛范圍應(yīng)激相關(guān)基因的調(diào)控因子[15]。AtBBX18蛋白在光形態(tài)形成和提升熱耐受性方面都具有重要作用[16]。在菊花中,CmBBX24蛋白除了具有延遲開花的作用外,還可以提高植物對(duì)寒冷或干旱的耐受性[17]。此外,與野生型植物相比,AtBBX24基因的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了耐鹽性,并顯著增加擬南芥的根長(zhǎng)度[18]。【本研究切入點(diǎn)】水稻是世界上種植最廣泛的糧食作物之一,深入分析水稻BBX基因家族并挖掘發(fā)育和脅迫相關(guān)重要基因?qū)λ居N意義重大,并且水稻中的BBX基因家族研究還未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)對(duì)水稻的DBB(Double B-box)基因家族進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)鑒定并研究其在不同組織中的表達(dá)情況,為后續(xù)深入研究水稻DBB基因家族功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

用于生物信息學(xué)分析的水稻全蛋白序列、全基因組序列以及GFF3文件下載自http://asia.ensembl.org/index.html,擬南芥DBB基因的蛋白序列下載自庫(kù)TAIR(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)。

1.2 水稻DBB基因家族成員的鑒定

根據(jù)擬南芥(Arabidopsisthaliana)已經(jīng)鑒定出的DBB基因及其編碼的蛋白序列,利用Pfam(http://pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)和Hmmer 3.0軟件構(gòu)建隱馬氏模型序列,對(duì)水稻全蛋白序列進(jìn)行檢索和去冗余,得到候選蛋白序列,其中閾值設(shè)為 E<1e-5。利用PfamScan (https://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/pfamscan/)和SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)在線平臺(tái)對(duì)水稻所有候選基因的氨基酸序列結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定,含有DBB結(jié)構(gòu)域的蛋白即為水稻DBB蛋白家族成員。并根據(jù)水稻DBB基因家族在染色體上的定位進(jìn)行命名。

1.3 水稻DBB蛋白理化性質(zhì)分析

利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)在線工具分析水稻DBB蛋白的物理和化學(xué)性質(zhì),包括氨基酸數(shù)目(NA)、分子量大小(MW)和等電點(diǎn)(pI)等;利用網(wǎng)站W(wǎng)oLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析。

1.4 水稻DBB基因染色體定位

水稻DBB基因染色體信息從基因注釋文件中獲得,整理成MAP文件,上傳到MapInspect得到染色體位置可視化圖片。

1.5 水稻DBB家族基因多重序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)域分析

使用DNAMAN軟件對(duì)OsDBB氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。利用NCBI和TBtools軟件對(duì)OsDBB蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.6 水稻DBB基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序預(yù)測(cè)

分別從水稻全基因組序列和基因注釋GFF3文件中篩選OsDBB基因家族的 DNA和CDS序列,利用Gene Structure Display Server(GSDS)(http://gsds.gao-lab.org/index.php)在線網(wǎng)站對(duì)該基因家族的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,并利用MEME Suite5.3.3(https://meme-suite.org/meme/)網(wǎng)站對(duì)水稻DBB蛋白保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè),借助TBtools軟件對(duì)該基因家族的保守基序進(jìn)行可視化分析,其中motif最大數(shù)目為10。

1.7 水稻和擬南芥DBB基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用MEGA11.0軟件中的Align by Clustal W工具對(duì)水稻和擬南芥DBB蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì),各個(gè)參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)值,并用其 Phylogeny工具以 Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,Bootstrap值設(shè)定為1000。

1.8 水稻DBB基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式調(diào)控元件分析

利用TBtools軟件提取OsDBB基因CDS序列上游2000 bp序列,通過(guò)PlantCare數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)OsDBB基因的順式調(diào)節(jié)元件進(jìn)行分析。

1.9 水稻DBB基因在不同組織中的表達(dá)模式

利用BAR數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.bar.utoronto.ca/)檢索水稻不同生長(zhǎng)階段各組織器官中水稻DBB基因的表達(dá)水平,并構(gòu)建熱圖,篩選在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中起關(guān)鍵作用的DBB基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻DBB基因家族成員的鑒定

使用14個(gè)擬南芥DBB蛋白序列作為查詢序列,對(duì)水稻基因組數(shù)據(jù)利用Pfam(http://pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)和Hmmer3.0軟件構(gòu)建隱馬氏模型序列,對(duì)水稻全蛋白序列進(jìn)行檢索和去冗余,得到候選蛋白序列,對(duì)假定的OsDBB蛋白質(zhì)序列進(jìn)行SMART和Pfam工具測(cè)試DBB結(jié)構(gòu)域的存在。鑒定的13個(gè)OsDBB均含有2個(gè)DBB結(jié)構(gòu)域。

2.2 水稻DBB蛋白理化性質(zhì)分析

對(duì)OsDBB蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)(表1)分析,OsDBB蛋白氨基酸數(shù)量在181(OsDBB6)～ 378(OsDBB8),分子量在21.62(OsDBB4)～39.40(OsDBB8)KDa,等電點(diǎn) (pI) 在4.93(OsDBB2)～5.98(OsDBB1),且全部為酸性蛋白pI<7.5,OsDBB蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為41.76 ～66.62,其中所有OsDBB蛋白為不穩(wěn)定蛋白(II>40),脂肪系數(shù)在54.63(OsDBB8)～79.5(OsDBB6),平均親水性值在-0.137(OsDBB13)～-0.685(OsDBB12),且親水性值都小于0,表明OsDBB蛋白均為親水性蛋白。水稻DBB蛋白在理化性質(zhì)上存在差異,說(shuō)明這些成員可能在水稻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著不同的調(diào)控作用。

表1 OsDBB蛋白理化性質(zhì)分析Table 1 Analysis of physicochemical properties of OsDBB proteins

2.3 水稻DBB基因染色體定位

根據(jù)水稻基因組中的注釋信息,發(fā)現(xiàn)13個(gè)水稻DBB基因分布在12條水稻染色體中的7條上(圖1)。每個(gè)染色體DBB基因數(shù)量為1或3個(gè),其中Chr01、Chr05、Chr09和Chr12號(hào)染色體上分別含有1個(gè)OsDBB基因,Chr02、Chr04和Chr06號(hào)染色體上分別含有3個(gè)OsDBB基因。

圖1 OsDBB家族基因染色體定位分析Fig.1 Localization analysis of OsDBB family gene

2.4 水稻DBB家族基因多重序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)域分析

利用DNAMAN軟件對(duì)OsDBB蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),該家族基因成員相似性達(dá)32.46%,且保守區(qū)域主要集中在N端(圖2)。同時(shí)對(duì)OsDBB蛋白序列的結(jié)構(gòu)域(圖3)分析發(fā)現(xiàn),該家族主要含Bbox1-BBX-like和BBOX 2個(gè)結(jié)構(gòu)域,且主要位于OsDBB蛋白序列的N端,與序列同源性比對(duì)結(jié)果一致。

圖2 水稻DBB氨基酸多重序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of rice DBB amino acid

圖3 水稻DBB基因結(jié)構(gòu)域Fig.3 Rice DBB gene domain

2.5 水稻DBB基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序的分析

從圖4-A可知,OsDBB基因家族成員的內(nèi)含子和外顯子數(shù)目存在一定的差異,具體表現(xiàn)在OsDBB1、OsDBB2、OsDBB6、OsDBB10、OsDBB11和OsDBB13各含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子,而OsDBB12含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子,其余基因均含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。基因聚類(圖4-B)發(fā)現(xiàn),水稻13個(gè)DBB基因中有5個(gè)旁系基因?qū)?分別為OsDBB1和OsDBB8、OsDBB10和OsDBB11、OsDBB3和OsDBB4、OsDBB5和OsDBB6、OsDBB12和OsDBB13,每個(gè)旁系基因?qū)Φ幕蚪Y(jié)構(gòu)相似,推測(cè)基因功能類似。

A:OsDBB基因結(jié)構(gòu)分析;B:OsDBB基因進(jìn)化樹;C:OsDBB基因家族motif預(yù)測(cè);D:motif氨基酸序列分析 A:OsDBB gene structure analysis; B:The Phylogenetic tree of OsDBB gene; C:Motif prediction of OsDBB gene family; D:Sequence analysis of motif amino acid.圖4 水稻DBB基因結(jié)構(gòu)和motif預(yù)測(cè)Fig.4 Rice DBB gene structure and motif prediction

從圖4-C可知,OsDBB基因家族成員的motif數(shù)量及排列均存在一定的差異,其中motif 1在13個(gè)OsDBB蛋白中均含有分布;而motif 2分布在除OsDBB12蛋白外的其他12個(gè)OsDBB蛋白序列中,且主要分布在蛋白質(zhì)序列的N端;motif 3和motif 4主要分布在OsDBB2、OsDBB3、OsDBB4和OsDBB7蛋白序列中;motif 4主要位于蛋白質(zhì)序列的C端;motif 5主要分布在OsDBB3、OsDBB4和OsDBB9蛋白質(zhì)序列中;motif 6、motif 7和motif 8主要分布在OsDBB10和OsDBB11的蛋白質(zhì)序列中,motif 9在OsDBB2和OsDBB5都有分布;motif 10則分布在OsDBB1、OsDBB5、OsDBB6、OsDBB8和OsDBB9蛋白質(zhì)中。另外,每個(gè)motif的序列和長(zhǎng)度均存在差異(圖4-D),其中motif 9含有18個(gè)氨基酸,motif 1、motif 2和motif 6均含有50個(gè)氨基酸,其余氨基酸數(shù)目21～45個(gè)不等。

2.6 水稻DBB蛋白多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹

聚類分析結(jié)果(圖5)顯示,27個(gè)DBB蛋白分為Group 1、Group 2、Group 3和Group 4 4個(gè)亞族,每個(gè)亞族均含有擬南芥DBB蛋白,但數(shù)量均存在一定差異,其中Group 4亞族中成員最多,含有13個(gè)DBB家族成員,水稻和擬南芥分別含有7和6個(gè)DBB成員,Group 1亞族含有3個(gè)AtDBB,無(wú)水稻DBB基因家族成員,是含DBB基因家族成員最少的亞族,而Group 2和Group 3各含4和7個(gè)DBB基因家族成員,其中2個(gè)亞族均含有2個(gè)AtDBB基因。表明,水稻DBB大多數(shù)家族成員與擬南芥DBB家族成員進(jìn)化關(guān)系較近,推測(cè)其功能相似。

圖5 水稻和擬南芥DBB基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.5 Family phylogenetic analysis of DBB gene in rice and A.thaliana

2.7 水稻DBB基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式調(diào)控元件分析

在13個(gè)水稻OsDBB基因啟動(dòng)子區(qū)域中共預(yù)測(cè)27種順式作用元件(圖6)。其中,參與生長(zhǎng)發(fā)育的順式作用元件有7種,分別為ARE、CAT-box、GC基序、GCN4基序、O2-site、RY和TGA元件;參與植物激素和非生物脅迫的順式作用元件分別有4種(TATC-box、CGTCA基序、ABRE和TGACG基序)和6種(TCA元件、CCAAT-box、LTR、MBS、MRE和富含TC的基序),參與光響應(yīng)的有10種(ATCT基序、Box4、GATA基序、G-box、GT1基序、I-box、Sp1、TCCC基序、TCT和GTGGC基序)。在預(yù)測(cè)的植物激素反應(yīng)元件中,ABRE最豐富,參與脫落酸反應(yīng);TGACG和CGTCA基序次之,且數(shù)量相等,均參與茉莉酸甲酯(MeJA)的調(diào)控途經(jīng)。說(shuō)明,OsDBB基因可能參與脫落酸和茉莉酸甲酯調(diào)控途徑。在確定的6種與非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件中,主要涉及干旱脅迫(MBS),參與低溫反應(yīng)(LTR)和防御和壓力反應(yīng)(富含TC的重復(fù))的順式作用元件。說(shuō)明,OsDBB基因可能參與對(duì)逆境的反應(yīng)。

圖中顏色表示順式作用元件的數(shù)量,顏色越深數(shù)量越多,其中白色表示無(wú)相關(guān)順式作用元件; ARE:參與無(wú)氧誘導(dǎo)ABRE:參與脫落酸反應(yīng)的順式調(diào)節(jié)元件。 AuxRR-core:參與生長(zhǎng)素反應(yīng)的順式調(diào)節(jié)元件。 CGTCA 基序:參與茉莉酸甲酯 (MeJA) 反應(yīng)的順式作用調(diào)節(jié)元件。 GARE-motif:赤霉素反應(yīng)元件。 TGACG 基序參與 MeJA 反應(yīng)的順式調(diào)節(jié)元件。 TGA-元件:生長(zhǎng)素反應(yīng)元件。 ERE:順式乙烯反應(yīng)元件。 P-box:赤霉素反應(yīng)元件。 GC-motif:參與特定缺氧誘導(dǎo)的增強(qiáng)子樣元件。 LTR:參與低溫反應(yīng)的順式作用元件。 MBS:與干旱誘導(dǎo)相關(guān)的 MYB 結(jié)合位點(diǎn)。 STRE:壓力應(yīng)元素。富含 TC 的重復(fù)序列:參與防御和壓力反應(yīng)的順式作用元件。 WUN-motif:傷口反應(yīng)元素。 MYC:參與干旱脅迫的順式作用元件。 W框:參與糖代謝和植物防御信號(hào)的順式作用元件。 DRE核心:脫水反應(yīng)元件。 ARE:厭氧誘導(dǎo)的順式調(diào)節(jié)元件。The color in the figure indicates the number of cis acting elements. The darker the color, the more the number. Among them, white indicates that there are no relevant cis acting elements;ARE: Involved in anaerobic induction. ABRE: Cis-regulatory element involved in abscisic acid reaction. AuxRR-core: A cis-regulatory element involved in the auxin reaction. CGTCA motif: Cis-acting regulatory element involved in the reaction of methyl jasmonate (MeJA). GARE-motif: Gibberellin reaction element. The TGACG motif is a cis-regulatory element involved in MeJA response. TGA-element: Auxin reaction element. ERE: Cis-ethylene reaction element. P-box: Gibberellin reaction element. GC-motif: Enhancer like element involved in specific hypoxia induction. LTR: Cis-acting element involved in low temperature reaction. MBS: MYB binding site associated with drought induction. STRE: Stress element. Tc-rich repeat sequences: Cis-acting elements involved in defense and stress responses. WUN-motif: Wound response element. MYC: Cis-acting element involved in drought stress. W frame: Cis-acting element involved in glucose metabolism and plant defense signaling. DRE core: Dehydration reaction element. ARE: Anaerobically induced cis-regulatory element.圖6 水稻啟動(dòng)子順式作用元件分析Fig.6 Analysis of rice promoter cis-acting elements

2.8 水稻DBB基因在不同組織中的表達(dá)模式

分析植物器官特異性基因表達(dá)模式可為基因在發(fā)育過(guò)程中的可能功能提供線索。由圖7可知,所有水稻OsDBB基因在葉、根、種子和花序中的表達(dá)量較高?？傮w來(lái)看,所有水稻OsDBB基因莖尖分生組織的表達(dá)量低于其他組織,其中OsDBB1、OsDBB5、OsDBB8和OsDBB13基因在葉中表達(dá)量較高,OsDBB2、OsDBB7、OsDBB10、OsDBB11和OsDBB12在根中的表達(dá)量較高,OsDBB3、OsDBB4和OsDBB6在種子有較高的表達(dá)量,在花序中只有OsDBB9和OsDBB12表達(dá)。不同水稻OsDBB基因在不同組織中表達(dá)各不相同,并具有一定的特異性,表明OsDBB基因在水稻的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。

右側(cè)標(biāo)尺數(shù)值范圍代表均一化后表達(dá)量的變化范圍,紅色表示高表達(dá),藍(lán)色表示低表達(dá)。The numerical range of the scale on the right represents the variation range of expression after homogenization, red indicates high expression and blue indicates low expression.圖7 水稻DBB基因在不同組織表達(dá)差異分析Fig.7 Analysis of differences in expression of rice DBB gene in different tissues

3 討 論

植物的轉(zhuǎn)錄因子(TFs)是一類通過(guò)調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄而在生理生化過(guò)程中發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)。TF結(jié)構(gòu)構(gòu)建通常有4個(gè)主要域,所有這些域都是功能過(guò)程所必需的:DNA結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄激活域、寡聚化位點(diǎn)和核定位信號(hào)。其中,B-box(BBX)鋅指家族的研究是近年來(lái)發(fā)展的領(lǐng)域。DBB基因家族是BBX的一個(gè)亞族,在植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫中有重要作用。近年來(lái),DBB基因家族成員已在多個(gè)植物種被鑒定,如橡膠樹、芒果、紅花和白菜中各鑒定出9、9、26和18個(gè),并對(duì)其功能進(jìn)行了報(bào)道,但關(guān)于水稻的報(bào)道較少。本研究根據(jù)擬南芥14個(gè)DBB基因家族成員,通過(guò)構(gòu)建HMM文件對(duì)水稻DBB基因家族進(jìn)行基因組水平的鑒定和分析,在水稻中鑒定出13個(gè)DBB基因,并根據(jù)染色體定位命名為OsDBB1～OsDBB13,發(fā)現(xiàn)水稻DBB基因家族成員數(shù)量與其他物種的數(shù)量相近,說(shuō)明DBB基因家族在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守。根據(jù)OsDBB和AtDBB蛋白保守序列的同源性和親緣性,將其分為4個(gè)亞族,這與張鴻韜等[19]在巴西橡膠樹和趙樂(lè)等[20]在紅花中的分類一致。通過(guò)對(duì)水稻DBB基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)和motif分析發(fā)現(xiàn),同一亞族DBB基因結(jié)構(gòu)和motif極其相似,motif 1出現(xiàn)在水稻的13個(gè)DBB基因中,且主要位于蛋白質(zhì)序列的N端,而對(duì)水稻DBB蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行可視化分析發(fā)現(xiàn),該結(jié)構(gòu)主要位于蛋白質(zhì)序列N端,且含有2個(gè),因此推測(cè)motif 1很可能是水稻DBB蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。

基因家族成員的外顯子/內(nèi)含子多樣化通過(guò)3種主要機(jī)制在多個(gè)基因家族的進(jìn)化中發(fā)揮重要作用:外顯子/內(nèi)含子獲得/丟失、外顯子/假外顯子化和插入/缺失。本研究發(fā)現(xiàn),具有高度相似的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)屬于同一系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分枝,這與在小擬南芥和辣椒中的研究結(jié)果一致[21-22]。在幾個(gè)水稻DBB基因的編碼序列中觀察到外顯子/內(nèi)含子長(zhǎng)度存在明顯差異,這可能導(dǎo)致產(chǎn)生功能不同的旁系同源基因。

植物在其生命周期中會(huì)暴露于一系列非生物和生物脅迫中,同時(shí)植物也進(jìn)化出多種保護(hù)自身免受生物和非生物脅迫的途徑,主要反應(yīng)在脅迫反應(yīng)基因和其表達(dá)上,并且基因的表達(dá)受啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。本研究對(duì)水稻DBB基因CDS區(qū)上游2000 bp進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析,水稻DBB基因啟動(dòng)子區(qū)域中的部分元件數(shù)量不盡相同,其中激素類響應(yīng)順式作用元件最多,這些激素在植物對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)以及植物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,如脫落酸(ABA)、茉莉酸(MeJA)和水楊酸(SA)等小信號(hào)分子介導(dǎo)植物響應(yīng)以抵御壓力[23-24],對(duì)于植物在自然界中的生存至關(guān)重要。其中茉莉酸甲酯及其生物活性衍生物是植物對(duì)生物脅迫(如傷害、病原體感染和昆蟲攻擊)以及非生物脅迫(如干旱和臭氧暴露)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[25]。在健康、未受傷的植物組織中,茉莉酸鹽在控制多種重要發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮廣泛作用,包括根系生長(zhǎng)、種子萌發(fā)、卷須卷曲、花發(fā)育和衰老[26]。而在水稻DBB基因啟動(dòng)子區(qū)域中脫落酸、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件數(shù)量最多(ABRE、CGTCA-motif)[27]。此外,水稻DBB基因除CAAT-box、TATA-box等啟動(dòng)子基本核心元件外,還包含大量參與光響應(yīng)的元件(AE-box、ATCT-motif、Box 4、GT1-motif、LAMP-element、TCT-motifand chs-CMA1a),表明OsDBB基因在水稻生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫中具有重要作用。

4 結(jié) 論

本研究首次對(duì)水稻DBB基因家族進(jìn)行基因組學(xué)分析,共鑒定出13個(gè)OsDBB基因。水稻OsDBB基因的啟動(dòng)子序列含有與生長(zhǎng)發(fā)育、激素、應(yīng)激反應(yīng)以及光響應(yīng)有關(guān)的調(diào)控元件。不同水稻OsDBB基因在不同組織中的表達(dá)各不相同,具有一定的特異性。推測(cè)水稻OsDBB基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫中具有重要作用。