蔣文鴻，王潤(rùn)崢，王 勇，劉素穩(wěn)*，常學(xué)東

（1.中糧長(zhǎng)城葡萄酒（寧夏）有限公司，寧夏銀川 750000；2.河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北秦皇島 066604）

果酒是以植物的果實(shí)作為原料，經(jīng)發(fā)酵釀造而成的低酒精度飲料。隨著近年來(lái)人民生活水平的逐步提高和消費(fèi)品味的豐富多樣化，營(yíng)養(yǎng)豐富和口感柔和的果酒受到越來(lái)越多消費(fèi)者的喜愛(ài)，逐漸成為人們居家旅行和宴會(huì)接待的必備飲品。

山楂（Crataegus pinnatifidaBunge），又名山里果、山里紅，薔薇科落葉小喬木植物山里紅的果實(shí)[1]，果實(shí)外觀呈球形，成熟后為深紅色，表面呈現(xiàn)淡色小斑點(diǎn)。果實(shí)酸甜可口，含豐富的維生素、山楂酸、檸檬酸、黃酮類等，具有生津止渴的良好效果，也可入藥使用，入藥歸脾、胃、肝經(jīng)，有消食化積、降血壓、活血散瘀的良好功效[2-3]。將其開(kāi)發(fā)成具有高附加值的山楂酒，不僅可保留山楂的大部分營(yíng)養(yǎng)成分，還能提升產(chǎn)品的附加值，促進(jìn)山楂產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]，并且符合糧食酒向果酒轉(zhuǎn)變的國(guó)家酒類行業(yè)政策。以鮮山楂為主要原料釀制的山楂酒，是除獼猴桃酒外擁有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的果酒[5]，符合消費(fèi)者追求純天然無(wú)污染、含糖量少、酒精度低且有益于健康的果酒消費(fèi)潮流。

山楂酒是以新鮮山楂為原料，經(jīng)清洗、破碎、發(fā)酵、穩(wěn)定等工藝精心釀制而成的，酒質(zhì)溫和爽口，果香味濃，較好保留了山楂鮮果中的天然營(yíng)養(yǎng)成分和總酚、黃酮等保健成分，是一種天然健康的生物飲品。色香味是消費(fèi)者對(duì)食品的基本需求，香氣成分也是果酒中十分重要的質(zhì)量指標(biāo)，香氣和其他特性決定果酒的檔次和品味[6]。山楂酒發(fā)酵過(guò)程中其香氣成分和酚類物質(zhì)會(huì)發(fā)生變化，為了更多保留有益成分，對(duì)山楂酒進(jìn)行預(yù)處理可以保留更多的香氣成分和抗氧化物質(zhì)，增加山楂酒的香氣并增強(qiáng)其抗氧化性，提高山楂酒的品質(zhì)。本文通過(guò)GC-MS 和SPME 技術(shù)對(duì)預(yù)處理后山楂酒的香氣成分進(jìn)行分析，對(duì)比空白對(duì)照、水浴、微波等3 種不同處理的山楂在發(fā)酵后香氣成分和抗氧化性的變化趨勢(shì)，從而進(jìn)一步研究預(yù)處理對(duì)山楂酒香氣成分和抗氧化性的影響，為釀造高品質(zhì)山楂酒提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原材料：紫肉山楂，采摘于2021 年興隆縣；果膠酶，美國(guó)Sigma 公司；白砂糖，超市；干酵母，超市；沒(méi)食子酸，原花青素，香草醛；碳酸鈉、乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇、鹽酸、氯化鉀、過(guò)硫酸鉀，均為分析純。

儀器設(shè)備：7890-5975 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent 公司；實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)(FE20)，梅特勒-托利多儀器有限公司；微波爐，LG 燒烤型微波爐WD800（MG-5530S），樂(lè)金電子電器有限公司；顯數(shù)恒溫水浴鍋(HH-4)，金壇市杰瑞爾電器有限公司；低速離心機(jī)(TDZ5-WS)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；紫外分光光度(U2910)，雙光束紫外分光光度計(jì)；鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9245A 型)，上?；厶﹥x器制造有限公司；電子分析天平(AL104)，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山楂酒樣品預(yù)處理

挑選無(wú)破損、病蟲害、霉變，顆粒飽滿的山楂，去核，去梗，做前期處理，每個(gè)處理選取1 kg山楂。

（1）對(duì)照組：每50 g 破碎的山楂中加入75 mL水，不做其他處理。

（2）水浴組：每50 g 破碎的山楂中加入75 mL水，在50 ℃的水浴中水浴1 h。

（3）微波組：每50 g 破碎的山楂中加入75 mL水，在540 W微波下處理50 s。

1.2.2 山楂酒釀造工藝流程

山楂→分選→洗滌→破碎→預(yù)處理→山楂汁的制備→添加果膠酶→加糖、酵母→發(fā)酵→分離→后發(fā)酵→補(bǔ)加SO2→貯存→下膠→過(guò)濾→冷凍→過(guò)濾→裝瓶→成品

1.2.3 發(fā)酵過(guò)程

采用1∶2 的山楂酒料水比進(jìn)行料液添加，再加入75 mg/L 的二氧化硫并在25 ℃的培養(yǎng)箱中放置24 h。為使山楂汁中有效物質(zhì)充分溶解，還要加入110 mg/L 的果膠酶，在37 ℃下放置6 h。果膠酶處理結(jié)束后，及時(shí)加入白砂糖以補(bǔ)充糖分。隨后加入活化酵母，二次加糖，將調(diào)好的山楂汁在25 ℃培養(yǎng)箱中放置發(fā)酵。每天攪拌一次，測(cè)酒精度，第12 d發(fā)酵結(jié)束。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.4.1 固相萃取儀萃取香氣

將100 μm PDMS 萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口老化2 h，老化溫度250 ℃。選取不同山楂酒樣品置于15 mL 頂空瓶中，上部留有2 cm 左右的空間，封口。將老化后的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于45 ℃吸附40 min，將吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進(jìn)樣口，于250 ℃解吸3 min，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定分析。

1.2.4.2 山楂酒香氣的GC-MS分析

色譜柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm DB—225MS甲基硅氧環(huán)毛細(xì)管柱；GC/MS 條件：升溫程序?yàn)?0 ℃保持2 min，以5 ℃/min 升溫至100 ℃，再以5 ℃/min 升溫至220 ℃；載氣：氦氣，流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度230 ℃。

質(zhì)譜條件：EI 源，離子源溫度230 ℃，電離方式為電子轟擊（Electron Impact，EI），電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍：10～425 amu[7]。

1.2.4.3 總酚測(cè)定

取釀造好的山楂酒，離心機(jī)4000 r/min 離心10 min，取上清液備用。

采用福林酚法[8]，精密稱取沒(méi)食子酸0.1 g 定容至100 mL容量瓶中，制成1 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確量取上述標(biāo)準(zhǔn)液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL 于100 mL 容量瓶中定容，取1 mL 上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，加5 mL 經(jīng)稀釋10 倍的福林肖卡試劑，搖勻。1 min 之后加入7.5%碳酸鈉溶液4 mL，充分混勻，蒸餾水定容至10 mL，在75 ℃下反應(yīng)10 min，于765 nm 波長(zhǎng)比色，測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.6513x+0.0913，R2=0.9992)。

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法取山楂酒，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚的含量（以每100 mL 酒中所含沒(méi)食子酸mg數(shù)表示）。

1.2.4.4 花色苷測(cè)定

采用pH 示差法[9]，制備pH1.0 和pH4.5 的緩沖溶液。

取測(cè)總酚處理好的山楂酒1 mL，分別用pH1.0和pH4.5的緩沖溶液定容至10 mL，分別在520 nm、700 nm 處測(cè)其吸光度，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值。

式 中：A=（A520 nm-A700 nm）pH1.0-（A520 nm-A700 nm）pH4.5；MW 為矢車菊-3-葡萄糖苷的分子質(zhì)量449.2；DF 為稀釋倍數(shù)10；B 為矢車菊-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)26900；L為比色皿光程（1 cm）。

1.2.4.5 抗氧化性測(cè)定

（1）DPPH：取1 mL 山楂酒與3 mL DPPH 溶液充分搖勻避光，37 ℃水浴30 min 后在517 nm 處測(cè)定其吸光值，同時(shí)以蒸餾水代替樣品做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以樣品和無(wú)水乙醇混合液作為樣品調(diào)零，以蒸餾水和無(wú)水乙醇混合液作為空白對(duì)照調(diào)零。

（2）ABTS：取1 mL 山楂酒液與3 mL ABTS 工作液，混合10 s 后在暗處準(zhǔn)確反應(yīng)6 min，在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。同時(shí)以蒸餾水代替樣品做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以樣品和蒸餾水混合液作為樣品調(diào)零，以4 mL的蒸餾水為空白作為空白對(duì)照調(diào)零[10]。

（3）總抗氧化能力的測(cè)定（T-AOC）：利用總抗氧化能力測(cè)定試劑盒測(cè)定，將釀造好的山楂酒，用離心機(jī)4000 r/min離心10 min，取上清液，作為待測(cè)樣品，按照樣品與雙蒸水1∶9 處理，按照試劑盒說(shuō)明書操作。

單位定義及計(jì)算公式：

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

文中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為三次試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值；使用DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂酒香氣成分的GC-MS總體檢測(cè)結(jié)果

表1 為香氣成分的GC-MS 分析結(jié)果。成分鑒定根據(jù)質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索同時(shí)與NIST11.L 質(zhì)譜庫(kù)相對(duì)比，并結(jié)合人工圖譜解析及資料分析，確認(rèn)揮發(fā)性物質(zhì)的各化學(xué)成分，按峰面積歸一化法求得各組分相對(duì)質(zhì)量百分含量[11]。

表1 山楂酒香氣成分的GC-MS檢測(cè)結(jié)果

酒體香氣成分主要由酯類、醇類、酸類、醛類等化合物構(gòu)成，這些不僅是酒體質(zhì)量的重要組成部分，還對(duì)酒的感官特征有重要影響[12]。本實(shí)驗(yàn)共鑒定出77種芳香成分，用SPME技術(shù)萃取果酒香氣和GC-MS 技術(shù)可檢測(cè)鑒定山楂酒預(yù)處理后88 %以上的香氣成分，主要香氣種類及含量見(jiàn)表1。山楂酒的香氣成分中醇類物質(zhì)相對(duì)含量最高。對(duì)照組山楂酒鑒定到的香氣有57 種，其中醇類物質(zhì)18 種，相對(duì)含量為50.14 %；酯類物質(zhì)16 種，相對(duì)含量為32.24 %；酸類物質(zhì)11 種，相對(duì)含量為6.95 %；醛類物質(zhì)6 種，相對(duì)含量為1.81 %；酚類物質(zhì)2 種，相對(duì)含量為2.65 %；其他物質(zhì)4 種，相對(duì)含量為0.91%。水浴組山楂酒鑒定到的香氣只有51種，其中醇類物質(zhì)17 種，相對(duì)含量為56.87 %；酯類物質(zhì)16 種，相對(duì)含量為16.69 %；酸類物質(zhì)7 種，相對(duì)含量為9.42 %；醛類物質(zhì)7 種，相對(duì)含量為2.26%；酚類物質(zhì)3 種，相對(duì)含量為3.2%；其他物質(zhì)1 種，相對(duì)含量為0.58 %。微波組山楂酒鑒定到的香氣為55種，其中醇類物質(zhì)17 種，相對(duì)含量為55.22%；酯類物質(zhì)15 種，相對(duì)含量為18.3%；酸類物質(zhì)9 種，相對(duì)含量為9.09%；醛類物質(zhì)8 種，相對(duì)含量為1.15%；酚類物質(zhì)2 種，相對(duì)含量為4.3%；其他物質(zhì)4 種，相對(duì)含量為0.64%。

2.2 醇類組分比較分析

山楂酒中的主要香氣成分是醇類物質(zhì)，是酵母細(xì)胞分解氨基酸或糖類物質(zhì)產(chǎn)生的次級(jí)產(chǎn)物，在果酒香氣中起到十分重要的作用[13]。由表2 可知，上述3 種方法中，醇類物質(zhì)含量最高，其中對(duì)照組的醇類相對(duì)含量為50.14 %，水浴組醇類相對(duì)含量為56.87%，微波組醇類相對(duì)含量為55.22%。

表2 三組山楂酒中香氣組成及含量

2.3 酯類組分比較分析

酯類化合物是構(gòu)成酒體果香和酒香的重要物質(zhì)，主要有3 種來(lái)源：一是存在于水果原料中構(gòu)成果香的酯；二是在發(fā)酵過(guò)程中酵母菌細(xì)菌活動(dòng)形成的酯；三是來(lái)源于貯存過(guò)程中的酯化反應(yīng)[14]。本實(shí)驗(yàn)在山楂酒揮發(fā)性物質(zhì)中對(duì)照組檢出16 種，水浴組檢出16 種，微波組檢出15 種。對(duì)照組山楂酒中乙酸異戊酯15.22 %，辛酸乙酯8.49 %，己酸乙酯2.23 %；水浴組山楂酒中辛酸乙酯9.36 %，己酸乙酯3.57 %；微波組山楂酒中辛酸乙酯8.39 %，己酸乙酯2.66%，乙酸己酯2.39%等。各酯類含量相差不大，但對(duì)果酒的香味具有十分重要的影響。

2.4 酸類組分比較分析

適量的有機(jī)酸使果酒口感清爽，若缺乏酸類，果酒就會(huì)顯得黏稠，而過(guò)量的酸會(huì)使口感粗糙、不柔和、不協(xié)調(diào)，合適的糖酸比對(duì)酒體平衡以及滋味起著重要作用。有機(jī)酸能抑制大部分引起果酒腐敗變質(zhì)的有害微生物的繁殖[15]。表2 顯示，本實(shí)驗(yàn)在山楂酒揮發(fā)性物質(zhì)中對(duì)照組檢出11 種，水浴組檢出7 種，微波組檢出9 種。對(duì)照組山楂酒中辛酸3.56 %，3-乙烯乙酸1.71 %；水浴組山楂酒中3-乙烯乙酸4.55 %，辛酸3.77 %；微波組山楂酒中辛酸3.53%，4-乙烯乙酸3.45%。

2.5 其他種類組分比較分析

山楂酒中的揮發(fā)性成分除去已經(jīng)檢出的醇類化合物、酯類化合物和酸類化合物外，還檢測(cè)出少量醛類物質(zhì)、酚類物質(zhì)以及其他種類香氣成分，如1-Octanal 辛醛、Asparagine 天冬酰胺等。這些物質(zhì)含量較低，閾值相對(duì)較低，但對(duì)山楂酒的獨(dú)特香氣具有十分重要的影響[16]。

2.6 預(yù)處理對(duì)總酚和花色苷含量的影響

經(jīng)過(guò)不同處理后的山楂酒中總酚含量如圖1所示。從圖1 可看出，與未處理的山楂酒相比，不同處理方法對(duì)山楂酒中總酚含量均有顯著的影響(P＜0.05)。酚類物質(zhì)也會(huì)影響木瓜酒的品質(zhì)，改變其口感、風(fēng)味、色澤等[17]。由于山楂酒中酚類化合物的存在，使山楂酒具有抗氧化性，這些物質(zhì)含量的多少直接影響山楂酒抗氧化性的強(qiáng)弱。在發(fā)酵過(guò)程中，總酚和黃酮的含量先上升后下降，是因?yàn)榻湍杆a(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物與酒中的總酚和黃酮物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)[18]；酚類物質(zhì)被微生物產(chǎn)生的酶降解而沉淀，也導(dǎo)致其含量的減少。由圖1 可知，發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)照組中總酚含量為234.92 mg/100 mL，水浴組中總酚含量為297.44 mg/100 mL，微波組中總酚含量為214.40 mg/100 mL。相比之下，經(jīng)水浴處理的山楂酒中總酚含量相對(duì)較高。

圖1 山楂酒發(fā)酵及貯藏期間酚類物質(zhì)變化

山楂酒經(jīng)過(guò)不同處理后的花色苷含量如圖1所示。從圖1 可以看出，山楂酒中花色苷含量變化趨勢(shì)與總酚變化規(guī)律一致，與未處理的山楂酒相比，不同處理方式對(duì)其花色苷含量均有顯著的影響(P＜0.05)[19]?；ㄉ諡樗苄晕镔|(zhì)，更易被山楂酒中的酒精溶解，在發(fā)酵過(guò)程中，山楂果實(shí)中的花色苷轉(zhuǎn)移到發(fā)酵液中，使得山楂酒中花色苷的含量急劇上升，達(dá)到最高花色苷含量?；ㄉ找资艿焦?、pH 值、溫度等影響分解，所以，花色苷的含量在發(fā)酵結(jié)束后有所減少。由圖1 可知，當(dāng)發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)照組中花色苷含量為5.71 mg/L，水浴組中花色苷含量為7.03 mg/L，微波組中花色苷含量為5.81 mg/L。相比之下，經(jīng)水浴處理的山楂酒中花色苷含量相對(duì)較高。

2.7 不同預(yù)處理對(duì)山楂酒抗氧化性的影響

2.7.1 自由基清除率的比較

經(jīng)過(guò)不同預(yù)處理的山楂酒DPPH 自由基清除活性結(jié)果及ABTS自由基的清除能力如圖2所示。

圖2 不同處理方式后山楂酒DPPH法、ABTS法自由基清除率

從圖2 可以看出，未處理山楂酒及不同預(yù)處理后山楂酒對(duì)DPPH 自由基均具有很好的清除活性，不同處理方式也均具有很好的ABTS 自由基清除能力。Hanula 等[20]的研究結(jié)果表明，微波技術(shù)的應(yīng)用縮短了時(shí)間，保證了總酚類化合物的高含量和強(qiáng)的抗氧化活性。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，三組DPPH 法自由基清除率均為84 %，利用ABTS 法得出自由基清除率，對(duì)照組和微波組組均為69 %，水浴組為70 %，利用T-AOC 法得出總抗氧化能力對(duì)照組為146 unit/mg，微波組為153 unit/mg，水浴組161 unit/mg；當(dāng)發(fā)酵結(jié)束后貯藏4 個(gè)月時(shí)，利用DPPH 法得出自由基清除率，對(duì)照組為69 %，水浴和微波組均為79%，利用ABTS 法得出自由基清除率，對(duì)照組和微波組組均為75 %，水浴組為77 %，利用T-AOC 法得出總抗氧化能力為對(duì)照組142 unit/mg，微波組134 unit/mg，水浴組148 unit/mg。根據(jù)以上數(shù)據(jù)可知，經(jīng)水浴處理的山楂釀造的山楂酒對(duì)自由基具有較好的清除能力，微波以及未處理的山楂酒對(duì)自由基的清除能力較弱。

2.7.2 總抗氧化能力分析

由圖3 可知，不同預(yù)處理后的山楂酒在發(fā)酵及貯藏期間的抗氧化能力存在明顯差異。水浴組山楂酒的抗氧化能力整體強(qiáng)于微波組和對(duì)照組山楂酒的抗氧化能力，具有較強(qiáng)的抗氧化性。這是由于水浴處理的山楂，經(jīng)發(fā)酵釀造而成的山楂酒中總酚和花色苷的含量相對(duì)較高。總酚和花色苷是山楂酒中主要的抗氧化物質(zhì)，山楂酒中抗氧化物質(zhì)的含量較高，對(duì)氧自由基的清除能力有所加強(qiáng)，氧自由基的清除率也相對(duì)較高，與2.7.1 中結(jié)論一致。所以，水浴組山楂酒的抗氧化能性相對(duì)最強(qiáng)。

圖3 山楂酒發(fā)酵及貯藏期間總抗氧化能力變化

利用T-AOC 法測(cè)定三組山楂酒發(fā)酵及貯藏期間的抗氧化能力，并對(duì)山楂酒的抗氧化能力與其總酚含量的相關(guān)性進(jìn)行分析。從圖4 可以看出，對(duì)照組山楂酒的抗氧化能力與其總酚含量(r=0.835，P＜0.05)，水浴組山楂酒的抗氧化能力與其總酚含量(r=0.947，P＜0.01)和微波組山楂酒的抗氧化能力與其總酚含量(r=0.781，P＜0.05)均具有顯著相關(guān)性，說(shuō)明山楂酒中的總酚是其發(fā)揮抗氧化性的主要活性物質(zhì)。Wojdylo 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，微波和水浴處理的葡萄酒多酚含量整體高于對(duì)照組，具有更強(qiáng)的抗氧化能力。

圖4 山楂酒中總酚含量與抗氧化能力之間關(guān)系

3 結(jié)論

不同方法對(duì)山楂進(jìn)行預(yù)處理，GC-MS 檢測(cè)到的香氣成分種類和相對(duì)含量均不同，預(yù)處理后部分香氣種類減少，但主要呈香物質(zhì)得以保留。山楂酒的主要呈香物質(zhì)為醇類，且經(jīng)水浴處理后的山楂酒中醇類物質(zhì)最多，香味最濃。在相同發(fā)酵情況下，水浴處理的山楂酒總酚含量較高，具有較強(qiáng)的抗氧化性。經(jīng)水浴處理的山楂酒在4 個(gè)月貯藏期間酚類物質(zhì)變化較小，抗氧化性相對(duì)較好。因此，經(jīng)過(guò)水浴處理的山楂酒比對(duì)照、微波處理的山楂酒品質(zhì)更高，后期需進(jìn)一步研究其營(yíng)養(yǎng)成分的變化規(guī)律，以綜合評(píng)判預(yù)處理在果酒中的適用性。