宋云蕾，羅 燕

（贛南醫(yī)學院科研中心，江西 贛州 341000）

2020 年全球癌癥統(tǒng)計顯示，在女性癌癥患者中，乳腺癌高居癌癥發(fā)病率及死亡率榜首[1］。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌發(fā)病與遺傳易感性或家族史、懷孕相關(guān)因素、激素治療、生活方式（如肥胖、缺乏運動、酒精攝入和吸煙）等有關(guān)[2-3］。盡管乳腺癌患者通過預防、早期發(fā)現(xiàn)和及時治療，死亡率有所下降，但乳腺癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移仍是威脅女性健康的重要因素[4-5］。因此，尋找乳腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子標志物，將有助于乳腺癌的診斷、靶向治療及預后。

規(guī)律的體育鍛煉對健康有諸多益處，能夠降低患肺癌、前列腺癌和乳腺癌等多種癌癥的風險[6-7］。研究發(fā)現(xiàn)，定期鍛煉的女性患癌風險顯著降低[8-9］；此外，經(jīng)常運動還能提高乳腺癌患者的生存率[10］。然而規(guī)律性體育鍛煉的抗癌作用所涉及的確切機制尚不清楚。運動時肌肉釋放一種叫肌動因子的蛋白質(zhì)到血液中，并輸送到身體不同組織發(fā)揮作用。由骨骼肌產(chǎn)生的主要肌動因子包括白細胞介素6和白細胞介素15、腫瘤生長抑素、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和鳶尾素[11-12］。這些肌動因子可通過旁分泌、自分泌等方式作用于靶細胞[13］。鳶尾素是由BOSTR?M P 等[14］發(fā)現(xiàn)的由運動后誘導產(chǎn)生的纖維連接蛋白Ⅲ結(jié)構(gòu)域蛋白5（Fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5，F(xiàn)NDC5）經(jīng)水解酶水解所產(chǎn)生。鳶尾素能將白色脂肪轉(zhuǎn)化為棕色脂肪，通過產(chǎn)生熱量釋放能量，并對心腦血管、非酒精性脂肪肝及腫瘤等疾病有治療作用[15］。研究表明，F(xiàn)NDC5在卵巢、睪丸、胰腺、肝臟、脾臟、胃、脂肪、心臟、腎臟、肺、前列腺、腸和胸腺組織中均有表達[16-17］。FNDC5 能夠有效抑制乳腺癌細胞增殖和遷移且不影響非癌細胞生長[18］，也能夠抑制肺癌細胞、骨肉瘤細胞增殖和遷移[19-20］。綜上所述，F(xiàn)NDC5 可能作為一種潛在的乳腺癌治療靶點。然而，F(xiàn)NDC5 在乳腺癌中的研究仍有限，且FNDC5的表達與乳腺癌患者生存的關(guān)系尚不清楚，亟待進一步探究。

越來越多的證據(jù)表明，表觀遺傳變化可以改變腫瘤發(fā)生過程中的生理和病理過程，并可作為癌癥診斷和預后新的生物標志物[21-22］。DNA 甲基化在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[23］。DNA 甲基化是指甲基結(jié)合到胞嘧啶上的現(xiàn)象，且在該胞嘧啶核苷酸后面直接跟著鳥嘌呤（CpG 島）[24］。CpG 島的甲基化通常影響抑癌基因的表達，參與癌癥的發(fā)生發(fā)展[25］。BRCA1 甲基化程度與乳腺癌較好的預后呈正相關(guān)[26］，抑制MAGI2 甲基化則能抑制Wnt/β-catenin 信號通路，抑制乳腺癌細胞增殖和遷移[27］。除此以外，microRNA 是18～25 個核苷酸長的單鏈非編碼RNA，調(diào)控多種癌癥相關(guān)信號通路中基因的表達[28］。microRNA-21 高表達促進乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[29］，而microRNA-424（322）/503 低表達則與較差的預后、較低的生存率及惡性程度更高的腫瘤分型相關(guān)[30］。然而，截至目前，尚未有研究表明FNDC5在乳腺癌中的表達是否與其DNA 甲基化和microRNA的表觀遺傳改變相關(guān)。本研究將進一步探究表觀遺傳對FNDC5的調(diào)節(jié)作用。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源FNDC5 在不同類型腫瘤中的表達數(shù) 據(jù) 來 源 于TCGA （https：//tcga. xenahubs. net）和GTEx （http：//commonfund. nih. gov/GTEx/），乳 腺 癌患者血清中mir-4323、mir-4692、mir-4514 表達數(shù)據(jù)來源于GEO 數(shù)據(jù)庫中的GSE73002 數(shù)據(jù)集，F(xiàn)NDC5與mir-4323、mir-4692 表達的相關(guān)性分析數(shù)據(jù)來源于TCGA 數(shù)據(jù)庫的RNA-seq 和miRNA-seq 數(shù)據(jù)集，乳腺癌GSEA數(shù)據(jù)來源于METABRIC數(shù)據(jù)集。

1.2 方法

1.2.1 表達分析使用Tumor Immune Estimation Resource （TIMER）[31］分析泛癌中FNDC5基因表達。使 用bc-GenExMiner v4.9[32］（http：//bcgenex. ico.unicancer.fr/BC-GEM/）分析乳腺癌中FNDC5 mRNA表達與特異性臨床病理特征，包括年齡、雌激素受體（Estrogen receptor，ER）、孕激素受體（Progesterone receptor，PR）、表皮生長因子受體-2（Human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、淋巴結(jié)狀態(tài)、組織學類型、Scarff-Bloomm-Richardson（SBR）分級、基底樣狀態(tài)和三陰性狀態(tài)的關(guān)系。通過cBioPortal（http：//www. cbioportal. org/）檢 測FNDC5 mRNA 表達與FNDC5 甲基化的相關(guān)性，并使用UALCAN[33］（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）檢測正常乳腺組織和乳腺癌中FNDC5啟動子甲基化水平以及microRNA表達。使用R軟件（版本4.3.0）對GSE73002 數(shù)據(jù)集進行分析，用corrplot 包進行FNDC5與mir-4323、mir-4692表達的相關(guān)性分析。

1.2.2 生存分析使用Kaplan-Meier Plotter[34］（http：//kmplot. com/analysis/） 獲得 FNDC5 及microRNA 的生存曲線。通過Survival Meth（http：//bio-bigdata. hrbmu. edu. cn/ survival meth/）檢測FNDC5甲基化生存曲線。

1.2.3 microRNA 預測通 過DIANA-micro T（http：//diana. imis. athena-innovation. gr/DianaTools/）、miR Walk（http：//mirwalk. umm. uni-heidelberg. de/）和miR TarBase（https：//mirtarbase.cuhk.edu. cn/）預測靶向FNDC5的microRNA。

1.2.4 GSEA 分析用GSEA 4.3.2 進行分析，KEGG、HALLMARK 和GO 基因集從基因集富集分 析 網(wǎng) 站[35］（https：//www. gsea-msigdb. org/gsea/downloads.jsp）獲得。

1.2.5 共表達分析FNDC5 共表達基因用cBioPortal 篩選（乳腺癌數(shù)據(jù)為TCGA，F(xiàn)irehose Legacy），Spearman 相關(guān)r≥0.3 或≤-0.3。通過STRING（https：//cn.string-db.org/）進行共表達網(wǎng)絡、共表達基因的GO 和KEGG 分析以及FNDC5 相互作用網(wǎng)絡。采用TIMER 對PPARGC1A、LEP、UCP1、MENTRL等FNDC5相關(guān)基因進行散點圖分析。

1.2.6 統(tǒng)計學處理FNDC5 表達數(shù)據(jù)經(jīng)log2 變換歸一化處理。正常乳腺組織和乳腺癌標本采用雙尾t檢驗進行比較。采用Bc-Gen ExMiner 的Welch′s和Dunnett-Tukey-Kramer′s 試驗進行差異基因表達分析和臨床參數(shù)相關(guān)性分析。所有基因生存分析均采用Cox 比例風險回歸分析、KM 分析和Log-rank檢驗。采用Spearman 檢驗和Pearson 檢驗分析兩個變量之間的相關(guān)性。采用局部統(tǒng)計量、全局統(tǒng)計量、加權(quán)Kolmogorov-Smirnov-like 統(tǒng)計量和多元假設(shè)檢驗對GSEA進行分析。以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌中FNDC5 表達FNDC5 在乳腺癌、膀胱尿路上皮癌、膽管癌、結(jié)腸腺癌等癌組織中的表達水平低于正常組織（圖1A）。TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫的mRNA陣列表達數(shù)據(jù)及bc-Gen ExMiner v4.9的RNA-seq 數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)NDC5 mRNA 在乳腺癌組織中的表達低于正常乳腺組織（P＜0.000 1，圖1B、圖1C）。FNDC5在三陰性乳腺癌（TNBC）中的表達低于正常乳腺組織（P＜0.01）和癌旁組織（P＜0.000 1）（圖1D）。

圖1 FNDC5在乳腺癌中的表達

2.2 乳腺癌中FNDC5 表達與臨床參數(shù)的相關(guān)性FNDC5表達在≤51歲組與＞51歲組之間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 2，圖2A），且≤51 歲組的中位數(shù)低于＞51 歲組。相比ER 陽性、PR 陽性、HER2 陰性、淋巴結(jié)陰性乳腺癌樣本，ER 陰性、PR 陰性、HER2 陽性、淋巴結(jié)陽性乳腺癌樣本FNDC5 表達均較低（P＜0.000 1，圖2B、圖2C、圖2D、圖2E）。在不同組織學類型的乳腺癌樣本中，微乳頭狀癌（Micropapillary）FNDC5 的表達低于浸潤性導管癌（Invasive ductal carcinoma，IDC）、浸潤性小葉癌（Invasive lobular carcinoma，ILC）和黏液癌（Mucinous）（P＜0.000 1，圖2F）。FNDC5 在SBR分級晚期乳腺癌樣本中的表達降低（P＜0.000 1，圖2G），在基底樣乳腺癌（BLBC）和三陰性乳腺癌（TNBC）樣本中的表達低于非基底樣乳腺癌（Non-BLBC）和非三陰性乳腺癌（Non-TNBC）（P＜0.000 1，圖2H、圖2I）。

圖2 乳腺癌中FNDC5的表達

2.3 乳腺癌中FNDC5 表達與患者預后相關(guān)性FNDC5 mRNA 高表達與乳腺癌患者的無遠處轉(zhuǎn)移生存期（P=0.006 1，圖3A；P=0.007 9，圖3B）、無復發(fā)生存期（P=0.000 8，圖3C；P＜0.000 1，圖3D）、總生存期（P=0.003 8，圖3E）和進展后生存期（P=0.043，圖3F）的良好預后顯著相關(guān)。

圖3 Kaplan-Meier Plotter繪制的乳腺癌患者FNDC5表達生存曲線

2.4 乳腺癌中FNDC5 表達與啟動子甲基化水平的相關(guān)性在TCGA 乳腺癌數(shù)據(jù)中，F(xiàn)NDC5 mRNA的低表達與FNDC5 甲基化之間具有相關(guān)性（P＜0.05，圖4A），而METABRIC 數(shù)據(jù)中顯示，F(xiàn)NDC5 mRNA 的低表達與FNDC5 甲基化之間無相關(guān)性（P＞0.05，圖4B）。

圖4 乳腺癌中FNDC5 mRNA表達與甲基化相關(guān)性

2.5 乳腺癌中FNDC5 啟動子甲基化水平與患者預后相關(guān)性與正常乳腺組織相比，乳腺癌中FNDC5 啟動子甲基化水平較低（P＜0.000 1，圖5A），同時，乳腺癌患者生存率與FNDC5甲基化水平無相關(guān)性（圖5B）。

圖5 乳腺癌中FNDC5甲基化表達與生存相關(guān)性

2.6 乳腺癌中FNDC5 的下調(diào)可能與乳腺癌中mir-4323 和mir-4692 相 關(guān)使用3 個microRNA 數(shù)據(jù)庫分別預測有210 個microRNA（DIANA-microT）、2 034 個microRNA（miRWalk）和22 個microRNA（miRTarBase）靶向FNDC5。其中三者交集的3 個microRNA 是mir-4323、mir-4692 和mir-4514（圖6A）。在GSE73002數(shù)據(jù)集中，3個microRNA 在乳腺癌患者中表達高于正常乳腺組織（P＜0.000 1，圖6B）。從TCGA 的泛癌數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NDC5 的表達與mir-4692的表達呈正相關(guān)（r=0.366，P＜0.001，圖6C），與mir-4323 的表達呈負相關(guān)（r=-0.111，P＜0.001，圖6C）。此外，mir-4323和mir-4692是乳腺癌預后不良標志物（P＜0.000 1，圖7A、圖7B）。

圖6 乳腺癌中FNDC5相關(guān)microRNA的預測交集以及mir-4323、mir-4692的表達

圖7 乳腺癌中mir-4323、mir-4692的生存曲線

2.7 FNDC5 與乳腺癌進展相關(guān)GSEA 分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌FNDC5 富集在與乳腺癌進展相關(guān)的通路，如Hedgehog信號通路、焦黏、鈣信號通路、ECM受體相互作用、血管平滑肌收縮、基底細胞癌、TGF-β信號通路、NOTCH 信號、纖維細胞生長因子受體結(jié)合通路等（圖8）。從TCGA 乳腺癌數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NDC5 與222 個基因表達相關(guān)（圖9A）。這些相關(guān)基因富集于細胞周期、細胞外基質(zhì)、含膠原細胞外基質(zhì)、細胞外基質(zhì)組織通路等（圖9B）。其中，在乳腺癌中，F(xiàn)NDC5 與PPARGC1A（r=0.172，P＜0.000 1，圖9C）、LEP（r=0.205，P＜0.000 1，圖9D）、UCP1（r=0.168，P＜0.000 1，圖9E）、METRNL（r=0.102，P=0.000 7，圖9F）、FGF21（r=-0.074，P=0.013 8，圖9G）、MSTN（r=0.198，P＜0.000 1，圖9H）、ADIPOQ（r=0.242，P＜0.000 1，圖9I）和PRDM16（r=0.276，P＜0.000 1，圖9J）等基因表達顯著相關(guān)。

圖8 乳腺癌中FNDC5基因富集分析（GSEA）結(jié)果

圖9 乳腺癌中FNDC5表達相關(guān)基因及其富集結(jié)果

3 討論

乳腺癌已成為2020 年全球癌癥發(fā)病率的第一大原因和死亡率的第五大原因，給社會帶來了巨大負擔[1］。迫切需要對乳腺癌的治療進行適當干預。研究表明，經(jīng)常鍛煉可以降低患乳腺癌的風險[6-9］。研究運動過程中產(chǎn)生的大量肌動因子[12］對乳腺癌的影響，可為乳腺癌的防治提供幫助。

鳶尾素最早被發(fā)現(xiàn)是一種由運動誘發(fā)產(chǎn)生的肌動因子，可將白色脂肪轉(zhuǎn)化為棕色脂肪[14］，是一種由FNDC5基因編碼的分子量為12 kD 的蛋白，可被分泌到血液[14］、腦脊液[36］和支氣管肺泡灌洗液[37］中。研究表明，鳶尾素具有抗腫瘤[20］、抗心血管疾病[38］和抗神經(jīng)退行性疾病[39］的特性。鳶尾素的抗腫瘤特性已在體外研究中得到證實，該研究發(fā)現(xiàn)鳶尾素通過觸發(fā)細胞凋亡和抑制NF-κB 活性抑制惡性乳腺癌細胞系遷移和增殖[18］。此外，有學者采集了101 例女性乳腺癌患者和51 例健康對照者血液樣本，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清中鳶尾素濃度低于健康對照者，惡性程度高的乳腺癌患者血清中的鳶尾素含量明顯低于惡性程度低的乳腺癌患者，這表明鳶尾素的濃度與腫瘤分期有關(guān)[40］。與此同時，研究發(fā)現(xiàn)有脊柱轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者血清中鳶尾素水平明顯低于無脊柱轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，在調(diào)整BMI 和年齡后，鳶尾素是乳腺癌的獨立預后因素[41］。表明血清中高水平的鳶尾素可能是乳腺癌患者脊柱轉(zhuǎn)移的保護因素。因此，推測FNDC5與乳腺癌的預后密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中FNDC5 mRNA水平低于正常乳腺組織。FNDC5 mRNA 表達水平與乳腺癌的嚴重程度呈負相關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)FNDC5低表達組復發(fā)風險較高，生存率較差。

DNA 甲基化對乳腺癌的預后有重要影響，并影響乳腺癌的進展[42-43］；值得注意的是，血液中的DNA甲基化水平在浸潤性乳腺癌被檢測到前就已經(jīng)開始發(fā)生變化[44］。DNA 甲基化是表觀遺傳變化，指在不改變DNA 序列的情況下改變基因的表達[45］。正常情況下，基因啟動子區(qū)域的CpG 島通常未被甲基化。然而，在病理條件下，CpG島的甲基化水平可以被改變，進而調(diào)控靶基因的表達[46］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺組織相比，乳腺癌組織中FNDC5的甲基化水平較低，F(xiàn)NDC5 的低表達與其甲基化應該相關(guān)性不大，后續(xù)METABRIC 數(shù)據(jù)中證實了這點。而乳腺癌組織中FNDC5 mRNA 表達水平較低可能與mRNA表達調(diào)控機制的復雜性有關(guān)，考慮到microRNA可以調(diào)控基因表達水平。因此，本研究進一步探索可以調(diào)控FNDC5 mRNA 表達并影響乳腺癌進展的microRNA。已有研究[19，47-54］表明，在某些疾病中，F(xiàn)NDC5基因表達與特異性microRNA 有關(guān)。METWALLY M 等[52］發(fā)現(xiàn)，在嚴重的肝脂肪變性中，miR-135a-5p 下調(diào)FNDC5 mRNA 的表達。此外，miR-214-3p靶向FNDC5，可減輕FNDC5的抗腫瘤特性[19］。然而，迄今為止，已發(fā)表的與FNDC5 相關(guān)的特異性microRNA 是否干預乳腺癌中FNDC5 的表達尚未見報道。本研究利用3 個microRNA 數(shù)據(jù)庫推測出mir-4323 和mir-4692 可能是乳腺癌患者FNDC5 mRNA 的調(diào)節(jié)因子，但仍需要進一步研究證明這一點。最近的研究表明，F(xiàn)NDC5 可能參與腫瘤微環(huán)境、腫瘤生長、免疫細胞和腫瘤細胞增殖[20］。通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NDC5可能通過調(diào)控Hedgehog信號通路、焦黏、鈣信號通路、ECM 受體相互作用、血管平滑肌收縮、基底細胞癌、TGF-β 信號通路、NOTCH 信號通路和成纖維細胞生長因子受體結(jié)合通路，影響乳腺癌的進展和轉(zhuǎn)移。提示FNDC5在乳腺癌的臨床治療上具有潛在的意義。

然而，本研究有一些局限性。首先，乳腺癌患者的生活方式并沒有被考慮在內(nèi)。由于FNDC5 的表達水平與運動密切相關(guān)，為了獲得更精確的結(jié)果，未來有必要進行進一步的研究，包括不同生活方式的患者。其次，預測出mir-4323 和mir-4692 靶向FNDC5 mRNA 在乳腺癌中的作用還需要更多的實驗證明。第三，生物信息學預測出的FNDC5調(diào)控乳腺癌進展的相關(guān)機制仍需進一步研究。