向禮波 袁斌 薛敏峰 史文琦 曾凡松 楊立軍 龔雙軍
關(guān)鍵詞:小麥白粉菌;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增;靈敏度;特異性;快速檢測(cè)
白粉病是一種真菌病害,影響近10000種被子植物,其中包括許多具有重要經(jīng)濟(jì)意義的栽培植物,如觀賞植物,果樹(shù)和谷物。大多數(shù)白粉病是由子囊菌亞門Ascomycota白粉菌屬Erysiphe真菌所引起,包括大約820種。谷物類白粉病是由禾布氏白粉菌Blurn.eria gra-rninis引起的,僅在禾本科的雜草和栽培谷物中發(fā)現(xiàn)。經(jīng)濟(jì)上最重要的是小麥和大麥的白粉病,小麥白粉病在世界許多降雨量大的海洋或半大陸性氣候地區(qū)造成重大產(chǎn)量損失。病害防治的主要措施是種植抗性品種和施用殺菌劑。小麥白粉病屬于氣傳性病害,對(duì)小麥生產(chǎn)的威脅主要來(lái)自于春季流行區(qū),因此,在早春季節(jié)對(duì)菌源進(jìn)行檢測(cè)是開(kāi)展病害預(yù)警的關(guān)鍵環(huán)節(jié),也可為化學(xué)防治提供科學(xué)依據(jù)。目前生產(chǎn)上主要通過(guò)孢子捕捉器和植保人員田間隨機(jī)調(diào)查對(duì)白粉病進(jìn)行監(jiān)測(cè),但該方法費(fèi)時(shí)且起不到早期預(yù)警作用,因此,在生產(chǎn)中急需一種實(shí)用、操作簡(jiǎn)便且快速準(zhǔn)確的小麥白粉病菌早期檢測(cè)方法。
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop mediated isothermal am-plification,LAMP)技術(shù)是Notomi等2000年開(kāi)發(fā)的一種恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。該方法針對(duì)目的基因序列的特異性區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)外部引物和一對(duì)內(nèi)部引物,在具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶催化作用下,在15~60min內(nèi)能夠產(chǎn)生大量多環(huán)花椰菜結(jié)構(gòu)的DNA片段混合物。該技術(shù)憑借著靈敏度高、不需要特殊和昂貴的儀器、直接在反應(yīng)體系中加入染料根據(jù)顏色的變化檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各類病原微生物、食品微生物和轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)。
國(guó)內(nèi)外已開(kāi)發(fā)出多種檢測(cè)白粉菌的分子方法。Mori等以核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internaltranscribed spacer,ITS)為靶標(biāo)序列設(shè)計(jì)引物將白粉菌屬分成5個(gè)譜系。Zeng等用小麥白粉菌的ITS序列開(kāi)發(fā)出小麥白粉菌的常規(guī)PCR、巢式PCR檢測(cè)體系,并用不同地區(qū)采集的小麥白粉病樣驗(yàn)證開(kāi)發(fā)的PCR檢測(cè)體系,發(fā)現(xiàn)巢式PCR的靈敏度高于常規(guī)PCR。Zheng等利用小麥白粉菌ITS序列篩選出特異性引物Bgt-F/Bgt-R并建立了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系,檢測(cè)的靈敏度為0.1pg,比常規(guī)PCR高100倍,并且從接種ld的發(fā)病葉片中成功檢測(cè)出小麥白粉菌。以上這些已開(kāi)發(fā)的分子檢測(cè)方法均是基于PCR建立的變溫核酸擴(kuò)增技術(shù),儀器昂貴、操作繁復(fù)、耗時(shí)較長(zhǎng),不適合在基層植保站應(yīng)用和推廣。而針對(duì)小麥白粉菌的LAMP檢測(cè)技術(shù)目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬以小麥白粉菌基因組中特有效應(yīng)子基因BGT96224V316-LO-CUS1725(GenBank: VCU40465.1)為靶標(biāo)序列,篩選合適的LAMP引物,并建立小麥白粉菌的LAMP檢測(cè)技術(shù),旨在為準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的小麥白粉病早期監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持。
1材料與方法
1.1供試材料
本研究中所用的菌株包括10株中國(guó)小麥白粉菌,分別來(lái)自陜西(5-83,6-69)、湖北(11-61,11-99)、安徽(17-18,17-40)、江蘇(21-2,24-4)、新疆(49-1,50-2)和1株瑞士小麥白粉菌(96224),共計(jì)1 1株。小麥白粉菌均采用小麥離體葉段方法進(jìn)行保存和擴(kuò)繁。另有7種其他白粉菌(表1),分別采集于當(dāng)?shù)厣L(zhǎng)季節(jié)發(fā)病的不同寄主植物,帶回實(shí)驗(yàn)室用原寄主植物進(jìn)行菌株擴(kuò)繁。1株可培養(yǎng)病原真菌油菜菌核菌(表1),該菌株的活化培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200g/L,葡萄糖18g/L,瓊脂18g/L)。
1.2DNA的提取
在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)油菜菌核菌至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿,刮取菌絲至2mL的離心管中,液氮速凍后于全自動(dòng)組織研磨儀研磨60s,使用基因組DNA提取試劑盒(D3195-01,Omega Bio-Tek公司)提取真菌基因組DNA。小麥白粉菌和其他7種白粉菌的樣品收集方法如下:首先選取嚴(yán)重發(fā)病的葉片,在超凈臺(tái)中輕輕敲打葉片將抖落的孢子收集到2mL離心管中,再向管中加入7粒直徑為5mm的玻璃珠(Sigma公司,貨號(hào)18406)。DNA的提取參照龔雙軍等的方法進(jìn)行。
1.3LAMP引物設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)NCBI中報(bào)道的瑞士小麥白粉菌菌株96224基因組序列,依靠基因序列比對(duì)分析,選取BGT96224V316_LOCUS1725 (GenBank:
VCU40465.1)為靶標(biāo)序列,利用Primer Explore 5在線軟件(http:∥primerexplorer.
jp/lampv5 e/index.
html)設(shè)計(jì)引物(表2)。
1.4LAMP反應(yīng)體系的特異性檢測(cè)
為檢測(cè)LAMP方法的特異性,分別以9種供試病原菌的gDNA為模板,以1.3篩選到的引物進(jìn)行LAMP反應(yīng),以滅菌超純水為空白對(duì)照。LAMP反應(yīng)體系Betain、40 U BstDNA聚合酶,模板gDNA 1uL,滅菌超純水補(bǔ)足25uL,混勻后于65℃水浴鍋中反應(yīng)60 min,80℃2 min進(jìn)行酶滅活處理,然后向反應(yīng)體系中加入1肛L鈣黃綠素。使用紫外照射裝置(350~370nm)從反應(yīng)試管側(cè)面進(jìn)行觀察。綠色熒光為陽(yáng)性反應(yīng),未發(fā)熒光為陰性反應(yīng)。
1.5LAMP反應(yīng)體系的靈敏度檢測(cè)
對(duì)提取的小麥白粉菌菌株96224基因組DNA,進(jìn)行10倍梯度稀釋,得到3fg/uL~3ng/uL的DNA,進(jìn)行LAMP引物的靈敏度試驗(yàn),以滅菌超純水為空白對(duì)照。觀察反應(yīng)體系顏色的變化,方法同1.4。
1.6發(fā)病小麥葉片中病原菌的LAMP檢測(cè)
為測(cè)定LAMP方法對(duì)發(fā)病葉片中小麥白粉菌的檢測(cè)效果,以滅菌超純水為空白對(duì)照,以未接種小麥葉片為陰性對(duì)照。進(jìn)行如下試驗(yàn)設(shè)置:剪取感病品種‘Chanceller’第一葉中間部分3cm長(zhǎng),葉片正面朝上放在含苯并咪唑(50mg/L)的瓊脂保鮮培養(yǎng)基上,在超凈臺(tái)上收集預(yù)先繁殖好的新鮮分生孢子到無(wú)菌5mL的離心管中,參考史文琦等的方法進(jìn)行接種,調(diào)整白粉菌菌株96224接種濃度為10~20個(gè)/mL,然后將培養(yǎng)皿置于17℃,L∥D=18h∥6h光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在接種后2、4、8、12、24、48、96.120h和144h取樣進(jìn)行檢測(cè)。使用植物基因組DNA提取試劑盒(D3485-01,Omega Bio-Tek公司)提取小麥組織gDNA,將其作為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)。方法同1.4。
2結(jié)果與分析
2.1LAMP引物的設(shè)計(jì)與篩選
以小麥白粉菌菌株96224的DNA為模板,用設(shè)計(jì)的3套引物進(jìn)行引物篩選,結(jié)果如圖1所示,只有引物Bgt-LAMP-1能夠擴(kuò)增出明顯的梯狀條帶,其他引物均無(wú)條帶出現(xiàn)。加入鈣黃綠素?zé)晒馊疽汉?,引物Bgt-LAMP-1反應(yīng)液為綠色,其他引物的反應(yīng)液為橙色,說(shuō)明只有Bgt-LAMP-1可以用于后續(xù)特異性和靈敏性試驗(yàn)。
2.2LAMP反應(yīng)體系的特異性
為了驗(yàn)證LAMP反應(yīng)引物的特異性,對(duì)供試的11株小麥白粉菌菌株和8株對(duì)照菌株進(jìn)行LAMP檢測(cè)。在紫外燈照射下,陽(yáng)性反應(yīng)均為綠色熒光,陰性反應(yīng)和空白對(duì)照均不發(fā)熒光。11株小麥白粉菌菌株的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,檢出率為100%,而8株對(duì)照菌株無(wú)論是專性寄生菌還是腐生菌的檢測(cè)結(jié)果均為陰性,沒(méi)有出現(xiàn)綠色熒光(圖2)。
2.3LAMP反應(yīng)體系的靈敏度
如圖3所示,以提取的小麥白粉菌96224基因組DNA為模板,10倍梯度稀釋,進(jìn)行LAMP反應(yīng)。在紫外光照射下,陽(yáng)性反應(yīng)均為綠色熒光,陰性反應(yīng)和空白對(duì)照均不發(fā)熒光。LAMP能檢測(cè)到濃度為300fg/uL的DNA。
2.4LAMP反應(yīng)體系對(duì)小麥發(fā)病組織的檢測(cè)結(jié)果
提取接種小麥白粉菌2、4、8、12、24、48、96、120h和144h的小麥組織gDNA,進(jìn)行LAMP反應(yīng)后加入鈣黃綠素,在紫外燈照射下,接種4h及以上的小麥發(fā)病組織的LAMP反應(yīng)為呈綠色的陽(yáng)性反應(yīng)(圖4);說(shuō)明該反應(yīng)體系可準(zhǔn)確從發(fā)病小麥葉片中檢測(cè)到小麥白粉菌,可檢測(cè)到小麥白粉菌的最早時(shí)間為侵染4h。
3結(jié)論與討論
本研究以小麥白粉菌專有的效應(yīng)子基因BGT96224V316-LOCUS1725(Bgt-2014)篩選出Bgt-LAMP-1引物對(duì)并建立了小麥白粉菌LAMP檢測(cè)技術(shù)。所建立的體系特異性好,能與其他8種專性寄生菌有效區(qū)分,靈敏度達(dá)到300fg/UL,在接種后4h即可檢測(cè)出小麥白粉菌,而正常肉眼觀察到白粉病的癥狀一般在7d左右,所以該方法為田間白粉病菌的早期監(jiān)測(cè)提供手段,為病害的防治提供科學(xué)依據(jù)。
預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)技術(shù)是準(zhǔn)確防控小麥白粉病,減少農(nóng)藥使用和精準(zhǔn)施用的關(guān)鍵。因此,開(kāi)展小麥白粉病預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)研究,對(duì)于科學(xué)防治小麥白粉病具有重要意義。分子檢測(cè)技術(shù)是預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)的重要手段之一,可為精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)提供分子技術(shù)方案。目前已成功建立了普通PCR、巢式PCR和熒光定量PCR檢測(cè)小麥白粉病的方法,尚沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)LAMP技術(shù)在小麥白粉病上的研究。LAMP檢測(cè)方法多數(shù)是以真菌通用ITS序列作為靶標(biāo),筆者前期根據(jù)小麥白粉病菌ITS序列設(shè)計(jì)的1對(duì)內(nèi)引物和1對(duì)外引物建立的小麥白粉病菌LAMP檢測(cè)體系,不僅能夠檢測(cè)到小麥白粉病菌DNA基因組,同樣也能夠檢測(cè)到大麥、黃瓜和草莓等其他植物白粉病菌DNA基因組,特異性較差。而且ITS已被證明不足以區(qū)分白粉菌的種,而一些持家基因,如肌動(dòng)蛋白(actin)基因,鈣調(diào)蛋白(calmodulin)基因,微小染色體維持蛋白(minichro-mosome maintenance)基因等,在解決這一問(wèn)題上被證明具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究使用以小麥白粉菌特有的效應(yīng)子基因BGT96224V316-LOCUS1725(Bgt-2014)全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)篩選出Bgt-LAMP-1引物對(duì),特異性較好,可用于建立小麥白粉病菌LAMP檢測(cè)體系。本研究的LAMP技術(shù)從接種小麥白粉菌2h的小麥葉片中未能檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果,分析原因可能是接種后2h這一階段仍是接種的分生孢子,接種孢子濃度過(guò)低所以檢測(cè)不到;小麥白粉菌分生孢子萌發(fā)需要4h左右,此時(shí)形成初生芽管并緩慢伸長(zhǎng),小麥葉片中小麥白粉菌的生物量增多達(dá)到檢測(cè)限,所以接種后4h可以檢測(cè)到。
本研究建立的小麥白粉菌LAMP檢測(cè)方法雖然簡(jiǎn)便快速,但仍然很難用于田間地頭的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),主要是核酸提取過(guò)程需要特殊的儀器,例如必須使用離心機(jī),并且步驟較多,所需時(shí)間較長(zhǎng)。下一步將從DNA提取方面優(yōu)化該檢測(cè)方法。目前正在嘗試使用Chelex-IOO提取小麥葉片的DNA,該方法加入堿提取液研磨后直接吸取上清液用于擴(kuò)增反應(yīng),不使用離心機(jī)且提取時(shí)間僅為60min;目前使用的核酸染料鈣黃綠素是一種自發(fā)光熒光染料,在日光下可以自然發(fā)出黃綠熒光,方便觀察結(jié)果。經(jīng)過(guò)以上的優(yōu)化后,小麥白粉菌LAMP檢測(cè)方法將更加簡(jiǎn)便快速,使基層的植保工作者能夠直接在田間地頭開(kāi)展工作。