張俊蕾 蓋曉彤 趙正婷 劉弟 陳敏 姜寧 劉雅婷

關(guān)鍵詞：南美紅辣椒脈斑駁病毒；反轉(zhuǎn)錄一環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增；靈敏度；檢測

南美紅辣椒脈斑駁病毒（chilli veinal mottle vi-rus，ChiVMV）屬于馬鈴薯Y病毒科馬鈴薯Y病毒屬Potyviruts，其基因組由一條正單鏈RNA組成，全長約9700bp。ChiVMV主要依靠各種蚜蟲以非持久性方式傳播。1979年在馬來半島的辣椒上首次發(fā)現(xiàn)了南美紅辣椒脈斑駁病毒；2017年印度辣椒種植地區(qū)感染ChiVMV最嚴(yán)重地塊的感病率高達(dá)41.82%；我國于2003年首次在陜西省的辣椒上發(fā)現(xiàn)ChiVMV；隨后2010年在云南省大理市巍山縣的煙田里發(fā)現(xiàn)煙株受ChiVMV侵害，主要癥狀為褪綠黃化、花葉、皰斑和葉緣下卷；2014年報道稱ChiVMV在四川煙株上的侵染率達(dá)到3%左右；2022年在貴州的煙葉上檢測到ChiVMV。病毒檢測是監(jiān)測、預(yù)報、防控病毒病的重要環(huán)節(jié)。目前檢測ChiVMV的方法主要有電子顯微鏡技術(shù)、免疫血清學(xué)技術(shù)、指示植物檢測技術(shù)以及分子生物學(xué)技術(shù)等，但是這些檢測方法因技術(shù)復(fù)雜、費時費力、成本高等原因難以在基層田間推廣，因此建立一種簡單、快速、靈敏、高效檢測ChiVMV的技術(shù)尤為重要。2000年日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（loop-media-ted isothermal amplification，LAMP）是分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中一種極為重要的手段，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，利用DNA鏈置換聚合酶（Bst DNA polymerase）在等溫條件（65～90℃）保溫幾十分鐘完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，通過熒光染色等方法在數(shù)分鐘內(nèi)即可觀察結(jié)果。但LAMP檢測方法只針對DNA模板，為實現(xiàn)用該方法以RNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，在LAMP反應(yīng)體系中加入反轉(zhuǎn)錄酶，可在某等溫條件下一步進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄和核酸擴(kuò)增，即為反轉(zhuǎn)錄一環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（re-verse transcription， loop-mediated isothermal am-plification，RT-LAMP）。近年來，RT-LAMP已被廣泛應(yīng)用于動植物病毒檢測，與傳統(tǒng)的檢測方法相比，該技術(shù)成本低、靈敏度極高、操作簡單、不需要昂貴的儀器和分析手段，適用于田間基層進(jìn)行病毒檢測。目前還未見利用RT-LAMP技術(shù)檢測ChiVMV的相關(guān)報道，本研究旨在建立一種簡便、快捷、靈敏的ChiVMV檢測方法。

1材料和方法

1.1材料

本試驗所用的ChiVMV、馬鈴薯Y病毒（potatovirus Y，PVY）、煙草花葉病毒（tobacco mosaic vi-rus，TMV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic vlrus，CMV）、番茄褐色皺紋果病毒（tomato brown rugosefruit virus，ToBRFV）、番茄環(huán)紋斑點病毒（tomatozonate spot virus，TZSV）、煙草脈帶花葉病毒（to-bacco vein banding mosaic virus，TVBMV）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）、朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒（hippeastrum chlorotic ringspot vi-rus，HCRV）的陽性煙葉樣品由本課題組純化和保存。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計

依據(jù)GenBank中登錄的云南地區(qū)ChiVMV分離物基因組（GenBank序列登錄號：MT974520）衣殼蛋白（capsid protein，CP）基因的保守區(qū)域，利用Primer Explorer 5.0（http：∥primerexplorer. jp/e/）設(shè)計5組引物（表1），每組包含F(xiàn)3/B3（外引物）、FIP/BIP（內(nèi)引物）和LF/LB（環(huán)引物），引物由成都生物公司合成。

1.2.2RNA的提取

采用TRNzoI Universal總RNA提取試劑盒（北京天根公司）提取病毒總RNA，采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)3條明亮條帶證明所提取RNA質(zhì)量較好，提取的RNA保存于-800C冰箱備用。

1.2.5引物篩選

采用設(shè)計的5組引物（表1），以ChiVMV陽性的煙葉總RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，體系參考WarmStart通用LAMP/RT-LAMP 2×預(yù)混液（含UDG）（美國NewEngland Biolabs公司）說明書：WarmStart LAMP2×Mix 12.5uL，F(xiàn)3/B3（10mmol/L）各0.5uL，F(xiàn)IP/BIP （10mmol/L）各4uL， LF/LB （10 mmol/L）各1uL，RNA（1ug）2uL，加Nuclease-free H90補足至25uL。65℃恒溫擴(kuò)增60min，每組引物均以健康煙葉RNA為模板的陰性對照，試驗重復(fù)3次，最終篩選出1組特異性強(qiáng)的引物。

1.2.6RT-LAIV[P檢測體系優(yōu)化

以ChiVMV陽性的煙葉總RNA為模板，采用單一變量法對反應(yīng)溫度（59、61、63、65、67、69℃）、反應(yīng)時間（30、40、50、60、70、80 min）、反應(yīng)體系中Mg2+濃度（2、4、6、8、10、12mmol/L，其中RT-LAMP基本反應(yīng)體系內(nèi)2.5uL 10×ThermopolBuffer中含有2 mmol/L Mg2+）、dNTPs濃度（0，0.2、0.6、1．0、1.4、1.8、2.2 mmol/L）、甜菜堿濃度（0、0.6、0.8、1．0、1.2、1.4、1.6 mmol/l．）和內(nèi)外引物濃度比（1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1）進(jìn)行優(yōu)化。所有單因素優(yōu)化試驗中均以健康煙草RNA作為陰性對照，優(yōu)化某一因素時其他因子參照RT-LAMP基本體系。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)產(chǎn)物中加入0.5uL的1000×SYBR Green工熒光染料（北京索萊寶科技有限公司）進(jìn)行可視化檢測，隨后取5uL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。試驗重復(fù)3次。

1.2.7RT-LAMP體系的驗證

RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果的判定方法：1）電泳檢測。取5uL反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像儀（上海天能）內(nèi)觀察到條帶呈現(xiàn)梯狀，則為陽性。2）熒光檢測。25uL RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入0.5uL1000×SYBR Green I熒光染料后，陽性樣品內(nèi)熒光染料為熒光綠色，陰性為橙黃色]。

2結(jié)果與分析

2.1最佳條件的篩選與優(yōu)化

2.1.1引物篩選

本研究設(shè)計了5組引物，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖la）顯示，引物組CH-CP-3～CH-CP-5均能擴(kuò)增出條帶，但引物CH-CP-5出現(xiàn)假陽性，而引物組CH-CP-3的擴(kuò)增產(chǎn)物形成的梯狀電泳條帶比其他引物更清晰、明亮且無假陽性；將熒光染色劑加入反應(yīng)產(chǎn)物中，染色結(jié)果與電泳結(jié)果一致（圖1b），沒有擴(kuò)增條帶的產(chǎn)物為橙黃色，有擴(kuò)增條帶的產(chǎn)物則為綠色，將其置于紫外燈下觀察，沒有條帶的產(chǎn)物不能發(fā)出白色熒光，而有條帶的產(chǎn)物可以發(fā)出白色熒光，表明引物組CH-CP-3的特異性最強(qiáng)，故選用CH-CP-3作為該體系的引物。

2.1.2反應(yīng)溫度優(yōu)化

利用篩選出的引物組CH-CP-3，在RT-LAMP基本體系的基礎(chǔ)上對反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，采用CH-CP-3引物組，在63、65、67、69℃4個溫度下產(chǎn)物均產(chǎn)生梯狀電泳條帶（圖2a），同時熒光檢測結(jié)果與電泳檢測結(jié)果一致（圖2b），即這4個反應(yīng)溫度結(jié)果均呈現(xiàn)綠色，且在紫外燈下顯白色熒光。但63℃（泳道4）時擴(kuò)增產(chǎn)物形成的梯狀電泳條帶更清晰、明亮，且基于實際應(yīng)用選擇最佳擴(kuò)增反應(yīng)溫度為63℃。

2.1.3反應(yīng)時間優(yōu)化

利用篩選出的引物組CH-CP-3，反應(yīng)體系采用RT-LAMP基本體系，反應(yīng)溫度設(shè)為63℃，對反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，在6個時間下產(chǎn)物均形成梯狀電泳條帶（圖3a），熒光檢測結(jié)果與凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖3b），有梯狀條帶的呈現(xiàn)綠色，且在紫外燈下顯白色熒光。在50min條件下擴(kuò)增產(chǎn)物形成的梯狀電泳條帶比30、40min更清晰明亮，且與60～80min相差不大（圖3a），為節(jié)省試驗時間，最佳反應(yīng)時間選擇50min。

2.1.4甜菜堿濃度優(yōu)化

基于上述優(yōu)化反應(yīng)體系對甜菜堿濃度（0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mmol/L）進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，7個濃度下均能擴(kuò)增出條帶，但在1.0～1.4mmol/L之間的3個濃度條件下，擴(kuò)增產(chǎn)物形成的梯狀電泳條帶更清晰、明亮（圖4a）；熒光檢測結(jié)果與凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖4b），有梯狀條帶的都呈現(xiàn)綠色，在紫外燈下顯白色熒光。結(jié)合實際應(yīng)用及后期集成，選擇甜菜堿的最適反應(yīng)濃度為1.0mmol/L。

2.1.5dNTPs濃度優(yōu)化

基于上述優(yōu)化的反應(yīng)體系對dNTPs反應(yīng)濃度（0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2mmol/L）進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，dNTPs濃度在0.2～1.8mmol/L下均能擴(kuò)增出條帶，且5個濃度擴(kuò)增產(chǎn)物形成的梯狀電泳條帶亮度均相差不大（圖5a）；熒光檢測結(jié)果與凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖5b），有梯狀條帶的呈現(xiàn)綠色，且在紫外燈下顯白色熒光。結(jié)合實際應(yīng)用及后期集成，選擇的最適反應(yīng)dNTPs濃度為0.2mmol/L。

2.1.6Mg2+濃度優(yōu)化

基于上述優(yōu)化反應(yīng)體系，在2～12mmol/L之間以2mmol/L為梯度設(shè)置6個Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明2～8mmol/L濃度下均能擴(kuò)增出條帶，但在4mmol/L條件下的擴(kuò)增產(chǎn)物形成的梯狀電泳條帶更清晰、明亮（圖6a）；熒光檢測結(jié)果與凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖6b），有梯狀條帶的都呈現(xiàn)綠色，且在紫外燈下顯白色熒光。結(jié)合實際應(yīng)用及后期集成，選擇最適Mg2+濃度為4mmol/L。

2.1.7內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化

基于上述優(yōu)化反應(yīng)體系，設(shè)置8個內(nèi)外引物比梯度1：1～8：1，以篩選出最適的內(nèi)外引物濃度比。結(jié)果表明，8個內(nèi)外引物濃度比均能擴(kuò)增出條帶，但在4：1條件下擴(kuò)增產(chǎn)物形成的梯狀電泳條帶更清晰、明亮（圖7a）；其熒光結(jié)果與凝膠電泳檢測結(jié)果一致（圖7b），有梯狀條帶的都呈現(xiàn)綠色，且在紫外燈下顯白色熒光。結(jié)合實際應(yīng)用，選擇最適內(nèi)外引物濃度比為4：1。

2.2RT-LAMP靈敏度試驗

將507.4ng/uL的總RNA進(jìn)行10倍梯度的連續(xù)稀釋獲得9個濃度，各取1uL作為模板分別采用優(yōu)化的RT-LAMP及RT-PCR檢測方法進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，RT-LAMP的檢測靈敏度可達(dá)到5.07×10-s ng/uL（圖8a，b），而RT-PCR僅可達(dá)到5.07×10-3ng/uL（圖8c），可見RT-LAMP的靈敏度是普通RT-PCR的100倍。

2.3RT-LAMP特異性試驗

以分別含有ChiVMV、HCRV、TZSV、TSWV、TVBMV、ToBRFV、TMV、CMV及PVY病毒的煙葉總RNA為模板，利用優(yōu)化的RT-LAMP檢測體系進(jìn)行擴(kuò)增。凝膠電泳結(jié)果表明，只能在攜帶ChiVMV的煙葉樣品中擴(kuò)增出條帶，其他樣品中無擴(kuò)增條帶（圖9a）；其熒光結(jié)果與凝膠電泳結(jié)果一致，僅攜帶ChiVMV的樣品顯綠色，且在紫外燈下顯白色熒光（圖9b）。表明建立的ChiVMV RT-LAMP檢測體系具有很好的特異性。

3結(jié)論與討論

目前利用RT-LAMP進(jìn)行檢測的應(yīng)用較多，如植物病毒檢測方面，2010年Liu等運用該技術(shù)檢測了RNA病毒煙草花葉病毒；2020年高彥萍等建立了馬鈴薯卷葉病毒的RT-LAMP檢測技術(shù)。在細(xì)菌檢測方面，2012年黃麗等建立了柑橘黃龍病的RT-LAMP檢測方法。此外，2018年張吉紅等建立了轉(zhuǎn)基因油菜‘Ms8’品系的LAMP檢測體系等。

本研究根據(jù)ChiVMV的CP序列，設(shè)置了5組RT-LAMP引物，從中篩選出最佳引物組CH-CP-3，隨后采用單因素試驗探究了反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間，甜菜堿、dNTPs、Mg2+濃度和內(nèi)外引物濃度比等反應(yīng)條件及組分對RT-LAMP體系的影響。結(jié)果顯示，反應(yīng)時間，dNTPs、Mg2+濃度和內(nèi)外引物濃度比對RT-LAMP體系的影響比較明顯；甜菜堿濃度的影響比較小。在25uL反應(yīng)體系中各組分最佳加入量分別為：補足至25uL。最佳反應(yīng)條件為63℃50min，且其靈敏度是RT-PCR的100倍。由此可見，與RT-PCR相比，RT-LAMP具有用時短、反應(yīng)溫度低、靈敏度高的特點，應(yīng)用前景廣闊。

RT-LAMP技術(shù)采用6條引物進(jìn)行擴(kuò)增，靈敏度極強(qiáng)，但也極易產(chǎn)生假陽性。產(chǎn)生假陽性的主要原因是該檢測技術(shù)擴(kuò)增時拷貝系數(shù)高，能檢測到空氣中存在的陽性氣溶膠粒子。因此本研究在總結(jié)前人經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，在操作過程中采取“一步一環(huán)境”的措施，即在體系加樣、RNA模板加樣、熒光染色劑加樣、凝膠電泳等操作流程時均在不同的操作間，并在加完RNA模板后用石蠟油封層，以減少氣溶膠污染的可能性。此外，RT-LAMP需要6條引物，加之其拷貝系數(shù)高，導(dǎo)致其對引物具有高要求．因此當(dāng)引物設(shè)計不恰當(dāng)時也極容易產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象，故本研究在引物篩選時對每條引物均設(shè)陰性對照，以防產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象而影響后續(xù)試驗。本研究建立并優(yōu)化了烤煙上南美紅辣椒脈斑駁病毒（ChiVMV） RT-LAMP檢測技術(shù)，并采用了RT-PCR和熒光檢測方法對優(yōu)化的檢測方法進(jìn)行平行比對驗證，二者檢測結(jié)果一致，說明本研究建立的ChiVMVRT-LAMP檢測技術(shù)具有可靠性。除此之外，RT-LAMP檢測可通過肉眼觀察直接判斷結(jié)果（可視化判讀結(jié)果）且靈敏度是RT-PCR的100倍，較RT-PCR操作簡易，可滿足科研、基層單位和簡陋現(xiàn)場等對該病毒檢測的需要，具有廣闊的應(yīng)用前景。