鄒瑩 楊立杰 謝錦 趙冀 畢恒翊 陳火云 宋波濤 馬恢 聶碧華

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；病毒；類病毒；檢測方法；多重RT-PCR

馬鈴薯是世界第三大糧食作物，也是我國重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物。但馬鈴薯易受到多種病毒病危害，加之其繁殖方式為無性繁殖，容易發(fā)生退化而導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降。已報道能在田間侵染馬鈴薯的病毒和類病毒有60多種，其中馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）、馬鈴薯X病毒（potato virus X，PVX）、馬鈴薯A病毒（potato virus A，PVA）、馬鈴薯M病毒（potato virus M，PVM）、馬鈴薯S病毒（potato vi-rus S，PVS）、馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf roll vi-rus，PLRV）這6種病毒和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（potato spindle-tuber viroid，PSTVd）是我國流行的主要種類。由于缺少有效的藥劑清除侵入寄主細(xì)胞內(nèi)的病毒，當(dāng)前，馬鈴薯病毒病防治主要使用脫毒種薯，而在脫毒種薯生產(chǎn)過程中，對主要病毒和類病毒進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測是保證種薯質(zhì)量的關(guān)鍵，因此，建立高效的病毒檢測方法對病毒病的防治具有重要意義。

酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosor-bent assay．ELISA）是應(yīng)用廣泛的病毒檢測方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可一次性檢測大量樣品等優(yōu)點，但該方法一次只能檢測一種病毒，無法檢測類病毒PSTVd，對病毒濃度較低的馬鈴薯塊莖樣品也有一定的局限性。反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（re-verse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR）檢測技術(shù)具有簡單快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點，并且可以彌補(bǔ)ELISA檢測方法的不足。尤其是多重RT-PCR可以同時檢測多種目標(biāo)病毒，可大大提高檢測效率。Peiman等利用多重RT-PCR技術(shù)從PVX、PVS和PLRV單獨或復(fù)合侵染的樣品中檢測出這3種病毒。羅文彬等建立了可同時檢測PVX、PVM、PVY、PVA和PVS的多重RT-PCR技術(shù)。Lorenzen等和Mallik等利用免疫捕捉多重RT-PCR檢測和鑒別了馬鈴薯Y病毒的5種主要病毒株系。但多重RT-PCR并非RT-PCR簡單的組合，其對各引物的特異性、匹配性有很高的要求，還要求各引物之間沒有互作，引物自身不形成二級結(jié)構(gòu)，各引物退火溫度相近，擴(kuò)增片段電泳能夠區(qū)分開等。因此，檢測的目標(biāo)片段越多，建立多重RT-PCR難度也越大。能夠一次性檢測我國主要流行的全部6種病毒（PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV）和一種類病毒（PSTVd）的多重RT-PCR檢測體系迄今尚未見報道。本研究建立并優(yōu)化了可同時檢測PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PL-RV、PSTVd的多重RT-PCR檢測體系，為脫毒種薯生產(chǎn)和病毒病的防治提供重要的技術(shù)支撐。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1病毒及樣品

6種主要病毒（PVX、PVS、PI。RV、PVA、PVY、PVM）和1種類病毒（PSTVd）單獨侵染的馬鈴薯試管苗，在（20±2）℃，光周期L∥D=16h∥8h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)并保存，試驗前用ELISA或RT-PCR確認(rèn)上述材料中病毒的種類和感染的唯一性。此外，從田間種植的馬鈴薯高代系材料中收集了26份有疑似病毒病癥狀的馬鈴薯葉片樣品用于多重RT-PCR方法的驗證。所有RT-PCR檢測均以馬鈴薯脫毒組培苗作為健康對照。

1.1.2主要試劑

本試驗ELISA所用馬鈴薯病毒檢測試劑盒購自英國ADGEN公司；UNIQ-10柱式TRIzoI總RNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、6bp的隨機(jī)引物、PCR特異引物均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.2方法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成

取馬鈴薯葉片0.1～0.3g，采用UNIQ-10柱式TRIzoI總RNA抽提試劑盒提取葉片總RNA。20uL的cDNA合成體系含1ug總RNA、2.5pmol/L的6bp隨機(jī)引物、1.0mmol/L的dNTPs、4uL 5×M-MLV緩沖液、1.25U/uL的反轉(zhuǎn)錄酶、0.5U/uL的RNA酶抑制劑。總RNA與隨機(jī)引物混合后先在65℃變性5min，立即置于冰上冷卻2min，再加入其余組分在PCR儀中42℃反應(yīng)90min，最后70℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶15min。

1.2.2引物設(shè)計與篩選

首先從參考文獻(xiàn)中篩選獲得PVY、PVS、PVX、PSTVd及Cox工的特異性引物，然后依據(jù)產(chǎn)物不超過700bp，且與上述目標(biāo)產(chǎn)物大小容易區(qū)分的原則，進(jìn)行PLRV、PVM和PVA特異性引物的設(shè)計。先在NCBI上分別檢索這3種病毒的全長核苷酸序列、外殼蛋白核苷酸序列及P1蛋白核苷酸序列，使用Clustal 2.0及GeneDoc進(jìn)行比對，再利用Primer Premier 5.0設(shè)計引物，引物信息見表1。通過本實驗室Peiman等建立的單重RT-PCR體系，用各病毒陽性材料的cDNA驗證引物的特異性。

1.2.3多重RT-PCR檢測體系的建立和優(yōu)化

本實驗室Peiman等已建立了可同時檢測PVX、PVS、PVY、PLRV、PSTVd的五重RT-PCR檢測體系，本研究在此基礎(chǔ)上增加了PVM、PVA和內(nèi)參基因Cor-工的特異性引物，同時基于產(chǎn)物大小能通過電泳區(qū)分的原則，用自主設(shè)計的PLRV引物和呂典秋等設(shè)計的PSTVd引物將原體系中的對應(yīng)引物進(jìn)行了替換，建立了總體積50uL。的八重RT-PCR反應(yīng)體系，并對鎂離子、dNTPs、cDNA模板以及引物濃度進(jìn)行了篩選。各因素終濃度設(shè)置如下：MgC12溶液（200、250、300 umol/L），dNTPs溶液（240、280、320 umol/L），每種病毒質(zhì)粒模板（14、21、28ng/uL），各種病毒特異性引物（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6umol/L）。

1.2.4PCR產(chǎn)物的克隆和測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收目的片段?；厥债a(chǎn)物與pMD18-T載體在16℃下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)大腸桿菌DH5a菌株，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽性單菌落轉(zhuǎn)移至20mL LB培養(yǎng)基中，150r/min、37℃培養(yǎng)過夜，菌液送至上海桑尼生物技術(shù)公司進(jìn)行測序，測序獲得的核苷酸序列通過與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，完成對病毒序列的確認(rèn)。

1.2.5質(zhì)粒提取及靈敏度檢測

使用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，用分光光度計測定各病毒質(zhì)粒的濃度，并調(diào)整到相近濃度，然后將各病毒質(zhì)粒溶液等體積混合。將該混合質(zhì)粒按照1：10、1：102、1：103、1：104、1：10s、1：106、1：107比例稀釋后作為模板，用所建立的八重RT-PCR體系擴(kuò)增，觀察電泳結(jié)果，分析該八重RT-PCR檢測體系的靈敏度。

1.2.6利用建立的八重RT-PCR體系對田間樣品進(jìn)行檢測

為了驗證建立的RT-PCR體系，從田間收集26份馬鈴薯葉片樣品采用本研究建立的多重RT-PCR進(jìn)行檢測。同時，每份葉片樣品取0.1g采用馬鈴薯病毒ELISA檢測試劑盒檢測PVY、PVM、PVS、PVX、PVA和PLRV．用單重RT-PCR檢測PSTVd進(jìn)行驗證。

2結(jié)果與分析

2.1引物的特異性

以相應(yīng)的病毒陽性材料cDNA模板進(jìn)行單重RT-PCR擴(kuò)增以驗證引物的特異性。各病毒和Co-工基因的擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，PVY、PVM、PVS、PVX、PVA、PLRV、PSTVd和Co-工的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小依次為181、226、275、565、630、681、359 bp和500bp。

為進(jìn)一步驗證自主設(shè)計的擴(kuò)增PLRV、PVM、PVA的引物和引自文獻(xiàn)的擴(kuò)增PSTVd引物的特異性，對它們的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了回收純化及測序，將測序結(jié)果與GenBank上公布的相應(yīng)病毒序列進(jìn)行核苷酸序列比對。結(jié)果顯示，PLRV、PVM、PVA和PSTVd的擴(kuò)增產(chǎn)物與相應(yīng)病毒、類病毒參考序列一致性分別達(dá)98.7%（EU717546）、98.5%（HM991708）、99.8%（249088）和98.5%（EU879923），表明上述相應(yīng)引物能成功擴(kuò)增相應(yīng)的病毒和類病毒目標(biāo)片段。

上述結(jié)果表明，本研究設(shè)計和選擇的相關(guān)引物RT-PCR擴(kuò)增效果良好，產(chǎn)物大小易于區(qū)分，同時具有較好的特異性，可以用于后續(xù)多重RT-PCR體系的構(gòu)建。

2.2多重RT-PCR檢測體系的優(yōu)化結(jié)果

用不同病毒及類病毒cDNA混合物作模板，以來自馬鈴薯脫毒苗的cDNA作健康對照，利用上述建立的多重RT-PCR檢測體系，對上述8對引物中的部分或者全部進(jìn)行組合，以評估多重PCR的檢測效果。結(jié)果如圖2所示，在所有多重PCR體系中Cox工都獲得了較好的擴(kuò)增。在簡單組合中，PVY、PVM、PVS和Coz工的4對引物能分別與PSTVd、PVX、PVA和PLRV中的任意一對引物組成擴(kuò)增效果良好的五重PCR體系（圖2，泳道1～4）。在PVY、PVM、PVS、Co-工和PLRV組成的五重PCR的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步增加PSTVd、PVX、PVA中的一種，可組成六重PCR體系（圖2，泳道5～7），而增加其中的兩對引物還可以成功地進(jìn)行七重PCR擴(kuò)增（圖2，泳道8～9）。最后，所有8對引物也能完成同體系擴(kuò)增反應(yīng)，各產(chǎn)物能夠從大小上進(jìn)行區(qū)分，具有較好的檢測效果（圖2，泳道10）。

2.3多重RT-PCR的靈敏度

進(jìn)一步用各目標(biāo)病毒的質(zhì)粒進(jìn)行靈敏度分析，將含PVX、PVY、PVA、PVS、PVM、PLRV、PSTVd濃度分別為190.73、168.91、158.08、178.37、176.09、180. 04ug/uL和174. 71ng/uL的質(zhì)粒模板等體積混合后進(jìn)行梯度稀釋，檢測結(jié)果如圖3所示。模板稀釋103后，所有目標(biāo)病毒和類病毒仍然能夠獲得清晰的特異性擴(kuò)增條帶（圖3，泳道1～4）；稀釋104后，多重RT-PCR還能檢測到PVA、PVX、PSTVd和PVY（圖3，泳道5）；稀釋105后，多重RT-PCR只能檢測到PVA和PVX（圖3，泳道6）；進(jìn)一步稀釋到106、107后，多重RT-PCR檢測不到任何特異擴(kuò)增條帶（圖3，泳道7～8）。由此可見，該多重RT-PCR反應(yīng)體系對各種病毒和類病毒的檢測限有所差異，其中PLRV、PVS和PVM病毒能檢測到的最低濃度約為1.8×10-1 ng/uL，PVY和PSTVd能檢測到的最低濃度約為1.7×10-2 ng/uL，而對PVA和PVX病毒的檢測最為靈敏，能夠檢測到的最低濃度分別為1.6×10-3ng/uL和1.9×10-3ng/uL。

2.4田間樣品的病毒檢測結(jié)果

從大田收集了26份疑似感染病毒的馬鈴薯樣品，用本研究建立的多重RT-PCR體系進(jìn)行檢測，同時用DAS-ELISA方法檢測6種馬鈴薯病毒，用單重RT-PCR檢測PSTVd，對建立的多重RT-PCR體系進(jìn)行驗證。檢測結(jié)果顯示，所有樣品用多重和單重RT-PCR兩種方法檢測均未檢出類病毒PSTVd，而其余6種馬鈴薯病毒的多重RT-PCR與DAS-ELISA檢測結(jié)果完全一致（圖4），同時本研究建立的多重RT-PCR方法對PVY、PVM、PVS、PVX的檢出率均高于DAS-ELISA檢測，其中，多重RT-PCR還檢測出DAS-ELISA未檢測出的PVS病毒3例（圖4，泳道4，9，16）、PVY病毒1例（圖4，泳道2）、PVX病毒2例（圖4，泳道2，7）以及PVA病毒1例（圖4，泳道12）。部分檢測結(jié)果見圖4，表明本研究建立的多重RT-PCR檢測結(jié)果較DAS-ELISA靈敏度更高，可以應(yīng)用于田間樣品的檢測。

3結(jié)論與討論

近年來，RT-PCR因具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，在馬鈴薯病毒檢測中得到了較好的應(yīng)用，尤其是多重RT-PCR檢測技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)在一個反應(yīng)中同時檢測多種病毒，檢測效率更高，操作更簡便，被廣泛研究和應(yīng)用。本研究建立和優(yōu)化了能同時檢測PVX、PVY、PVA、PVS、PVM、PLRV及PSTVd的多重RT-PCR檢測體系，是至今為止一次性檢測種類最多的方法。同時，本體系引入了馬鈴薯內(nèi)源參考基因Co-工，可有效避免由于RNA降解或其他RNA質(zhì)量問題導(dǎo)致的假陰性問題，使得該多重RT-PCR檢測體系更加嚴(yán)謹(jǐn)和完善。

引物的設(shè)計和篩選是多重RT-PCR體系建立的關(guān)鍵。引物要具有特異性，引物間退火溫度應(yīng)接近，相互影響應(yīng)較小，其擴(kuò)增的目標(biāo)片段又要易于區(qū)分，同時還要避免各目標(biāo)片段差異過大對擴(kuò)增效率及延伸時間造成影響，合理地選擇引物會使反應(yīng)體系更容易被優(yōu)化，本研究針對PVA，PVM和PLRV CP基因的保守核苷酸序列分別設(shè)計特異性引物，同時遵循以上引物組合的基本原則，應(yīng)用單重RT-PCR體系對自主設(shè)計和文獻(xiàn)查找獲得的引物進(jìn)行驗證，確定了該多重RT-PCR檢測體系中7種病毒／類病毒的最佳引物組合。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件是影響多重RT-PCR擴(kuò)增效果的兩大類因素，建立準(zhǔn)確且穩(wěn)定的多重RT-PCR檢測體系需要對影響多重RT-PCR反應(yīng)的主要條件及反應(yīng)程序進(jìn)行單因子優(yōu)化。張威等對所建立的三重RT-PCR進(jìn)行優(yōu)化的試驗結(jié)果表明，適當(dāng)提高M(jìn)gC12和dNTPs的濃度有利于提高擴(kuò)增效率，但也并非越高越好，因為dNTPs會與溶液中的Mg2+結(jié)合，而TaqDNA聚合酶發(fā)揮活性需要游離的Mg2+，因此溶液中MgC12和dNTPs的濃度要保持一定的平衡，本研究優(yōu)化的試驗結(jié)果與其相符，本研究結(jié)果表明，為使體系擴(kuò)增效率最高，需保證有足夠量的dNTPs，當(dāng)dNTPs濃度為達(dá)320umol/L時，擴(kuò)增效果最佳，而MgC12過高或者過低都會影響體系的擴(kuò)增效果，當(dāng)其濃度為250umol/l。時所擴(kuò)增的目的條帶最清晰。董代幸等對所建立的四重RT-PCR進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，各引物對的濃度和比例不當(dāng)會使某些目標(biāo)條帶擴(kuò)增不出來或者產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，同時，由于各目標(biāo)片段大小不同，各引物的特異性也存在差異，引物濃度與相應(yīng)模板的量也需要進(jìn)行反復(fù)探究，本試驗遵循以上原則對各引物對的濃度、比例以及相應(yīng)模板量進(jìn)行優(yōu)化，獲得了最佳擴(kuò)增效果的各引物及模板用量。

特異性和靈敏度是評價多重RT-PCR體系的重要參數(shù)，引物特異性強(qiáng)、靈敏度高才能保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。為了探究多重RT-PCR的靈敏度，本試驗將各病毒質(zhì)粒模板混合并進(jìn)行一系列稀釋后進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果顯示，各病毒／類病毒的最低檢測濃度在1.6×10-3～1.8×10-1ng/uL之間，說明該檢測體系靈敏度較高；另外，應(yīng)用本研究建立的多重RT-PCR體系對26個不同品種（系）的田間樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，該多重RT-PCR檢測體系比DAS-ELISA檢測的靈敏度高，可檢測出DAS-ELISA無法檢測出的感病情況。

本試驗首次實現(xiàn)了PVY，PVS，PVM，PVX，PVA，PLRV、PSTVd的同時檢測，突破以往多重RT-PCR檢測技術(shù)檢測病毒數(shù)量少的局限，且以馬鈴薯內(nèi)源性參考基因（Cox）作為對照，保證了檢測結(jié)果的可靠性，經(jīng)本試驗驗證，該體系可降低檢測成本，提高檢測效率，可用于馬鈴薯種薯質(zhì)量檢測。