金慶敏 徐小萬 衡周 王恒明 徐曉美

關鍵詞：辣椒；L型凝集素類受體激酶；辣椒疫霉；基因表達；誘導

類受體激酶（receptor-like kinases，RLKs）是一個龐大的蛋白家族，主要負責環(huán)境脅迫（括生物和非生物）和發(fā)育信號的感知和轉導。凝集素類受體激酶（lectin receptor-like kinases，LecRKs）是RLK家族的一類成員，它們含有能夠結合各種碳水化合物的胞外凝集素基序，根據所含凝集素基序的差異，凝集素類受體激酶分為3種類型，分別為G型、C型和L型。其中L型凝集素類受體激酶含有胞外豆類凝集素樣結構域和胞內激酶結構域?，F有研究報道發(fā)現，LecRKs能夠參與多種生物過程，包括花粉發(fā)育、種子萌發(fā)、傷害脅迫和鹽脅迫等，而其最突出的作用是參與植物的先天免疫。

目前，模式植物擬南芥Arabidopsis thaliana中的AtLecRK基因功能研究得最為清楚。擬南芥中共鑒定出45個AtLecRK基因，其中包括7個“Sin-gleton”，另外38個AtLecRK基因可劃分為9個分支。Wang等通過插入T-DNA對擬南芥45個AtLecRK基因的功能進行了系統(tǒng)研究，發(fā)現有多達18個AtLecRK基因的T-DNA插入突變體對油菜疫霉Phytophthora brasszcae、辣椒疫霉Phyto-phthora capszcz、丁香假單胞菌Pseudornonas syrin-gae或甘藍鏈格孢Alternaria brasszczcola的抗性發(fā)生了改變。AtLecRK-I.9缺陷型突變體在細胞壁相關防御和茉莉酸信號傳導方面受損，并對丁香假單胞菌、油菜疫霉和辣椒疫霉表現出更高的易感性。盡管作用機制不同，AtLecRK-Ⅵ．2和AtLecRK-V．5都被發(fā)現在對抗病原細菌的氣孔免疫中發(fā)揮作用。AtLecRK-Ⅵ．2奕變體不能通過氣孔關閉抑制細菌入侵，因此對細菌更敏感，但對真菌或卵菌不敏感，而AtLecRK-V．5突變體則相反，其通過關閉氣孔來提高植物對病原細菌的抗性。擬南芥AtLecRK第Ⅸ分支的2個基因AtLecRK-Ⅸ．1和AtLecRK-Ⅸ．2均在調節(jié)植物對疫霉抗性上發(fā)揮重要作用。并且有研究發(fā)現在番茄和煙草中與擬南芥AtLecRK第Ⅸ分支同源的LecRK基因也參與植物的抗疫霉防御反應。此外，黃瓜中CsLecRK6.1同樣受瓜類疫霉和辣椒疫霉誘導。由此可見，LecRK基因家族在植物抗病防御反應中發(fā)揮著重要功能。

辣椒Capsicurn annuurn因其風味多樣、營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛，其既可鮮食又可加工，具有重要的產業(yè)價值。由辣椒疫霉引起的辣椒疫病是辣椒生產上常見的主要病害之一，是一種發(fā)病周期短、傳播速度快的毀滅性土傳病害，在世界范圍內均有發(fā)生。從長遠來看，在辣椒抗疫病品種中挖掘抗辣椒疫霉的相關抗性基因是一種安全、經濟、有效的防治途徑。

目前為止，未見在辣椒中全基因組范圍鑒定LecRK基因的報道。為了初步探究辣椒中的Lec-RK基因是否參與辣椒的抗疫病防御反應，我們對辣椒基因組中的CaLecRK進行了全面鑒定，并分析了辣椒CaLecRK與番茄SILecRK和擬南芥AtLec-RK的系統(tǒng)發(fā)育關系。同時，以抗疫病辣椒材料‘CM334’和感病材料‘10399’為試驗材料，在接種辣椒疫霉后（0、12h和36h）利用RT-qPCR技術分析CaLecRK基因的表達變化，旨在挖掘參與辣椒抗疫病防御反應的CaLecRK基因，為辣椒抗疫病育種提供基因資源。

1材料與方法

1.1植物材料及培養(yǎng)

‘CM334’和‘10399’均受贈于美國墨西哥大學Paul W. Bosland教授?！瓹M334’高抗辣椒疫霉，而‘10399’對目前測試的所有辣椒疫霉都敏感。試驗材料均在廣東省農業(yè)科學院蔬菜研究所植物培養(yǎng)室采用育苗杯種植，每杯播種5粒種子。育苗條件為：溫度（26±2）℃，光周期L∥D=14h∥10h，相對濕度70%。幼苗生長至6片真葉時進行接菌處理。

1.2疫霉培養(yǎng)、菌液制備及接菌處理和取樣

辣椒疫霉培養(yǎng)：本研究所用辣椒疫霉菌株為By14，該菌株于2012年在廣東省農業(yè)科學院廣州白云試驗基地的感病辣椒植株上分離獲得。將保存的By14茵株于V8固體培養(yǎng)基（200mL V8果蔬汁，3.0g CaC03，20g瓊脂，800mL無菌水，pH6.3）上活化培養(yǎng)。先置于25℃環(huán)境下黑暗培養(yǎng)3d，而后在L∥D=12h∥12h條件下培養(yǎng)3～4d，用于誘導產孢。

菌液制備：在平板中加入10mL無菌水，將其置于4℃冰箱靜置30min，再于室溫下（23～25℃）放置30min釋放孢子，收集孢子懸浮液，并用血球計數板計數游動孢子數量，調節(jié)至游動孢子濃度為1×104個/mL備用。

接菌處理：接菌前12h將辣椒幼苗澆透水，用注射器吸取5mL游動孢子懸浮液注射至距植株約1cm左右的根際處，黑暗保濕24h后在上述正常育苗條件下培養(yǎng)。分別在接菌后0、12h和36h取樣，每個材料每個時間點取3個單株的根部進行混樣，將根部快速沖洗干凈后存放于液氮中備用。每個樣重復3次。

1.3辣椒基因組中CaLecRK蛋白的鑒定

參考Wang等對煙草和番茄基因組中Lec-RK蛋白的鑒定方法，根據Bouwmeester等分析的擬南芥AtLecRK蛋白，從TAIR網站（https：∥www.arabidopsis. org/）檢索并下載45條擬南芥AtLecRK蛋白序列，以此作為查詢序列在茄果類基因組數據庫網站（https：∥solgenomics．net/tools/blast/）利用blastP工具在系統(tǒng)默認檢索參數下對辣椒‘CM334，基因組蛋白數據庫（1. 55版本）進行檢索，檢索到的蛋白序列初步過濾后采用蛋白質結構域和基序注釋網絡工具SMART（simple modulararchitecture research tool）（http：∥smart. embl-hei-delberg. de/smart/set_mode. cgi？

GENOMIC=1）進行注釋，同時含有凝集素結構域和激酶結構域的蛋白被認定為CaLecRK。

1.4辣椒中CaLecRK的蛋白結構預測

使用蛋白質結構域鑒定、注釋在線分析工具SMART在genomic模式下完成CaLecRK蛋白質結構域的鑒定和注釋，包括凝集素基序、蛋白激酶結構域、跨膜結構域等，同時使用在線工具SignaIP6.0（https：∥servlces. healthtech. dtu. dk/service.php？ SignaIP）進行CaLecRK的信號肽預測。

1.5CaLecRK蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

從茄果類數據庫（https：∥solgenomics。net/cview/map．pl？

map_id=10）下載檢索到的目標CaLecRK蛋白序列，以MEGA 11軟件的Clust-aIW模塊進行CaLecRK蛋白的多序列比對，并以鄰接法（neighbour-joining，NJ）構建CaLecRK的系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap設為1000。22個番茄LecRK蛋白序列來源于文獻，38個（不包括7個“Single-ton”）擬南芥LecRK蛋白序列ID從文獻[2]獲取，再從擬南芥數據庫（https：∥www. arabidopsis.org/）下載其蛋白序列。

1.6RNA提取及RT-qPCR基因表達分析

根據CaLecRK蛋白序列ID在茄果類基因組數據庫（https：∥solgenomics. net/cview/map. pl？ map_id=10）下載24個CaLecRK基因CDS序列，利用Primer Premier 6.0設計引物（表1），并交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物經過特異性檢測和熔解曲線分析合格后用于后續(xù)RT-qPCR試驗?？俁NA提取、反轉錄及RT-qPCR參考徐曉美等的方法，選取CaIF4G （CAOlg27330）為內參基因?；蛳鄬Ρ磉_量參考Wang等的方法計算。以接種辣椒疫霉后oh樣本為參照計算差異表達倍數，當其他時間點（接菌后12h和36h）基因的相對表達量與0h的差異達到2倍及以上，即log2（fold change）≥1或log2（fold change）≤-1時認為表達存在顯著差異。

2結果與分析

2.1CaLecRK鑒定及其結構分析

以擬南芥中45條AtLecRK蛋白序列為查詢序列，在辣椒‘CM334’蛋白數據庫（1.55版本）中共比對到198條蛋白序列，根據LecRK蛋白長度特征，過濾掉長度大于800aa和小于320aa的蛋白，剩下的112條蛋白序列再經過逐一核對和結構域分析，有24個蛋白被鑒定屬于LecRK家族。通過序列比對，將這24個CaLecRK錨定到‘CM334’辣椒基因組上獲取其對應的基因ID，發(fā)現其中20個CaLecRK基因分布在辣椒第1～10號染色體上，其中第1、5、6、7和8號染色體上各分布1個，第2、3和4號染色體上各分布2個，第9和10號染色體上分別分布有4個和5個，第11和12號染色體上暫未發(fā)現有分布（表2）。另外有4個CaLecRK不能錨定到目前版本的辣椒染色體上。根據20個CaLecRK在各染色體上的順序對其進行命名，4個（CAOOg16600、CAOOg16660、CAOOg16670和CAOOg44720）未能錨定到具體染色體上的CaLecRK基因依次命名為CaLecRK00.1、CaLecRK00.2、CaLecRK00.3和CaLecRK00.4<表2）。

24個CaLecRK大小介于375～716aa之間，蛋白結構分析表明，凝集素基序位于CaLecRK的N末端，大小為134～265aa，蛋白激酶結構域位于CaLecRK的C末端，大小為65～274aa（表3）。24個CaLecRK均含有跨膜結構域，其中12個CaLecRK（CaLec-RK1.1、CaLecRK2.1、CaLecRK2.2、CaLecRK3.2、CaLecRK4.1、CaLecRK4.2、CaLecRK7.1、CaLec-RK8.1、CaLecRK9.1、CaLecRK9.4、CaLecRK10.1和CaLecRKOO.2）含有1個跨膜結構域，10個Ca-LecRK（CaLecRK3.1、CaLecRK5.1、CaLecRK6.1、CaLecRK9.2、CaLecRK9.3、CaLecRKIO.2、CaLec-RK10.3、CaLecRK10.4、CaLecRK10.5和CaLecRK00.4）含有2個跨膜結構域，另外還有2個CaLecRK（CaLecRK00.1和CaLecRK00.3）含有3個跨膜結構域（表3）。信號肽預測表明，除Ca-LecRK3.1、CaLecRK4.1和CaLecRK9.4等3個CaLecRK不含有信號肽片段外，其他21個CaLec-RK均含有信號肽（表3）。

2.2CaLecRK蛋白的多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

基于24個CaLecRK蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，24個CaLecRK可分為7個分支，其中第工分支含有的CaLecRK個體最多，為9個，第Ⅳ和第Ⅶ分支各含有4個CaLecRK，第V和第Ⅱ分支分別由3個和2個CaLecRK組成，第Ⅲ和第Ⅵ分支均只含1個CaLecRK（圖1）。

2.3擬南芥、番茄和辣椒中LecRKs的進化分析

為了評估不同植物物種的LecRK之間的進化關系，本研究對38個擬南芥AtLecRK，22個番茄SILecRK和24個辣椒CaLecRK進行了系統(tǒng)進化分析，結果表明，84個LecRK可分為10個分支，其中擬南芥中絕大多數AtLecRK集中分布在第Ⅱ、Ⅳ、V和Ⅵ這4個分支，而辣椒中CaLecRK和番茄中SILecRK絕大多數分布在第Ⅲ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和X這5個分支（圖2）。其中，第Ⅱ、V和Ⅵ分支只包含擬南芥AtLecRK，而第Ⅲ和X分支只包含辣椒CaLecRK和番茄SILecRK，通過LecRK之間的系統(tǒng)進化關系分析可以看出，這3種植物之間既有相似性又存在特異性。

2.4辣椒疫霉脅迫下CaLecRK基因的表達分析

為進一步探究辣椒中哪些CaLecRK參與了辣椒抗疫病防御反應，將辣椒疫霉接種到高抗辣椒疫霉的‘CM334’和感病材料‘10399’的幼苗上，以接種后Oh根莖中CaLecRK基因表達量為參照，分析接菌后12、36h根莖部24個CaLecRK基因表達情況。結果表明，24個CaLecRK基因中有4個受辣椒疫霉誘導，基因表達與Oh相比顯著上調，其中CaLecRK2.2和CaLecRK8.1表達模式相同，均只在抗病材料‘CM334’中顯著上調表達，且都在接菌后36h表達量達到最高；CaLecRK3.2在抗病材料‘CM334’和感病材料‘10399’中均顯著上調表達，并在接菌后12h表達量達到最高，接菌后36h有所下降，但在抗病材料‘CM334'中的差異表達倍數均高于對應時間點在感病材料‘10399’中的差異表達倍數（‘CM334’中接菌后12 h和36h對比0h差異表達倍數分別為3.9和3.7倍，‘10399’中分別為2.9和2.2倍）；CaLecRK10.1只在抗病材料‘CM334’中顯著上調表達，并在接菌后36h表達量達到最高（圖3）。4個顯著差異表達基因中，CaLecRK8.1差異表達倍數最高，達到了4倍以上。以上結果可以看出這4個CaLecRK基因均受辣椒疫霉誘導，推測其參與辣椒抗疫病防御反應。

3結論與討論

目前已在3個茄果類作物中鑒定到了L型凝集素類受體激酶基因，其中番茄中有22個SILecRK，煙草有38個NbLecRK，馬鈴薯中有26個StLec-RK。本研究在辣椒基因組中鑒定到的CaLecRK基因有24個。從數量上來看，除煙草外，在番茄、馬鈴薯和辣椒3個茄果類作物中所攜帶的LecRK基因數量相當，這可能主要和這4種作物的基因組構成有關，番茄、馬鈴薯和辣椒均為2n=24的作物（馬鈴薯有多種染色體倍型，但本文參考的文獻中為2n=24），而煙草為異源四倍體作物，導致煙草中的LecRK基因數量遠多于其他3個作物。雖說辣椒基因組遠大于番茄基因組（約為4倍），但其所攜帶的LecRK基因數量非常接近，并且LecRK基因在染色體上的分布也極為相似，番茄中22個SILecRK分別分布在第1、2、3、4、5、7、9和10號染色體上，本研究辣椒中20個CaLecRK分別分布在第1、2、3、4、5、6、7、9和10號染色體上，剩余4個未知（表2），且都是第9和10號染色體上分布最多。基因串聯重復事件在植物基因組中經常發(fā)生，基于串聯重復基因位于10個相鄰基因內的標準．本研究中發(fā)現了3組串聯重復基因對，分別是CaLecRK9.1（CA09905510）和CaLec-RK9.2（CA09905520）， CaLecRK10.4（CAlOg19240）和CaLecRK10.5（CA10g19270），CaLecRK00.1（CA00g16600）、CaLecRK00.2（CA00g16660）和CaLecRK00.3（CA00g16670），類似現象在番茄Sl-LecRK基因中也存在，隨著物種的進化，基因串聯事件發(fā)生會導致同一基因家族基因數量的改變，從而為物種適應環(huán)境提供保障。

L型凝集素類受體激酶基因LecRK廣泛參與植物對細菌、真菌、卵菌和昆蟲等的免疫反應。本研究結果發(fā)現辣椒中的CaLecRK2.2、CaLec-RK3.2、CaLecRK8.1和CaLecRK10.1等4個基因受辣椒疫霉誘導，推測其參與辣椒抗疫病防御反應。在擬南芥中，AtLecRK-Ⅸ．1和AtLecRK-Ⅸ．2的T-DNA插入突變體對油菜疫霉和辣椒疫霉的抗性降低，而AtLecRK-Ⅸ．1或AtLecRK-Ⅸ．2在擬南芥中的過量表達和在煙草中的瞬時表達均能增強植株對疫霉的抗性，表明這2個基因均能正向調控植株對疫霉的免疫反應。進化分析表明煙草和番茄中的3個LecRK基因（NbS0003475290003.1、NbS0005953890001.1和So/yc039043710.1.1）與AtLecRK-Ⅸ．1或AtLecRK-Ⅸ．2歸屬于同一分支，為同源基因。利用病毒誘導的基因沉默對其功能進行分析表明，這3個基因同樣在植株對疫霉抗性中發(fā)揮重要作用。本研究中進化分析表明，CaLec-RK8.1與AtLecRK-Ⅸ．1或AtLecRK-Ⅸ．2也歸屬于同一分支，且受辣椒疫霉誘導，推測CaLecRK8.1參與辣椒抗疫病防御反應，綜上顯示Ⅸ分支的LecRK基因在不同植物家族中功能保守。

現有研究表明，辣椒CaLecRK-S．5在轉錄水平上正向調節(jié)植物免疫，通過調節(jié)基因是否啟動轉錄來介導對煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus）、辣椒輕斑駁病毒（pepper mild mottle virus）和辣椒疫霉Phytophthora capsici等的廣譜抗性。進一步在煙草中通過功能獲得和功能缺失分析表明，Ca-LecRK-S.5在以疫霉Phytophthora作為誘導子介導的防御反應中發(fā)揮積極作用。序列比對發(fā)現，CaLecRK-S．5和本研究中的CaLecRK4.1為同一個基因，然而本研究中，CaLecRK4.1基因在辣椒疫霉處理前后并未呈現出顯著表達差異（圖3），這可能和所用辣椒疫霉的生理小種不同有關，因辣椒疫霉存在生理小種分化，同一抗病材料對不同致病菌的抗性存在明顯差異，即同一抗病材料對不同辣椒疫霉生理小種的響應機制可能不同。