陳錦溶，呂紫見(jiàn)，范麗莎，游倩，李濤，宮超，孫光聞，李植良，孫保娟

上位基因控制的茄子果色遺傳效應(yīng)解析

1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣州 510642；3華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070

【目的】果實(shí)顏色是影響茄子商品價(jià)值的重要性狀。通過(guò)解析兩白果親本雜交構(gòu)建的F2代群體紫紅果單株和白果單株特殊分離比產(chǎn)生的原因，為闡明茄子果實(shí)顏色形成的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。【方法】以花青素合成結(jié)構(gòu)基因（）突變的白花白果母本19141、未知突變基因位點(diǎn)的白花白果父本19142及其紫紅果F1、果色分離的F2群體為試驗(yàn)材料，探討上位基因控制的茄子果色遺傳規(guī)律；克隆已知的茄子果色相關(guān)（）和（）基因，探明父本19142突變的果色基因和方式；開(kāi)發(fā)基因內(nèi)分子標(biāo)記，對(duì)F2進(jìn)行基因分型以及與其他果皮無(wú)花青素沉著茄子親本雜交驗(yàn)證，解析上位基因調(diào)控茄子果色遺傳的分子基礎(chǔ)。【結(jié)果】E4450 F2紫紅果和白果單株分離比符合3對(duì)上位基因控制的27﹕37的分離比率，19141的基因位點(diǎn)發(fā)生突變，基因型為，19142的和基因位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生了突變，基因型為?？寺y(cè)序發(fā)現(xiàn)，19142的發(fā)生可變剪接，導(dǎo)致第2外顯子跳躍。19142的起始密碼子上游-326 bp的SNP（C→G），導(dǎo)致啟動(dòng)子缺失了1個(gè)CAAT-box順式作用元件；在第2外顯子最后一個(gè)堿基G變C，發(fā)生剪切位點(diǎn)突變?；?、和遺傳變異，開(kāi)發(fā)了基因內(nèi)分子標(biāo)記對(duì)E4450 F2單株進(jìn)行基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因型與表型完全吻合；對(duì)應(yīng)紫花紫紅果表型，基因型對(duì)應(yīng)紫花白果表型，、、、_、和基因型對(duì)應(yīng)白花白果表型。19142與白果自交系19147（ddPPYY）和綠果自交系19144（）分別雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F1果色分別為白色和綠色，果皮無(wú)花青素沉著，這進(jìn)一步證明了19142是兩個(gè)基因同時(shí)發(fā)生突變【結(jié)論】2個(gè)果皮無(wú)花青素沉著的茄子親本雜交，如果F1代果皮有花青素沉著，且F2代有花青素沉著單株和無(wú)花青素沉著果色單株分離比符合27﹕37，則是由于其中的一個(gè)親本在花青素合成通路的1個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生了突變，另外一個(gè)親本在花青素合成通路的另外2個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生了突變。兩個(gè)果皮無(wú)花青素沉著親本雜交，F(xiàn)1果皮能夠合成花青素而呈現(xiàn)紫紅，是由于3個(gè)上位基因位點(diǎn)、和同時(shí)處于顯性狀態(tài)，花青素合成得以恢復(fù)。結(jié)構(gòu)基因或突變抑制植株各個(gè)部位花青素合成；轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控具有組織特異性，其突變抑制果皮花青素合成，卻不抑制花中花青素合成。

茄子；果色；上位基因；花青素；遺傳規(guī)律

0 引言

【研究意義】茄子屬于茄科茄屬，在茄科蔬菜生產(chǎn)中占有重要的地位。2021年，中國(guó)茄子總產(chǎn)量3 746萬(wàn)噸，占全球總產(chǎn)量（5 865萬(wàn)噸）的63.87%（FAOSTAT，http://faostat.fao.org）。茄子以果實(shí)為產(chǎn)品，是世界衛(wèi)生組織推薦的世界十大健康蔬菜之一。茄子果皮顏色（以下統(tǒng)稱果色）豐富多樣，不同區(qū)域?qū)x擇具有不同的消費(fèi)習(xí)慣。茄子果色是決定商品外觀品質(zhì)和價(jià)格的重要因素，因此，果色是茄子育種過(guò)程中的一個(gè)重要選育性狀?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】葉綠素和花青素是決定茄子果色的兩種主要色素[1]?；ㄇ嗨乜刂魄炎庸史奂t、淺紫、紫紅、紫黑，甚至黑色[2]。目前，對(duì)于花青素合成途徑已經(jīng)研究得較為透徹，其主要通過(guò)苯丙烷途徑和類(lèi)黃酮生物合成途徑合成[3]?？刂苹ㄇ嗨睾铣傻年P(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因包括苯丙氨酸解氨酶基因（）、4-香豆酸-CoA連接酶基因（）、查爾酮合成酶基因（）、查爾酮異構(gòu)酶基因（CHI）、黃烷酮3-羥化酶基因（）、黃酮3′-羥化酶基因（）、黃酮3′,5′-羥化酶基因（）、二氫黃酮醇4-還原酶基因（）和花青素合成酶基因（）等[3-5]。這些結(jié)構(gòu)基因還受轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（TF）調(diào)控，包括MYB、bHLH和WD40，它們常以MBW（MYB-bHLH-WD repeat）復(fù)合體的形式調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄[6-7]。1909年BATESON提出了上位性的概念，來(lái)定義一個(gè)基因?qū)α硪粋€(gè)基因的遮蓋作用[8]。茄子果實(shí)花青素的合成由3個(gè)上位互作的基因共同控制，分別為、和[9]。近期，在茄子育種實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)2對(duì)上位基因和[10-11]、和[12]控制的茄子果色遺傳現(xiàn)象，即兩個(gè)白果或兩個(gè)綠果的親本雜交，F(xiàn)1為紫紅或紫褐果色，F(xiàn)2有花青素呈色果實(shí)和沒(méi)有花青素呈色果實(shí)單株分離比為9﹕7，通過(guò)遺傳作圖分別定位并獲得了位點(diǎn)候選基因[10]，位點(diǎn)候選基因[10]，位點(diǎn)候選基因[12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者前期研究中，發(fā)現(xiàn)了一種茄子特殊果色遺傳效應(yīng)，即白花白果的母本19141和白花白果的父本19142雜交，F(xiàn)1代為紫花紫紅果，F(xiàn)2代分離出白果單株和紫紅果單株，且白果單株多于紫紅果單株，這不符合兩對(duì)上位基因控制的F2紫紅果和白果分離比為9﹕7的遺傳規(guī)律[10]。已知母本19141的白果是由于位點(diǎn)突變引起的[10]，F(xiàn)1為紫紅果，說(shuō)明19142突變位點(diǎn)發(fā)生在花青素代謝途徑的其他位點(diǎn)，19141和19142雜交后形成互補(bǔ)，才使F1能夠合成花青素。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以19142、19141、兩者雜交F1、F1自交后代F2為材料，通過(guò)已知茄子果色相關(guān)基因克隆，挖掘19142突變的基因和突變方式；基于目標(biāo)基因遺傳變異開(kāi)發(fā)基因內(nèi)分子標(biāo)記，對(duì)F2單株進(jìn)行基因分型，分析表型和基因型的對(duì)應(yīng)關(guān)系；19142與已知果色基因突變的茄子親本雜交，驗(yàn)證突變基因位點(diǎn)異同。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018—2022年在廣州市白云區(qū)鐘落潭鎮(zhèn)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗(yàn)基地和廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)材料為父本19142、母本19141，及其雜交一代E4450F1，E4450F1套袋自交得到的E4450F2。父本19142為2012年引進(jìn)的東南亞資源的分離后代，經(jīng)6代系譜選擇獲得的純合自交系。19142開(kāi)白花，萼片綠色，商品果卵圓形，果皮白色，單果重8.6—9.2 g，果長(zhǎng)3.4—3.9 cm，果粗2.2—2.3 cm。母本19141是2009年初從廣州市廣東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站柯木塱示范基地收集的‘優(yōu)美長(zhǎng)茄’種果的分離后代，經(jīng)5代系譜選育獲得的純合自交系。19141開(kāi)白花，萼片綠色，商品果長(zhǎng)條形，果皮白色，單果重175—199 g，果長(zhǎng)29.6—34.8 cm，果粗3.8—4.2 cm。2018年春季配制雜交組合（19141×19142）獲得E4450F1，2018年秋季E4450F1套袋自交獲得E4450F2。

父本與母本材料花色和果色都為白色，而且在整個(gè)生育期，下胚軸、葉脈、花、萼片都觀察不到花青素的沉著；F1呈現(xiàn)紫花紫紅果；F2分離群體花色和果色出現(xiàn)表型分離，紫紅果單株比例小于白果單株比例。父本、母本及其F1、F2于2022年7月育苗，8月種植于廣州市白云區(qū)鐘落潭鎮(zhèn)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗(yàn)基地內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 分別取父本19142、母本19141、E4450F1和E4450F2的單株幼嫩葉片，使用植物基因組DNA提取試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）提取DNA，利用NANO DROP 2000C可見(jiàn)分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量和含量，檢測(cè)合格后-20 ℃保存。

1.2.2 E4450F2群體的表型評(píng)價(jià) 在開(kāi)花、坐果期觀察花冠和果皮顏色，E4450F2單株的果色紫紅色（有花青素沉著）記錄為1，白色（無(wú)花青素沉著）記錄為0；花冠紫色記錄為1，白色記錄為0。

1.2.3 花青素測(cè)定 取父本、母本及E4450F1商品果期的果實(shí)，用手術(shù)刀刮取果皮（厚度約0.05 mm）。設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)5個(gè)單株，每個(gè)單株取1個(gè)商品果用于刮取果皮，混樣、備用。提取父本、母本及E4450F1商品果期果皮花青素，用植物花青素含量檢測(cè)試劑盒（Solarbio，Beijing，China）進(jìn)行定量分析。采用公式：TA=[（A530-A620）-0.1（A650-A620）]/ε×（V/m）×M×100，計(jì)算花青素含量，其中TA為總花色苷含量（mg/100 g FW），ε為摩爾吸收率，V為總體積（mL），m為樣品重量（g），M為分子量。

1.2.4克隆 以父本19142、母本19141的DNA為模板，擴(kuò)增?；趨⒖蓟蛐蛄校瑧?yīng)用軟件Primer Premier 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1）。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94 ℃30 s，50—60 ℃30 s，72 ℃延伸30 s或60 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。50 μL PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳后用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（生工生物工程股份有限公司）進(jìn)行切膠回收。膠回收產(chǎn)物使用pBM23 Toposmart克隆試劑盒將目標(biāo)片段連接到T-A載體上，接著轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α中，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序、拼接。

表1 目的基因克隆所用引物序列

1.2.5 基因內(nèi)分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及應(yīng)用 根據(jù)和在母本19141、父本19142間的序列差異，運(yùn)用Primer Premier 5軟件在其上、下游設(shè)計(jì)特異性引物，開(kāi)發(fā)基因內(nèi)分子標(biāo)記（表2），用于檢測(cè)E4450F2不同單株中這3個(gè)基因位點(diǎn)的遺傳變異。InDel標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，和的SNP突變位點(diǎn)采用PARMS技術(shù)檢測(cè)[13]。

1.2.6 雜交驗(yàn)證 19142分別與淡紫花白果突變材料19147（基因型為ddPPYY）和白花綠果突變材料19144（基因型為）雜交，觀察F1后代果色表型。

2 結(jié)果

2.1 上位基因控制的茄子特殊果色遺傳規(guī)律

白花白果母本19141和白花白果父本19142雜交，E4450F1為紫花紫紅果（圖1-A）。19141、19142、E4450F1的果皮總花青素含量測(cè)定結(jié)果為E4450F1最高（4.95 mg/100 g FW）；其次是19141（0.52 mg/100 g FW），19142含量最低（0.11 mg/100 g FW）（圖1-B）。E4450F2群體出現(xiàn)花色和果色分離，分離出紫花紫紅果、紫花白果、白花白果3種表型單株（圖1-C）。

表2 SmMYB1 InDel標(biāo)記和SmDFR、SmANS SNP標(biāo)記引物序列

A：19141、19142、E4450F1的表型；B：19141、19142和E4450F1的果皮花青素含量（**，P＜0.01）；C：E4450F2的表型

由表3可知，E4450F2分離群體紫紅果單株數(shù)小于白果單株數(shù)，不符合已報(bào)道的兩對(duì)上位基因控制的F2紫紅果和白果分離比為9﹕7的遺傳規(guī)律[10-11]。

在已知19141突變位點(diǎn)為位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，推測(cè)19142突變了另外2個(gè)茄子果色上位基因和。19141的基因型為，19142基因型為，E4450F1的基因型則為E4450F1單株自交，雌、雄配子各有8種類(lèi)型配子組合，會(huì)產(chǎn)生64種配子體組合的F2群體（表4）。根據(jù)茄子果色上位基因的調(diào)控特點(diǎn)，其中任何一個(gè)位點(diǎn)的純合隱性突變都會(huì)抑制花青素合成，從表4可見(jiàn)，27種配子體組合產(chǎn)生的基因型對(duì)應(yīng)果實(shí)有花青素呈色表型，37種配子體組合產(chǎn)生的基因型對(duì)應(yīng)果實(shí)無(wú)花青素呈色表型，即2個(gè)親本3個(gè)花青素合成相關(guān)的果色基因突變情況下，F(xiàn)2果實(shí)有花青素呈色單株和果實(shí)無(wú)花青素呈色單株的分離比為27﹕37。

表3 不同世代果色分離比

表4 DdPpYy基因型F1自交后代的等位基因組合

加粗表示配子體組合基因型對(duì)應(yīng)果皮有花青素呈色表型；無(wú)加粗表示配子體組合基因型對(duì)應(yīng)果皮無(wú)花青素呈色表型，其中藍(lán)色字體基因型對(duì)應(yīng)紫花白果表型

Bold indicates the genotype of the gametophyte combination corresponds to phenotype with anthocyanins pigmentation in the peel; No bold indicates the genotype of the gametophyte combination corresponds to phenotype without anthocyanins pigmentation in the peel; Among them the blue font genotype indicates to the phenotype of purple flower and white fruit

采用卡方檢驗(yàn)對(duì)E4450F2分離群體紫紅果單株與白果單株的分離比進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明，紫紅果與白果的分離比符合27﹕37（＞0.05，表3），說(shuō)明白果親本19141突變了1個(gè)花青素合成的基因位點(diǎn)，白果親本19142同時(shí)突變了2個(gè)花青素合成的基因位點(diǎn)，分別為和。

2.2 SmMYB1、SmDFR和SmANS克隆

2.2.1為上位基因位點(diǎn)的候選基因。19142的DNA長(zhǎng)度為1 257 bp，cDNA長(zhǎng)度為642 bp。通過(guò)與19141的全長(zhǎng)序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)19142缺失了第1內(nèi)含子3′端18個(gè)堿基和第2外顯子5′端8個(gè)堿基，共26 bp（圖2-A）；另外，第2內(nèi)含子存在2個(gè)相鄰的InDel，間隔6 bp，第1個(gè)是6 bp，第2個(gè)是46 bp，使19142第2內(nèi)含子比19141多52 bp。cDNA克隆發(fā)現(xiàn)，上述26 bp的缺失導(dǎo)致第2外顯子跳躍，使第62位氨基酸殘基處三聯(lián)體密碼子變?yōu)榻K止密碼子TAA。

2.2.2克隆為上位基因位點(diǎn)的候選基因?？寺　y(cè)序拼接發(fā)現(xiàn)，19142與19141相比僅在第1外顯子第101 bp處存在1個(gè)SNP位點(diǎn)（T﹕A）（圖2-B）。已知19141在第1外顯子第101號(hào)堿基發(fā)生突變，T變?yōu)锳，形成終止密碼子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成提前終止[10]，19142的未發(fā)生突變，所以19142該位點(diǎn)基因型為。

2.2.3克隆為上位基因位點(diǎn)的候選基因。全長(zhǎng)為1 999 bp，包含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。19141與19142序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)在第2外顯子最后一個(gè)堿基為SNP，19141為G，19142為C。這個(gè)SNP緊鄰剪切位點(diǎn)，為堿基錯(cuò)義突變和剪切突變。另外，啟動(dòng)子克隆發(fā)現(xiàn)，在起始密碼子上游-326 bp位置，父本和母本之間存在一個(gè)SNP（C﹕G），導(dǎo)致19142缺失1個(gè)CAAT-box順式作用元件（圖2-C）。啟動(dòng)基本元件CAAT框是真核生物基因常有的調(diào)節(jié)區(qū)，也可能是RNA聚合酶的一個(gè)結(jié)合處，控制著轉(zhuǎn)錄起始的頻率。綜上，推測(cè)19142啟動(dòng)子順式調(diào)控元件缺失以及剪切突變協(xié)同導(dǎo)致功能異常。

A：親本的SmMYB1 DNA序列差異和InDel標(biāo)記開(kāi)發(fā)位點(diǎn)；B：親本的SmANS DNA序列差異和SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)位點(diǎn)；C：親本的SmDFR DNA序列、啟動(dòng)子序列差異和SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)位點(diǎn)

2.3 SmMYB1、SmANS和SmDFR基因內(nèi)分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

根據(jù)親本第1內(nèi)含子和第2外顯子26 bp堿基的差異，開(kāi)發(fā)了一對(duì)SmMYB1-26bpInDel標(biāo)記。SmMYB1-26bpInDel標(biāo)記在19141擴(kuò)增產(chǎn)物中有264 bp片段擴(kuò)增；在19142中有238 bp片段擴(kuò)增，E4450F1同時(shí)有264 bp和238 bp兩個(gè)片段擴(kuò)增（圖3-A）。根據(jù)親本第2內(nèi)含子52 bp堿基的差異，開(kāi)發(fā)了一對(duì)SmMYB1-52bpInDel標(biāo)記。SmMYB1-52bpInDel標(biāo)記在19141擴(kuò)增產(chǎn)物中有293 bp片段擴(kuò)增；在19142中有345 bp片段擴(kuò)增，E4450F1同時(shí)有293 bp和345 bp兩個(gè)片段擴(kuò)增（圖3-B）。

根據(jù)在19142與19141的SNP位點(diǎn)，在突變堿基上、下游設(shè)計(jì)PARMS檢測(cè)引物，開(kāi)發(fā)了SmANS-Chr08SNP和SBJ-DFR標(biāo)記。根據(jù)SNP標(biāo)記，可以將E4450F2群體基因分型，圖4-A為遺傳變異PARMS技術(shù)檢測(cè)結(jié)果，HEX信號(hào)對(duì)應(yīng)19142位點(diǎn)（T﹕T），為基因型；FAM信號(hào)對(duì)應(yīng)19141位點(diǎn)（A﹕A），為基因型，F(xiàn)AMHEX信號(hào)對(duì)應(yīng)E4450F1雜合位點(diǎn)（A﹕T），為基因型。圖4-B為遺傳變異PARMS技術(shù)檢測(cè)結(jié)果，HEX信號(hào)對(duì)應(yīng)19142位點(diǎn)（C﹕C），為基因型；FAM信號(hào)對(duì)應(yīng)19141位點(diǎn)（G﹕G），為基因型；FAMHEX信號(hào)對(duì)應(yīng)E4450F1雜合位點(diǎn)（G﹕C），為基因型。

2.4 基因型與表型對(duì)應(yīng)性

根據(jù)開(kāi)發(fā)的基因內(nèi)分子標(biāo)記，對(duì)E4450F2群體的104個(gè)單株進(jìn)行基因分型。基因型與表型對(duì)應(yīng)情況如表5所示。表型為紫花紫果色表型對(duì)應(yīng)8種基因型，分別為，即基因型對(duì)應(yīng)紫色花冠紫紅果植株表型；白花白果表型對(duì)應(yīng)13種基因型，分別為和，即結(jié)構(gòu)基因和只要有一個(gè)位點(diǎn)為純合隱性，就為白花白果表型?？赡苁怯捎诜中偷腇2單株較少，和基因型單株沒(méi)有檢出。紫花白果表型對(duì)應(yīng)4種基因型，分別為由于母本19141的白果是由于位點(diǎn)結(jié)構(gòu)基因突變引起，19142白果為位點(diǎn)調(diào)控基因和位點(diǎn)結(jié)構(gòu)基因同時(shí)突變引起，3個(gè)獨(dú)立的基因位點(diǎn)分離重組，所以F2子代中，出現(xiàn)有別于兩個(gè)白花白果親本的紫花白果表型單株（對(duì)應(yīng)基因型為）。位點(diǎn)候選基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)調(diào)控具有組織特異性，這是基因型單株在花中能合成花青素呈紫色，而在果皮中不能合成花青素呈白色的分子基礎(chǔ)。綜上，基于3個(gè)上位基因位點(diǎn)遺傳變異進(jìn)行基因分型的結(jié)果，可以100%解釋E4450F2子代果色表型與基因型的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

A：SmANS-Chr08SNP標(biāo)記的分型圖；B：SBJ-DFR標(biāo)記的分型圖

表5 E4450F2群體基因型和表型對(duì)應(yīng)情況

2.5 雜交驗(yàn)證遺傳規(guī)律

本試驗(yàn)父本19141與母本19142雜交F1代表型為紫花紫紅果，為了驗(yàn)證19142為雙突變體材料，以19142作為母本材料與白花綠果突變材料19144雜交，觀察到F1后代表型為白花綠果；與淡紫花白果突變材料19147雜交，觀察到F1后代表型為淡紫花白果（圖5）。根據(jù)茄子果色上位基因的調(diào)控特點(diǎn)，其中任何一個(gè)位點(diǎn)的純合隱性突變都會(huì)抑制花青素合成，親本都為突變F1代則形成純合隱性的基因型；親本都為突變F1代則形成隱性的dd基因型，果皮均無(wú)法合成花青素，產(chǎn)生了無(wú)花青素沉著的綠果和白果。

圖5 父本19144、父本19147及其與19142雜交后代F1的花和果實(shí)表型

3 討論

3.1 上位基因互作調(diào)控花色和果色

花青素是影響茄子果皮顏色的主要色素之一，研究花青素合成通路關(guān)鍵基因互作對(duì)于茄子果色育種具有重要意義?？刂粕飶?fù)雜性狀的因素包括基因主效應(yīng)、基因間互作效應(yīng)（上位性）以及基因與環(huán)境的互作效應(yīng)[14]。上位性最早在豌豆雜交試驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)兩個(gè)白花的親本雜交時(shí)，F(xiàn)1的花為紫花，F(xiàn)2群體中紫花與白花的分離比為9﹕7，為了解釋這一現(xiàn)象，BATESON提出了上位性的概念[8]。后來(lái)，在豌豆上發(fā)現(xiàn)和位點(diǎn)與豌豆中的花青素色素沉著有關(guān)，基因編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子，在白花突變體中，一個(gè)剪切位點(diǎn)上的SNP（G→A），引起mRNA的錯(cuò)誤剪接，導(dǎo)致終止密碼子提前；基因編碼WD40蛋白，該蛋白有多種突變形式，導(dǎo)致了白花表型[15]。馬鈴薯塊莖顏色遺傳受3個(gè)遺傳位點(diǎn)（和的控制，位點(diǎn)是一種與花青素分布的組織特異性相關(guān)的特殊發(fā)育基因，果實(shí)紅色產(chǎn)生依賴于位點(diǎn)，而紫色依賴于位點(diǎn)[16]。研究證明，馬鈴薯中的位點(diǎn)為編碼R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子[17]，位點(diǎn)對(duì)應(yīng)，位點(diǎn)對(duì)應(yīng)[18]。3個(gè)上位基因、和共同調(diào)控茄子果皮花青素合成[9]。近期，通過(guò)遺傳作圖定位并獲得了和的候選基因分別為[10][10]和[12]本研究中兩個(gè)白果茄子親本雜交，3個(gè)上位基因（和）互作產(chǎn)生紫紅果F1及其F2群體紫色果色單株與白色果色單株分離比為27﹕37的特殊遺傳效應(yīng)，其中母本19141突變了位點(diǎn)，基因型為，父本19142同時(shí)突變了和位點(diǎn)，基因型為，雜交F1基因型為，3個(gè)基因位點(diǎn)雜合，花青素代謝通路打通，所以F1為紫花紫果。前期在其他園藝作物上有果色遺傳受1對(duì)或2對(duì)基因控制的報(bào)道[19-21]，但3個(gè)基因共同控制產(chǎn)生果色特殊分離比還未見(jiàn)報(bào)道。、和互作的3個(gè)基因位點(diǎn)共同決定茄子果皮花青素合成，其中任何一個(gè)基因突變都會(huì)導(dǎo)致果皮不能合成花青素。

3.2 茄子果色上位基因遺傳變異

到目前為止，參與茄子花青素生物合成的結(jié)構(gòu)基因，如、、、[22-23]和[24]，以及調(diào)控基因，如[25]、[26]、[27]已被克隆和驗(yàn)證。（）、（）和（）3個(gè)上位基因位點(diǎn)共同決定茄子果皮花青素合成。本研究中白花白果茄子親本19141的發(fā)生突變[10]，白花白果茄子親本19142的和均發(fā)生突變。BABAK等[28]在紫花白果茄子（無(wú)花青素沉著）材料中檢測(cè)到26 bp缺失和第2內(nèi)含子52 bp插入，26 bp堿基的缺失導(dǎo)致了mRNA第2外顯子缺失，使得蛋白合成受損，這與本研究中白果父本19142的突變形式相同。除了上述的突變形式，還存在多種遺傳變異形式。You等[10]發(fā)現(xiàn)紫花白果茄子親本19147的啟動(dòng)子區(qū)有1個(gè)G堿基的插入，而且在R2結(jié)合域缺失6個(gè)堿基。BABAK等[28]研究發(fā)現(xiàn)果實(shí)無(wú)花青素累積的白花紅茄（）第3外顯子有9核苷酸插入和11個(gè)SNP。WANG等[29]在白果茄子材料CGN18774中發(fā)現(xiàn)在第2外顯子最后一個(gè)堿基處存在一個(gè)SNP（G→C）位點(diǎn)，導(dǎo)致剪切突變，這與本研究19142的突變方式相同，另外efc1材料中剪切識(shí)別位點(diǎn)第2內(nèi)含子的第1堿基由G突變?yōu)锳，也會(huì)導(dǎo)致剪切突變；在綠果茄子（無(wú)花青素沉著）材料的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)起始密碼子上游-301 bp位置的SNP（C→G），影響了與啟動(dòng)子的相互作用，從而影響了的表達(dá)。本研究19142中在第2外顯子的突變方式與WANG等[29]在CGN18774材料上突變的方式一致，但啟動(dòng)子區(qū)域SNP位點(diǎn)發(fā)生位置以及影響的順式調(diào)控元件有所差異，這可能是材料的遺傳背景差異造成的。本研究基于3個(gè)上位基因遺傳變異開(kāi)發(fā)了4個(gè)基因內(nèi)分子標(biāo)記，對(duì)準(zhǔn)確、高效的選育目標(biāo)果色茄子具有重要作用。

3.3 突變上位基因類(lèi)型對(duì)茄子植株不同部位花青素合成的影響

和是花青素合成通路上的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因，其中任何一個(gè)基因突變都會(huì)阻斷整個(gè)代謝通路；對(duì)花青素合成通路結(jié)構(gòu)基因起激活作用，并且在不同組織部位花青素合成特異性調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)本研究基因型與表型聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，和中任何一個(gè)基因隱性純合都會(huì)產(chǎn)生白花白果表型，這與兩對(duì)上位基因控制的茄子果色遺傳規(guī)律一致[11]。本研究中白花白果親本19142與突變親本紫花白果色19147雜交，F(xiàn)1后代（基因型為ddPPYy）表型為紫花白果；均為白花白果的19141與19142雜交E4450F2子代中基因型對(duì)應(yīng)紫花白果表型，這是由于果皮中特異性調(diào)控花青素合成的（）發(fā)生了突變而低表達(dá)，無(wú)法激活結(jié)構(gòu)基因表達(dá)而導(dǎo)致果皮顏色為白色[11]；而花為紫色，則可能是由于其他MYB轉(zhuǎn)錄因子在茄子花的花青素特異合成中發(fā)揮著作用。已有研究表明茄子花色受一對(duì)基因控制，紫花對(duì)白花為完全顯性[30]，茄子花色和果皮顏色為不完全連鎖遺傳[31]。這與本研究的結(jié)果一致，紫花和白花材料雜交F1子代為紫花，白花和白果或綠果連鎖，但紫花有可能是紫紅果也可能是白果或綠果。

4 結(jié)論

2個(gè)白花白果茄子親本雜交F1代果皮呈紫花紫紅色，且F2代白果單株比例大于紫紅果單株比例，這種特殊遺傳規(guī)律是由于其中的一個(gè)親本在花青素合成代謝通路的1個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生了突變，另外一個(gè)親本在花青素合成代謝通路的另外2個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生了突變。兩親本3個(gè)突變基因上位互作產(chǎn)生了F2分離后代有花青素沉著果實(shí)單株和無(wú)花青素沉著果實(shí)單株27﹕37的特殊分離比率。兩個(gè)白果親本雜交F1為紫紅色，是由于3個(gè)上位基因位點(diǎn)、和同時(shí)處于雜合狀態(tài)，花青素合成得以恢復(fù)。

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Analysis of Genetic Effect of Fruit Color Controlled by Epistatic Genes in Eggplant

1Vegetable Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Key Laboratory for New Technology Research of Vegetables, Guangzhou 510640;2College of Horticulture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642;3Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070

【Objective】Fruit color is an important trait that affects the commercial value of eggplant fruit. By analyzing the causes for the special segregation ratio of individual plants with purple red peel and with white peel in the F2population constructed by crossing between two white-fruit parents, this paper could lay the foundation for elucidating the mechanism of epistatic gene interaction on regulating eggplant fruit coloration.【Method】The white-flower and white-peel female parent 19141 with mutation at the structural geneinvolving in the anthocyanin biosynthesis pathway, white-flower and white-peel male parent 19142 with unknown mutation genes involving in the anthocyanin biosynthesis pathway, and their F1population with purple red peel and F2population with separate peel colors were used to explore the epistatic inheritance of eggplant fruit coloration. Genes and their mutation patterns were studied by cloning the known genes,() and() related to peel color in male parent 19142. Molecular basis of peel color-controlling epigenetic genes was analyzed by developing molecular markers based on genetic variations of peel color genes, analyzing the relationship between genotype and phenotype in E4450F2population, and crossing with other eggplant parents without anthocyanin pigmentation in peel.【Result】The segregation ratio of plants with purple red fruit and white fruit in E4450 F2progeny was consistent with the segregation ratio of 27:37 controlled by three pairs of epistatic genes, that is, mutations occurred at thegene locus in 19141, with genotype, and mutations occurred at bothandgene loci in 19142, with genotype. The results of cloning and sequencing showed that alternative splicing occurred inof 19142, which led to the second exon skipping. In 19142, SNP (C→G) in the promoter region’s -326 bp upstream of the start codon resulted in the absence of a CAAT-box cis-acting element ingene. An SNP, G to C, at the last base of the second exon, was annotated as splicing mutation, which might cause abnormal function ofgene in 19142, resulting in the eggplant peel’s inability to synthesize anthocyanin. Based on the genetic variation ofand, the functional molecular markers were developed, and the progenies of E4450F2were genotyped. The results showed that genotype and phenotype were completely consistent.corresponded to phenotypes of purple flower and purple red peel,corresponded to phenotype of purple flower and white peel,_,,,_,andgenotypes corresponded to white flower and white peel phenotypes. When 19142 was crossed with white-peel inbred line 19147 (ddPPYY), and green-peel inbred line 19144 (), it was found that the fruit color of the two F1progenies were white and green, respectively, and there was no anthocyanin pigmentation in the peel, which further proved that 19142 was a double mutantand.【Conclusion】When two eggplant parents without anthocyanin pigmentation in the peel were crossed, the peel of the F1generation had anthocyanidin pigmentation, and the segregation ratio of plants with anthocyanin pigmentation and non-anthocyanin pigmentation in F2population was 27:37, it was because one of the parents had a mutation at a gene locus in the anthocyanin biosynthesis pathway, and the other parent had mutations at two other loci in the anthocyanin biosynthesis pathway. When two parents without anthocyanin pigmentation were crossed, the peel of F1was able to synthesize anthocyanin and present purple red color, which was due to the simultaneous dominance of three epistatic gene loci,and, and anthocyanin biosynthesis was restored. Mutation of the structural gene oforinhibited anthocyanin biosynthesis in all parts of the plant. The regulation of transcription factor mutationwas tissue specific, and its mutation inhibited anthocyanin biosynthesis in the peel, but did not inhabit anthocyanin biosynthesis in the flower.

eggplant; peel color; epistatic gene; anthocyanin; genetic law

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.23.014

2023-06-05；

2023-10-04

廣西科技重大專項(xiàng)（桂科AA22068088）、廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（2023KJ110，2023KJ106）、廣東省級(jí)鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略專項(xiàng)資金種業(yè)振興項(xiàng)目（2022-NPY-00-026）

陳錦溶，E-mail：20213137106@stu.scau.edu.cn。通信作者孫保娟，Tel：020-38469456；E-mail：sunbaojuan@hotmail.com。通信作者李植良，E-mail：vri_li@163.com

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