蘇琦，湯亞飛，佘小漫，藍(lán)國兵，于琳，吳正偉，李正剛，何自福

廣東省蒲瓜病毒種類鑒定及多重RT-PCR檢測方法的建立

蘇琦1,2，湯亞飛2，佘小漫2，藍(lán)國兵2，于琳2，吳正偉1，李正剛2，何自福2

1廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東湛江 524088；2廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640

【目的】探明侵染廣東省蒲瓜的病毒種類，建立一種可以同時(shí)檢測多種蒲瓜病毒的RT-PCR檢測方法，提高蒲瓜病毒種類鑒定效率，為蒲瓜病毒病的精準(zhǔn)監(jiān)測與防控提供依據(jù)?！痉椒ā?018—2022年間，從廣東省廣州市、惠州市、清遠(yuǎn)市、汕頭市和湛江市的蒲瓜主要種植區(qū)采集蒲瓜病毒病疑似樣品78份，對(duì)采集的樣品按照地區(qū)和癥狀進(jìn)行分類，提取每份樣品的總RNA，將一個(gè)地區(qū)具有相同癥狀樣品的RNA等量混合后進(jìn)行小RNA深度測序分析。根據(jù)小RNA深度測序分析結(jié)果，設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，從而明確侵染廣東省蒲瓜的病毒種類。挑選6種檢出率高、危害嚴(yán)重的蒲瓜病毒，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)多重PCR檢測引物，通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立同時(shí)檢測6種蒲瓜病毒的多重RT-PCR方法。【結(jié)果】從采集的78份蒲瓜疑似病毒病樣品中，共檢測到12種病毒，按照檢出率從高到低分別為葫蘆內(nèi)源RNA病毒（alphaendornavirus，LSEV）（64.1%）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）（62.8%）、小西葫蘆虎紋花葉病毒（zucchini tigre mosaic virus，ZTMV）（51.3%）、西瓜綠斑駁花葉病毒（watermelon green mottle mosaic virus，WGMMV）（43.6%）、西瓜病毒A（watermelon virus A，WVA）（32.1%）、番木瓜環(huán)斑病毒（papaya ringspot virus，PRSV）（19.2%）、小西葫蘆黃花葉病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）（9.0%）、瓜類蚜傳黃化病毒（cucurbit aphid-borne yellows virus，CABYV）（7.7%）、中國南瓜曲葉病毒（squash leaf curl China virus，SLCCNV）（7.7%）、瓜類褪綠黃化病毒（cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）（5.1%）、瓜類黃矮失調(diào)病毒（cucurbit yellow stunting disorder virus，CYSDV）（3.8%）、甜瓜黃斑病毒（melon yellow spot virus，MYSV）（1.3%）。78份樣品中，復(fù)合侵染率高達(dá)80.8%，其中2、3、4、5、6和7種病毒復(fù)合侵染的檢出率分別為14.1%、16.7%、23.1%、17.9%、7.7%和1.3%。在多重RT-PCR體系中先加入WVA+CCYV+ZTMV+PRSV引物，12個(gè)反應(yīng)后再加入CGMMV+WGMMV引物，引物體積依次為WVA 0.5mL、CCYV 0.5mL、CGMMV 0.4mL、WGMMV 0.4mL、ZTMV 0.6mL、PRSV 0.6mL，從而確立了一種同時(shí)擴(kuò)增6種病毒的多重RT-PCR檢測方法?！窘Y(jié)論】危害廣東省蒲瓜的主要病毒有12種，其中CGMMV、ZTMV、WGMMV、WVA為優(yōu)勢病毒；復(fù)合侵染現(xiàn)象較普遍，以3、4和5種病毒的復(fù)合侵染形式占比較高；研發(fā)出一種同時(shí)檢測蒲瓜上6種病毒的多重RT-PCR檢測技術(shù)，提高了蒲瓜病毒種類鑒定效率。

蒲瓜；病毒病；小RNA深度測序；RT-PCR檢測；多重PCR方法

0 引言

【研究意義】蒲瓜（）屬葫蘆科葫蘆屬一年生蔓性草本植物，又名葫蘆、瓠瓜等，是葫蘆科主要栽培作物之一，在我國浙江、廣東、福建等長江以南地區(qū)廣泛種植[1]。病毒病是蒲瓜生產(chǎn)上的主要病害之一，在世界各主要種植區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重制約著蒲瓜的安全生產(chǎn)。病毒病造成蒲瓜出現(xiàn)葉片黃化、斑駁、畸形、植株矮小、果實(shí)花皮與畸形等癥狀，鑒定侵染蒲瓜的病毒種類，對(duì)于監(jiān)測病毒病發(fā)生及制定精準(zhǔn)防控措施具有重要的指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】世界范圍內(nèi)侵染葫蘆科作物的病毒超過100種[2]，在中國已發(fā)現(xiàn)可以侵染葫蘆科作物的病毒約35種，其中已知能侵染蒲瓜的病毒有17種，包括小西葫蘆黃花葉病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）、小西葫蘆虎紋花葉病毒（zucchini tigre mosaic virus，ZTMV）、西瓜花葉病毒（watermelon mosaic virus，WMV）、番木瓜環(huán)斑病毒（papaya ringspot virus，PRSV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）、甜瓜黃斑病毒（melon yellow spot virus，MYSV）、瓜類蚜傳黃化病毒（cucurbit aphid-borne yellows virus，CABYV）、甜瓜蚜傳黃化病毒（melon aphid-borne yellows virus，MABYV）、瓜類褪綠黃化病毒（cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）、中國南瓜曲葉病毒（squash leaf curl China virus，SLCCNV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、葫蘆內(nèi)源RNA病毒（alphaendornavirus，LSEV）、西瓜銀灰斑駁病毒（watermelon silver mottle virus，WSMoV）、西瓜綠斑駁花葉病毒（watermelon green mottle mosaic virus，WGMMV）、西瓜病毒A（watermelon virus A，WVA）、甜瓜壞死斑點(diǎn)病毒（melon necrotic spot virus，MNSV）、小西葫蘆綠斑駁花葉病毒（zucchini green mottle mosaic virus，ZGMMV）[2-10]。目前植物病毒的檢測方法有生物學(xué)檢測、血清學(xué)檢測、RT-PCR檢測和核酸雜交檢測等[11]，梁智玲等通過血清學(xué)和RT-PCR相結(jié)合的方法對(duì)蒲瓜上的CGMMV和ZGMMV進(jìn)行檢測[4]。生物學(xué)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力且結(jié)果易受人為因素影響；血清學(xué)方法受制于抗體原因容易出現(xiàn)假陽性[12]；RT-PCR檢測只能針對(duì)已知目標(biāo)病毒進(jìn)行檢測，無法檢測到未知病毒，而小RNA深度測序彌補(bǔ)了這一缺陷。通過小RNA深度測序可以分析出樣品中所有的病毒種類，再通過RT-PCR對(duì)每個(gè)樣品中包含的病毒種類進(jìn)行逐一驗(yàn)證，已逐漸成為國內(nèi)外常見的病毒檢測方法[5]。彭斌等通過小RNA深度測序和RT-PCR檢測相結(jié)合的方法，對(duì)我國部分地區(qū)葫蘆科作物感染的病毒種類進(jìn)行了檢測[7-8]。對(duì)于多種病毒復(fù)合侵染以及需要對(duì)大量樣品進(jìn)行檢測時(shí)，單一引物的PCR檢測方法仍費(fèi)時(shí)費(fèi)力。Chamberian等于1988年提出多重RT-PCR檢測的方法[13]，大大提高了檢測效率，已在生命科學(xué)領(lǐng)域廣泛使用[12-15]。胡新喜等建立了同步檢測辣椒上4種病毒的多重RT-PCR檢測技術(shù)[12]；代玥等建立了同步檢測4種大豆鐮孢菌根腐病病原的多重PCR檢測技術(shù)[16]；多重PCR技術(shù)在葫蘆科病毒的檢測也有應(yīng)用，李莉等建立了可以同步檢測5種西瓜病毒的多重RT-PCR檢測技術(shù)[17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】對(duì)于蒲瓜病毒病種類鑒定已有報(bào)道，但未見對(duì)侵染蒲瓜的病毒進(jìn)行全面鑒定及復(fù)合侵染檢測，也沒有建立針對(duì)蒲瓜病毒種類的快速檢測方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探明侵染危害廣東省蒲瓜的病毒種類及優(yōu)勢病毒，建立蒲瓜病毒種類快速鑒定方法，為蒲瓜病毒病監(jiān)測及防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2018—2022年，從廣東省廣州市、惠州市、清遠(yuǎn)市、汕頭市和湛江市5個(gè)蒲瓜主要種植區(qū)采集疑似蒲瓜病毒病樣品78份，其中廣州市9份、惠州市55份、清遠(yuǎn)市10份、湛江市1份、汕頭市3份。樣品在田間采集后即放入干冰中，之后保存于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃超低溫冰箱中。

1.2 RNA提取

田間樣品利用Trizol（TaKaRa公司）法提取總RNA，提取后的總RNA經(jīng)NanoDrop超微量紫外分光光度計(jì)測定濃度后，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3 小RNA深度測序

將上述采集的蒲瓜樣品按地點(diǎn)和癥狀進(jìn)行分類，然后再將同一地點(diǎn)癥狀相似樣品的總RNA進(jìn)行等量混合，小RNA測序質(zhì)檢和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。之后將測序數(shù)據(jù)通過Virus Detect（http://virusdetect.feilab.net/cgi-bin/virusdetect/ index.cgi）進(jìn)行拼接組裝及Blast比對(duì)。

1.4 RT-PCR檢測

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司。根據(jù)小RNA深度測序結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物（表1）進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 多重RT-PCR特異引物設(shè)計(jì)

在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找WVA、CCYV、CGMMV、WGMMV、ZTMV、PRSV 6種蒲瓜病毒的全長序列，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異檢測引物，既保證能區(qū)分不同屬病毒，又保證區(qū)分同屬之間的不同病毒種。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.6 多重RT-PCR檢測

引物序列以及體積見表2，首先將WVA、CCYV、PRSV、ZTMV引物加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)總體系（30mL）：cDNA 2.5mL；正向引物F 0.4—0.6mL；反向引物R 0.4—0.6mL；2×T5 Super PCR Mix 15mL；5×Enhancer Buffer 5mL；DEPC-H2O 1.5mL。以98 ℃3 min；98 ℃10 s；55 ℃15 s；72 ℃30 s；72 ℃5 min；12 ℃∞的程序進(jìn)行12個(gè)循環(huán)，再加入CGMMV、WGMMV的引物，以98 ℃3 min；98 ℃10 s；55 ℃15 s；72 ℃30 s；72 ℃5 min；12 ℃∞進(jìn)行27個(gè)循環(huán)。2×T5 Super PCR Mix試劑購自擎科生物科技有限公司。使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，DNA Marker（GL DNA Marker 100 Ladder）購自艾科瑞生物公司。

表1 常規(guī)PCR檢測所用引物

表2 多重RT-PCR檢測引物

2 結(jié)果

2.1 廣東省蒲瓜病毒病田間調(diào)查情況

2018—2022年，對(duì)廣東省廣州市、惠州市、清遠(yuǎn)市、汕頭市和湛江市主要蒲瓜種植區(qū)進(jìn)行了調(diào)查監(jiān)測，蒲瓜病毒病田間發(fā)病率一般在3%—41%，嚴(yán)重的可達(dá)80%，甚至100%。主要癥狀為泡狀、皺縮、褪綠、黃化、卷葉、果實(shí)變色和果實(shí)畸形等（圖1）。

A—C：田間蒲瓜葉片泡狀、皺縮、斑駁等發(fā)病癥狀Bottle gourd leaves showing bubble, wrinkle, and mottle symptoms in the fields；D：田間蒲瓜植株整體發(fā)病癥狀Overall symptoms of diseased bottle gourd plants in the fields；E、F：田間蒲瓜果實(shí)斑駁、畸形等發(fā)病癥狀mottled and deformed bottle gourd fruits in the fields

2.2 小RNA深度測序結(jié)果及RT-PCR驗(yàn)證

在田間采集典型病毒病樣品78份，帶回實(shí)驗(yàn)室提取總RNA。將從每個(gè)地方采集的樣品按癥狀進(jìn)行分類，并將相似癥狀樣品的RNA等量混合成一管進(jìn)行小RNA深度測序分析。為驗(yàn)證小RNA測序結(jié)果，用RT-PCR方法檢測每個(gè)樣品中包含的病毒種類。根據(jù)小RNA測序結(jié)果，設(shè)計(jì)了12種病毒的特異性引物，進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，共鑒定出12種病毒（表3），分屬于8個(gè)屬，分別為正番茄斑萎病毒屬（）的MYSV，毛形病毒屬（）的CCYV和瓜類黃矮失調(diào)病毒（cucurbit yellow stunting disorder virus，CYSDV），菜豆金黃花葉病毒屬（）的SLCCNV，馬鈴薯卷葉病毒屬（）的CABYV，西瓜病毒A屬（）的WVA，馬鈴薯Y病毒屬（）的PRSV、ZTMV和ZYMV，甲型內(nèi)源病毒屬（）的LSEV，煙草花葉病毒屬（）的CGMMV和WGMMV。

表3 78份蒲瓜樣品中檢測到的病毒

2.3 廣東省蒲瓜病毒的檢出率及分布范圍分析

檢測到的12種病毒檢出率分別為LSEV（64.1%）、CGMMV（62.8%）、ZTMV（51.3%）、WGMMV（43.6%）、WVA（32.1%）、PRSV（19.2%）、ZYMV（9.0%）、CABYV（7.7%）、SLCCNV（7.7%）、CCYV（5.1%）、CYSDV（3.8%）、MYSV（1.3%）（圖2-A）。不同地區(qū)病毒種類有所差異，惠州市檢測到以上全部12種病毒；廣州市檢測到CGMMV、ZTMV、WGMMV、WVA、LSEV 5種病毒；清遠(yuǎn)市檢測到CGMMV、WVA、ZTMV、ZYMV 4種病毒；汕頭市僅檢測到CGMMV；湛江市檢測到WVA、LSEV、ZTMV 3種病毒。所檢測到的(+) ssRNA病毒主要屬于5個(gè)屬，(-) ssRNA病毒為屬，dsRNA病毒為屬，以及ssDNA病毒為屬。其中8個(gè)屬的病毒檢出率分別為（82.1%）、（64.1%）、（59.0%）、（32.1%）、s（7.7%）、（7.7%）、（5.1%）、（1.3%）（圖2-B）。

A：78份蒲瓜樣品中12種病毒的檢出率，病毒的檢出率從上到下逐漸降低The infection rate of 12 viruses in 78 samples of bottle gourd. From top to bottom, the infection rate is gradually lower；B：78份蒲瓜樣品中12種病毒對(duì)應(yīng)的8個(gè)屬的檢出率，檢出率從上到下逐漸降低The infection rate of 12 viruses corresponding to 8 genera in 78 samples of bottle gourd. From top to bottom, the infection rate is gradually lower

2.4 廣東省蒲瓜病毒復(fù)合侵染分析

廣東省蒲瓜存在多種類型的病毒復(fù)合侵染情況（表4）。在78份病樣中，一種病毒侵染的僅有9份，其余感染情況均為復(fù)合侵染，2種病毒感染的有11份，占14.1%；3種病毒感染的有13份，占16.7%；4種病毒感染的有18份，占23.1%；5種病毒感染的有14份，占17.9%；6種病毒感染的有6份，占7.7%；7種病毒感染的有1份，占1.3%（圖3）。其中占比較高的組合，2種感染類型的為CGMMV+WVA、CGMMV+WGMMV；3種感染類型的為CGMMV+ LSEV+ZTMV、LSEV+WGMMV+ZTMV；4種感染類型的為CGMMV+WVA+LSEV+WGMMV、WGMMV+ CGMMV+LSEV+ZTMV；5種感染類型的為CGMMV+ WVA+LSEV+ZTMV+WGMMV、ZTMV+LSEV+PRSV+ WGMMV+CGMMV、CGMMV+LSEV+WGMMV+ ZTMV+CABYV（表4）。

圖3 78份樣品中不同種類病毒復(fù)合侵染比例

2.5 多重RT-PCR

挑選檢出率較高的6種病毒W(wǎng)VA、CCYV、CGMMV、WGMMV、ZTMV、PRSV，建立蒲瓜病毒多重RT-PCR快速檢測體系。LSEV為內(nèi)源病毒，可侵染植物、真菌甚至卵菌，也可以種傳，但在植物上一般不造成典型病毒癥狀，因此未將其列為重點(diǎn)檢測對(duì)象。ZYMV在2018與2019年檢出率較高，近年來在蒲瓜上少有發(fā)現(xiàn)，而CCYV在蒲瓜上近年來有逐漸升高的趨勢，因此將其列為重點(diǎn)檢測病毒之一。從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找以上6種病毒的全長序列，并設(shè)計(jì)擴(kuò)增不同片段長度的引物（表2）。從78份蒲瓜樣品中，挑選了8個(gè)蒲瓜發(fā)病樣品進(jìn)行測試，通過對(duì)反應(yīng)條件的不斷優(yōu)化，最終確定在多重RT-PCR體系中先加入WVA+CCYV+ZTMV+PRSV引物，12個(gè)反應(yīng)后再加入WGMMV+CGMMV引物，引物體積依次為，WVA 0.5mL、CCYV 0.5mL、CGMMV 0.4mL、WGMMV 0.4mL、ZTMV 0.6mL、PRSV 0.6mL。結(jié)果顯示，在陽性對(duì)照樣品中可以同時(shí)擴(kuò)出6條大小不一的條帶，對(duì)應(yīng)6種病毒，其他樣品也可以擴(kuò)增到不同長度的目的條帶（圖4-A）。為驗(yàn)證多重RT-PCR檢測準(zhǔn)確性，利用單一病毒引物對(duì)8個(gè)蒲瓜樣品進(jìn)行逐一檢測，結(jié)果顯示與多重RT-PCR檢測結(jié)果一致（圖4-B）。

3 討論

3.1 侵染蒲瓜的病毒

本文通過小RNA深度測序和RT-PCR兩種方法相結(jié)合，對(duì)廣東省內(nèi)的蒲瓜病毒種類進(jìn)行檢測，共鑒定出12種病毒，分別為LSEV、CGMMV、ZTMV、WGMMV、WVA、PRSV、ZYMV、CABYV、SLCCNV、CCYV、CYSDV和MYSV。LSEV、CGMMV、ZTMV、WGMMV和WVA這5種病毒檢出率均在30%以上，其中，LSEV檢出率最高，但研究發(fā)現(xiàn)LSEV屬于內(nèi)源RNA病毒，一般是潛伏侵染，感染的植株沒有任何發(fā)病癥狀[18]。雖然不能引起植株的表型變化，但是檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)LSEV多為種子帶毒，屬于侵染蒲瓜的一種病毒，在與其他病毒共同侵染蒲瓜時(shí)可能存在相互作用，對(duì)蒲瓜生長影響未知，所以將其列入復(fù)合侵染統(tǒng)計(jì)之內(nèi)。CGMMV、ZTMV、WGMMV、WVA在4個(gè)市蒲瓜主產(chǎn)區(qū)都有分布，是目前廣東省危害蒲瓜較嚴(yán)重和較普遍的病毒，為優(yōu)勢病毒。前人對(duì)廣東省蒲瓜病毒有相關(guān)報(bào)道，分別檢測到WGMMV、CCYV、CGMMV、LSEV、PRSV、SLCCNV、WSMoV、WVA、ZTMV、ZYMV和MYSV，并認(rèn)為廣東省蒲瓜上的優(yōu)勢病毒為WGMMV、CGMMV[3,6]。

本研究的蒲瓜樣品中，除WSMoV未檢測到外，其余已發(fā)現(xiàn)的病毒均可檢測到，同時(shí)還新檢測到CABYV和CYSDV兩種病毒。CABYV屬于黃癥病毒科（）馬鈴薯卷葉病毒屬（）[19]，可以侵染多種葫蘆科作物，于1992年在法國首次被發(fā)現(xiàn)[20]，2006年在我國9種葫蘆科作物上檢測到該病毒[21]。CABYV屬于韌皮部局限病毒，主要以棉蚜（）和桃蚜（）進(jìn)行循回、持久、非增殖型的傳播[22]。CYSDV屬于長線形病毒科（）毛形病毒屬（），包含兩條正義單鏈RNA，通過煙粉虱（）以半持久非循回型的方式進(jìn)行傳播[23]。CYSDV是韌皮部發(fā)生病毒[24]，可以侵染葫蘆科作物、一些雜草以及萵苣和苜蓿[25]，1982年首次發(fā)現(xiàn)于阿拉伯聯(lián)合酋長國，之后在中東、地中海和北美地區(qū)也有發(fā)現(xiàn)，并且研究表明該病毒造成的危害逐年加重，甚至在一些瓜類作物上造成80%以上的經(jīng)濟(jì)損失[26]。

表4 病毒復(fù)合侵染的類型及數(shù)量

Marker：100 Ladder；Positive control：含6種病毒的陽性對(duì)照positive control containing six viruses；PG 1—8：從78份蒲瓜樣品挑選的樣品samples selected from a total of 78 bottle gourd samples。A：多重PCR混合引物檢測結(jié)果Detection result of multiplex PCR with mixed primer pairs；B：單一引物檢測結(jié)果Detection result with single primer pair

各地葫蘆科作物感染病毒種類不盡相同，蒲瓜病毒種類也有所差異，但復(fù)合侵染現(xiàn)象普遍存在。江蘇省的葫蘆科蔬菜中共檢測出9種病毒，檢出率從高到低依次為ZYMV、WMV、CABYV、PRSV、CMV、CCYV、CGMMV、SqMV和TMV，危害較為嚴(yán)重的主要為馬鈴薯Y病毒屬病毒[9]，復(fù)合侵染率為32.96%，同時(shí)在蒲瓜上發(fā)現(xiàn)了WMV+CMV的侵染組合。山東省也檢測到9種病毒，檢出率由高到低依次為TMV、CMV、ZYMV、WMV、CGMMV、SqMV、MYSV、CCYV、MNSV，危害較為嚴(yán)重的主要為煙草花葉病毒屬和黃瓜花葉病毒屬病毒，也存在復(fù)合侵染情況[27]。河南省葫蘆科作物發(fā)現(xiàn)9種病毒，分別為ZYMV、WMV、CMV、CABYV、MABYV、MNSV、CLCV、ZTMV和PLDMV，危害較為嚴(yán)重的主要為馬鈴薯Y病毒屬病毒，復(fù)合侵染率達(dá)48.8%[8]。在陜西省檢測到TMV、ZYMV、CMV、CGMMV、PRSV和WMV，CMV和ZYMV是葫蘆科作物主要發(fā)生病毒，復(fù)合侵染現(xiàn)象普遍存在[28]。本文并未在廣東省蒲瓜的病毒檢測中發(fā)現(xiàn)WMV、SqMV、TMV、MABYV、CLCV、PLDMV和MNSV，且廣東省蒲瓜病毒的復(fù)合侵染率高達(dá)80.8%，復(fù)合侵染率遠(yuǎn)高于有數(shù)據(jù)報(bào)道的其他省份。

3.2 植物病毒多重RT-PCR技術(shù)

對(duì)于大批量病毒檢測及多種病毒復(fù)合侵染的檢測，多重RT-PCR方法更為便捷、省時(shí)且快速。在多重RT-PCR檢測中，由于引物之間的相互影響，很有可能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，從而無法檢測出目標(biāo)病毒或是出現(xiàn)非目標(biāo)條帶[29]。多重RT-PCR的靈敏度一直是制約其檢測的主要問題之一[17,30-32]，影響其靈敏度的因素較多。研究中發(fā)現(xiàn)，不同引物的濃度和用量對(duì)檢測結(jié)果有直接影響，增加引物用量并不能提高目標(biāo)條帶的亮度，甚至較高的引物用量會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)條帶消失，適當(dāng)?shù)囊餄舛群陀昧坎趴梢蕴岣叨嘀豏T-PCR的靈敏度。同時(shí)，退火溫度對(duì)靈敏度也有著直接影響，探索合理的退火溫度對(duì)于提高靈敏度也尤為重要，另外樣品中病毒的含量、檢測試劑和檢測體系等因素對(duì)多重RT-PCR靈敏度也存在一定的影響。

本研究將設(shè)計(jì)的6對(duì)多重RT-PCR檢測引物混合加入到反應(yīng)體系中，通過調(diào)整6對(duì)引物的不同添加順序，擴(kuò)增出包含WVA、CCYV、CGMMV、WGMMV、ZTMV和PRSV 6種病毒的目的條帶，同時(shí)每個(gè)田間樣品也都檢測到符合預(yù)期的目的條帶，且大小準(zhǔn)確、條帶明顯。筆者發(fā)現(xiàn)引物添加順序?qū)z測結(jié)果有直接影響，在嘗試了多種引物添加順序后最終確定了“兩步法”引物添加方法，檢測特異性和擴(kuò)增效率均較好，為蒲瓜病毒的種類鑒定提供了一種便捷、高效且準(zhǔn)確的方法。

4 結(jié)論

鑒定出危害廣東省蒲瓜的病毒12種，分別為LSEV、CGMMV、ZTMV、WGMMV、WVA、PRSV、ZYMV、CABYV、SLCCNV、CCYV、CYSDV、MYSV；其中CGMMV、ZTMV、WGMMV和WVA是危害廣東省蒲瓜的優(yōu)勢病毒；復(fù)合侵染普遍，以3、4和5種病毒復(fù)合侵染為主要形式；建立了一種同時(shí)檢測6種蒲瓜病毒的多重PCR檢測技術(shù)體系，可用于田間蒲瓜樣品的快速檢測。

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Identification of viruses infecting Bottle gourd in Guangdong Province and establishment of multiplex RT-PCR Detection method

SU Qi1,2, TANG YaFei2, SHE XiaoMan2, LAN GuoBing2, YU Lin2, WU ZhengWei1, LI ZhengGang2, HE ZiFu2

1College of Coastal Agricultural Sciences, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, Guangdong;2Plant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Guangzhou 510640

【Objective】The objective of this research is to determine the various viruses that infect bottle gourd, establish a multiplex RT-PCR detection method that can simultaneously detect multiple bottle gourd viruses, so as to enhance the efficiency of identifying bottle gourd virus species, and provide a foundation for accurate prevention and control of bottle gourd viral diseases.【Method】From 2018 to 2022, 78 bottle gourd samples of suspected virus infection were collected from the main planting areas of bottle gourd in Guangdong province, including Guangzhou, Huizhou, Qingyuan, Shantou, and Zhanjiang. The collected samples were sorted by region and symptom, and the total RNA of each sample was extracted. The RNA samples with similar symptoms from each region were mixed for small RNA deep sequencing analysis. According to the results of small RNA deep sequencing analysis, specific primers were designed for RT-PCR verification to identify the specific virus species infecting bottle gourd in Guangdong province. six viruses with higher incidence and more losses were selected, and multiplex PCR detection primers based on the GenBank database were designed. After optimizing the reaction system and conditions, a method for simultaneous detection of all six viruses via multiplex RT-PCR was established.【Result】A total of 12 viruses were detected in 78 bottle gourd samples of suspected virus infection. These viruses were ranked in order of infection rate, from highest to lowest:alphaendornavirus (LSEV) (64.1%), cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) (62.8%), zucchini tigre mosaic virus (ZTMV) (51.3%), watermelon green mottle mosaic virus (WGMMV) (43.6%), watermelon virus A (WVA) (32.1%), papaya ringspot virus (PRSV) (19.2%), zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) (9.0%), cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV) (7.7%), squash leaf curl China virus (SLCCNV) (7.7%), cucurbit chlorotic yellows virus (CCYV) (5.1%), cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV) (3.8%), melon yellow spot virus (MYSV) (1.3%). It was found that 80.8% of the 78 samples were infected with multiple viruses. The types of mixed infection included 2 viruses (14.1%), 3 viruses (16.7%), 4 viruses (23.1%), 5 viruses (17.9%), 6 viruses (7.7%) and 7 viruses (1.3%), respectively. The WVA+CCYV+ZTMV+PRSV primers were added firstly in the multiplex RT-PCR system, followed by the WGMMV+ CGMMV primers after 12 reaction cycles. The volumes of primers were used: WVA 0.5 μL, CCYV 0.5 μL, CGMMV 0.4 μL, WGMMV 0.4 μL, ZTMV 0.6 μL, and PRSV 0.6 μL. Thus, a multiplex RT-PCR assay capable of simultaneously amplifying six viruses was established.【Conclusion】There are 12 primary viruses that infect bottle gourd in Guangdong Province. Among them, CGMMV, ZTMV, WGMMV, and WVA are the most predominant viruses. Mixed infection is a commonly observed phenomenon, with three, four, and five viruses’ co-infection being the most prevalent types. A multiplex RT-PCR detection method has been developed to simultaneously identify six viruses in bottle gourd, which improves the detection efficiency of virus species in bottle gourd.

bottle gourd; virus disease; small RNA deep sequencing; RT-PCR detection; multiplex PCR method

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.23.010

2023-08-04；

2023-08-27

國家自然科學(xué)基金（32272509）、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)學(xué)科團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（202103TD，202105TD）、廣州市科技計(jì)劃（202102020504）、廣州市青年科技人才托舉項(xiàng)目（QT-2023-040）、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技人才培養(yǎng)專項(xiàng)（R2023PY-JX011）、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（XT202210）

蘇琦，E-mail：sq1827266@163.com。通信作者何自福，E-mail：hezf@gdppri.com。通信作者李正剛，E-mail：lizhenggang@gdppri.com

（責(zé)任編輯 岳梅）