張亞林，蔣艷，趙麗紅，馮自力，馮鴻杰，魏鋒，周京龍，朱荷琴，馬峙英

溫度對(duì)棉花黃萎病發(fā)生及寄主防御反應(yīng)的影響

張亞林1,2，蔣艷2，趙麗紅2，馮自力2，馮鴻杰2，魏鋒2，周京龍2，朱荷琴2，馬峙英1

1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省作物種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071000；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物育種與綜合利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽(yáng) 455000

【目的】解析不同溫度對(duì)棉花黃萎病發(fā)生的影響以及調(diào)控寄主防御反應(yīng)的機(jī)理，揭示溫度對(duì)病原菌和寄主的雙重作用，為該病害的綠色防控和溫度調(diào)控研究提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳悦藁共∑贩N中植棉2號(hào)（ZZM2）、感病品種冀棉11（JM11）為試驗(yàn)材料，采用室內(nèi)實(shí)驗(yàn)與病圃實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，設(shè)置恒定溫度（22、25、28和32 ℃）、自然變溫兩個(gè)處理，檢測(cè)溫度對(duì)大麗輪枝菌（）生長(zhǎng)、侵染定殖、棉花黃萎病發(fā)生的影響；通過(guò)調(diào)查活性氧（ROS）爆發(fā)、過(guò)氧化氫（H2O2）含量、胼胝質(zhì)積累、防御相關(guān)基因表達(dá)水平等植物防御相關(guān)指標(biāo)，解析溫度調(diào)控棉花寄主防御反應(yīng)的機(jī)制。【結(jié)果】在培養(yǎng)基上，25 ℃是大麗輪枝菌菌絲生長(zhǎng)最適溫度，22—28 ℃范圍內(nèi)適宜產(chǎn)孢；與培養(yǎng)基相比，不同棉花品種的葉片提取液對(duì)大麗輪枝菌生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，感病品種JM11促進(jìn)作用更強(qiáng)；當(dāng)溫度為25—28 ℃時(shí)，ZZM2和JM11植株黃萎病發(fā)生均較重，低溫22 ℃、高溫32 ℃均不利于黃萎病發(fā)生。同時(shí)，在25 ℃處理下，棉花中大麗輪枝菌侵染定殖能力強(qiáng)，感病品種JM11比抗病品種ZZM2更易受到大麗輪枝菌的侵染，與棉花黃萎病病情指數(shù)的結(jié)果基本一致；進(jìn)一步，溫度顯著影響了棉花寄主防御反應(yīng)：與22—28 ℃相比，無(wú)論是否接種大麗輪枝菌，ZZM2和JM11在32 ℃處理下產(chǎn)生的ROS爆發(fā)更強(qiáng)烈；在25 ℃處理下，ZZM2和JM11葉片中H2O2含量最低；在32 ℃處理下，ZZM2和JM11葉片胼胝質(zhì)積累量較高，分別為817、575個(gè)/mm2，是未接菌對(duì)照的2.04、1.80倍；棉花葉片中、、防御相關(guān)基因在25—28 ℃處理下表達(dá)量降低，低于22、32 ℃處理。【結(jié)論】溫度對(duì)大麗輪枝菌生長(zhǎng)、寄主防御反應(yīng)具有雙重作用，進(jìn)而影響棉花黃萎病發(fā)生。其中無(wú)論恒定溫度、自然變溫，25—28 ℃均有利于大麗輪枝菌在棉花中侵染定殖，顯著降低寄主防御反應(yīng)，導(dǎo)致棉花黃萎病嚴(yán)重發(fā)生。

溫度；棉花黃萎病；大麗輪枝菌；防御反應(yīng)；侵染

0 引言

【研究意義】棉花是一種重要的天然纖維作物，作為戰(zhàn)略物資在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中的地位舉足輕重[1]。棉花黃萎病是由大麗輪枝菌（）侵染引起的典型土傳維管束病害[2-3]，造成棉花產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降，已成為威脅棉花產(chǎn)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一[4]。棉花黃萎病的發(fā)生流行取決于病原菌、寄主植物和環(huán)境三要素的綜合作用，其中溫度是最重要的環(huán)境因素之一[5-6]。全球溫度升高、極端氣溫波動(dòng)是未來(lái)幾十年氣候變化的一個(gè)重要趨勢(shì)，可能改變病害的流行區(qū)域、消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)并導(dǎo)致新致病菌株和病原菌的流行[7]。因此，解析不同溫度對(duì)棉花黃萎病發(fā)生的影響以及調(diào)控寄主防御反應(yīng)的機(jī)理，揭示溫度對(duì)病原菌和寄主的雙重作用，對(duì)該病害的綠色防控和溫度調(diào)控研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】“流行病學(xué)三角”概念突出了植物、病原體與環(huán)境的相互作用，棉花黃萎病的發(fā)生除了與病原菌的致病性、寄主的抗病性有關(guān)，還受到環(huán)境的影響[8]。氣溫是限制黃萎病發(fā)生流行的主要因素，棉花黃萎病發(fā)生最適溫度為25—28 ℃，低于22 ℃或高于33 ℃不利于發(fā)病，超過(guò)35 ℃出現(xiàn)隱癥。棉花黃萎病的發(fā)生與相對(duì)濕度也有一定的關(guān)系，當(dāng)相對(duì)濕度55%時(shí)，發(fā)病株率為65%，相對(duì)濕度65%時(shí)，發(fā)病株率升至70%[9]。當(dāng)田間環(huán)境滿足低溫、多雨和高濕度3個(gè)條件會(huì)導(dǎo)致黃萎病嚴(yán)重發(fā)生[10-12]。此外，播期和光照對(duì)棉花黃萎病發(fā)生也有影響[13]。同時(shí)，溫度變化還會(huì)影響植物的防御系統(tǒng)，包括R基因介導(dǎo)的誘導(dǎo)抗性和基礎(chǔ)抗性，有研究報(bào)道，溫度變化可以通過(guò)改變R基因的表達(dá)水平、R基因介導(dǎo)的信號(hào)通路以及R蛋白的穩(wěn)定性來(lái)改變其抗性[14]，基礎(chǔ)抗性也可能受到溫度變化的影響[15-16]。在擬南芥中，病原菌相關(guān)的分子模式flg 22優(yōu)先誘導(dǎo)基礎(chǔ)抗性標(biāo)記基因和的表達(dá)，并在28 ℃處理15 min時(shí)激活MAPK，而當(dāng)溫度高于或低于28 ℃時(shí)，這些標(biāo)記基因的激活程度降低[17]，暫時(shí)的高溫抑制flg 22誘導(dǎo)的活性氧（ROS）積累[18]。最近的一項(xiàng)研究利用水稻與稻瘟病菌（）互作系統(tǒng)，解析了溫度調(diào)控植物抵抗病原真菌的機(jī)制，結(jié)果表明，22 ℃時(shí)水稻中茉莉酸合成減少，導(dǎo)致寄主基礎(chǔ)抗性降低，稻瘟病菌侵染能力增強(qiáng)；而在28 ℃下，稻瘟病菌誘導(dǎo)茉莉酸的合成，并激活茉莉酸信號(hào)途徑，提高了水稻對(duì)稻瘟病的基礎(chǔ)抗性水平，抑制稻瘟病發(fā)生[19]。在小麥中，含有起始結(jié)構(gòu)域的一種激酶Yr36在35 ℃下對(duì)條銹菌（f. sp.）的幾個(gè)小種具有廣譜抗性，但在20 ℃以下則失效[20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】全球溫度升高、極端氣溫波動(dòng)是未來(lái)氣候變化的一個(gè)重要趨勢(shì)，溫度是影響棉花黃萎病發(fā)生的關(guān)鍵因素，因此，亟需深入解析溫度對(duì)病原菌和寄主的雙重作用，以便進(jìn)一步揭示棉花黃萎病發(fā)病規(guī)律?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用室內(nèi)實(shí)驗(yàn)與病圃實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，以棉花抗、感病對(duì)照品種為研究對(duì)象，系統(tǒng)解析恒定溫度和自然變溫對(duì)大麗輪枝菌侵染、寄主防御反應(yīng)的影響，揭示溫度對(duì)病原菌和寄主的雙重作用，為有效防治黃萎病和溫度調(diào)控研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試棉花品種為國(guó)家棉花品種抗病性鑒定中的典型對(duì)照品種：抗病品種中植棉2號(hào)（ZZM2）、感病品種冀棉11（JM11），供試黃萎病菌：強(qiáng)致病力菌株Vd080（菌種編號(hào)：CGMCC NO. 5904），均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花病害防控團(tuán)隊(duì)提供。試驗(yàn)于2022年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所人工接種棉花黃萎病菌病圃（河南安陽(yáng)）完成。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.2.1 溫度對(duì)大麗輪枝菌生長(zhǎng)的影響 孢子懸浮液制備：在已活化的Vd080平板上挑取兩塊菌餅接種于查氏培養(yǎng)基（Czapek）中，于振蕩培養(yǎng)箱25 ℃、150 r/mim條件下培養(yǎng)7 d后用四層紗布過(guò)濾，得到的濾液借助血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子濃度，并調(diào)整至1×107cfu/mL，備用。

不同抗性棉花葉片提取液制備：稱取0.20 g JM11和ZZM2植株葉片，液氮研磨后加入500 μL無(wú)菌水，置于10 000 r/min離心3 min，取上清液于0.45 μm濾膜過(guò)濾得到葉片提取液，備用。

溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：分別將200 μL JM11和ZZM2植株葉片提取液均勻涂抹在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，等量無(wú)菌水為對(duì)照，用打孔器取6 mm菌落外緣生長(zhǎng)旺盛的Vd080菌餅放置于PDA培養(yǎng)基中心處，置于22、25、28、32 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，每個(gè)處理重復(fù)3次，利用十字交叉法測(cè)定Vd080的菌落直徑。

溫度對(duì)產(chǎn)孢量的影響：吸取1 mL 1×107cfu/mL孢子懸浮液于40 mL Czapek培養(yǎng)基中，分別于培養(yǎng)基中再加入JM11和ZZM2植株葉片提取液400 μL，等量無(wú)菌水為對(duì)照，置于22、25、28、32 ℃的振蕩培養(yǎng)箱中150 r/min培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，于48 h后測(cè)定孢子濃度。

1.2.2 恒定溫度對(duì)棉花黃萎病發(fā)生的影響 采用蛭石沙土無(wú)底紙缽定量蘸菌液法[21]，將營(yíng)養(yǎng)土、沙子、蛭石按體積比1﹕2﹕3混勻裝入無(wú)底紙缽（直徑6 cm，高度10 cm）中。每缽種植10粒棉花種子，覆土2 cm，以6個(gè)無(wú)底紙缽為一個(gè)處理，每缽定苗5株。在同一溫室中培育20 d左右，待第一片真葉平展開(kāi)時(shí)接種Vd080孢子懸浮液（10 mL，濃度1×107cfu/mL），等量Czapek培養(yǎng)液為未接菌對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。接菌后分別放置于恒定溫度22、25、28、32 ℃的光照培養(yǎng)箱培育。

于7、21、28 dpi（days post inoculation）調(diào)查不同溫度下棉花黃萎病的發(fā)生情況，計(jì)算病情指數(shù)。棉花黃萎病病情指數(shù)計(jì)算公式為Σ[（×）/（×4）]×100。式中，為病情指數(shù)，為各級(jí)病株數(shù)，為病級(jí)數(shù)值，為調(diào)查總株數(shù)[22]。

1.2.3 恒定溫度對(duì)大麗輪枝菌定殖的影響 于1、4、7、10、13、16、19 dpi隨機(jī)選取棉花根部，液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存。采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN）提取RNA，進(jìn)一步采用試劑盒TransScript? All-in-One First-Strand cDNA Synthesis Super Mix for qPCR（One-Step gDNA Removal）進(jìn)行cDNA合成，以棉花為內(nèi)參，檢測(cè)基因?yàn)榇篼愝喼?，測(cè)定棉花根部中大麗輪枝菌的定殖量[23]。采用2-ΔΔCt方法分析處理數(shù)據(jù)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.4 溫度對(duì)棉花防御反應(yīng)的影響 對(duì)棉花防御相關(guān)基因表達(dá)的影響：隨機(jī)選取棉花葉片提取RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，方法同1.2.3所述。通過(guò)RT-qPCR測(cè)定棉花葉片中防御相關(guān)基因苯丙氨酸氨裂合酶基因（phenylalanine ammonia-lyase，）、過(guò)氧化物酶基因（peroxidase gene，）、多酚氧化酶基因（polyphenol oxidase gene，）的表達(dá)量[24]，采用2-ΔΔCt方法處理數(shù)據(jù)。引物序列見(jiàn)表1。

對(duì)棉花葉片中活性氧爆發(fā)的影響：于2 dpi隨機(jī)選取3葉齡棉花第一片真葉，用無(wú)菌水沖洗2—3遍，接著放置于裝有5 mL濃度為1 mg·mL-13,3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染液的50 mL離心管中，用錫紙包裹，室溫避光染色。8 h后輕輕倒掉染料，加入10 mL 95%乙醇于沸水中水浴2 min，脫去部分葉綠素。去除液體后，加入10 mL無(wú)水乙醇繼續(xù)于沸水中水浴，直至葉片中綠色完全褪去。去除液體，并將葉片完全浸沒(méi)在20 mL 70%的甘油中，以充分趕走細(xì)胞間存在的氣泡。將葉片平鋪放置在載玻片上，采用體視顯微鏡（Leica M165FC）進(jìn)行觀察[25]。

對(duì)棉花葉片中過(guò)氧化氫含量的影響：于2 dpi隨機(jī)選取3葉齡棉花第一片真葉，稱取0.10 g棉花葉片，加入1 mL丙酮進(jìn)行冰浴勻漿，8 000 r/min 4 ℃離心10 min，取全部上清液，采用H2O2含量檢測(cè)試劑盒（SOLARBIO）測(cè)定其含量。

對(duì)棉花葉片中胼胝質(zhì)積累的影響：于2 dpi隨機(jī)選取3葉齡棉花第一片真葉，用無(wú)菌水沖洗2—3遍，放置于50 mL離心管中。配置乙醇﹕乙酸（3﹕1）固定液5 mL加入離心管中，靜置2—3 h脫去葉綠素。去除固定液，將葉片置于10 mL 70%乙醇浸泡2 h，去除廢液，于10 mL 50%乙醇浸泡2 h，吸干表面水分，加入10 mL無(wú)菌水浸泡8 h。去除液體后，加入10% NaOH溶液處理2 h，直至葉片完全透明。用無(wú)菌水漂洗葉片2—3次，加入5 mL 0.01%苯胺藍(lán)染液，用錫紙包裹，避光染色4 h。染色結(jié)束后于體視顯微鏡（Leica M165FC）下用紫外光觀察胼胝質(zhì)的積累[26]。

1.2.5 自然變溫對(duì)棉花黃萎病發(fā)生的影響 實(shí)驗(yàn)地位于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所人工接種棉花黃萎病菌病圃（河南安陽(yáng)），棉花黃萎病發(fā)生均勻。于病圃中種植JM11、ZZM2，每個(gè)品種種植面積為30 m2，3次重復(fù)，詳細(xì)記錄7—8月氣溫?cái)?shù)據(jù)。定期調(diào)查棉花黃萎病發(fā)生情況，計(jì)算病情指數(shù)。

每隔7 d隨機(jī)選取棉花植株倒四葉（以棉花植株頂端完全平展的葉子為倒一葉），用液氮冷凍后，置于-80 ℃冰箱保存。采用RT-qPCR測(cè)定葉片中大麗輪枝菌的定殖量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用軟件Microsoft Office Excel 2016對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理計(jì)算，利用軟件GraphPad Prism 8作圖，并采用鄧肯新復(fù)極差法比較處理之間的差異顯著性，Adobe Illustrator 2021進(jìn)行圖形編輯。

2 結(jié)果

2.1 溫度對(duì)大麗輪枝菌生長(zhǎng)的影響

2.1.1 對(duì)大麗輪枝菌菌絲生長(zhǎng)的影響 大麗輪枝菌在22—28 ℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，25 ℃最適宜菌絲生長(zhǎng)，32 ℃處理下菌絲不能生長(zhǎng)。與對(duì)照相比，添加棉花葉片提取液的PDA培養(yǎng)基有利于Vd080菌絲生長(zhǎng)，菌落直徑較大（圖1-A）。在25 ℃處理下，添加ZZM2、JM11葉片提取液的PDA培養(yǎng)基上Vd080的菌落直徑分別為5.58、6.16 cm，比對(duì)照（4.93 cm）顯著增加13%、25%；在28 ℃處理下，添加ZZM2、JM11葉片提取液的PDA培養(yǎng)基上Vd080的菌落直徑分別為3.45、4.22 cm，比對(duì)照（3.08 cm）增加12%、37%（圖1-B）。

2.1.2 對(duì)大麗輪枝菌產(chǎn)孢量的影響 大麗輪枝菌在22—28 ℃范圍內(nèi)均能產(chǎn)孢，28 ℃最適宜產(chǎn)孢，32 ℃處理下抑制產(chǎn)孢。與對(duì)照相比，添加棉花葉片提取液的Czapek培養(yǎng)基有利于Vd080產(chǎn)孢，孢子濃度較大。在28 ℃處理下，添加ZZM2、JM11葉片提取液的Czapek培養(yǎng)基中Vd080的孢子濃度分別為11.31×106、18.02×106cfu/mL，比對(duì)照（2.75×106cfu/mL）顯著增加311%、555%（圖2）。

2.2 恒定溫度對(duì)棉花黃萎病發(fā)生的影響

棉花黃萎病的發(fā)生與溫度關(guān)系明顯，當(dāng)溫度為25—28 ℃時(shí)，抗病品種ZZM2、感病品種JM11植株出現(xiàn)葉片萎蔫黃化、落葉等發(fā)病癥狀，黃萎病均發(fā)生較重，低溫22 ℃或高溫32 ℃均不利于棉花黃萎病發(fā)生（圖3-A）。25 ℃處理下，接菌后7 d，ZZM2無(wú)明顯發(fā)病癥狀，病情指數(shù)為0，JM11病情指數(shù)為7.69；接菌后28 d，ZZM2的病情指數(shù)為23.72，JM11的病情指數(shù)為61.22，抗、感品種間黃萎病發(fā)生極顯著差異。接菌后21 d，22、32 ℃處理下，ZZM2的病情指數(shù)分別為3.51、2.88，顯著低于25、28 ℃處理下的病情指數(shù)。接菌后28 d，28 ℃處理下，JM11的病情指數(shù)為51.06，分別是22、32 ℃處理下病情指數(shù)的1.84、1.58倍（圖3-B）。綜上，感病品種JM11比抗病品種ZZM2更早出現(xiàn)發(fā)病癥狀，與低溫22 ℃或高溫32 ℃相比，ZZM2、JM11在25—28 ℃更易發(fā)生黃萎病。

A：不同PDA培養(yǎng)基上Vd080的菌落形態(tài)Colony morphology of Vd080 on different PDA media；B：不同PDA培養(yǎng)基上Vd080的菌落直徑Colony diameter of Vd080 on different PDA media。不同小寫(xiě)字母表示不同溫度間差異顯著（P＜0.05）。下同Different lowercase letters indicate significant differences among different temperatures (P＜0.05). The same as below

圖2 溫度對(duì)大麗輪枝菌產(chǎn)孢量的影響

2.3 恒定溫度對(duì)大麗輪枝菌定殖的影響

溫度對(duì)大麗輪枝菌在棉花根部定殖的研究結(jié)果表明，在不同溫度下，ZZM2、JM11中大麗輪枝菌定殖量隨時(shí)間推移均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與病情指數(shù)的變化趨勢(shì)相同。在22—32 ℃范圍內(nèi)，感病品種JM11中Vd080定殖量均高于抗病品種ZZM2中Vd080定殖量（圖4）。將大麗輪枝菌侵染棉花的過(guò)程大致分為3個(gè)階段，侵染前期（1—4 dpi），在25 ℃處理下，JM11中Vd080定殖量最高，22、28、32 ℃處理下Vd080定殖量無(wú)顯著差異。侵染中期（7—10 dpi），在25、28 ℃處理下，JM11中Vd080定殖量無(wú)顯著差異，兩者顯著高于22 ℃處理下Vd080定殖量。侵染后期（13—19 dpi），在25 ℃處理下，JM11中Vd080定殖量顯著高于22、28、32 ℃處理下Vd080定殖量。ZZM2中大麗輪枝菌的侵染發(fā)生較晚，在25—28 ℃處理下，ZZM2中Vd080定殖量也高于其他溫度處理。綜上，隨著溫度升高，大麗輪枝菌定殖量呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，在25 ℃時(shí)定殖量達(dá)到最大。

2.4 溫度對(duì)棉花防御反應(yīng)的影響

2.4.1 對(duì)棉花防御相關(guān)基因表達(dá)的影響 在接菌后1 d，22 ℃處理下，JM11中、表達(dá)量分別是25 ℃處理下的3.43、1.28倍；在接菌后4 d，32 ℃處理下，ZZM2中、表達(dá)量分別是25 ℃處理下的2.03、1.92倍；在接菌后7 d，25—28 ℃處理下，JM11、ZZM2中表達(dá)量顯著差異。綜上，在不同溫度處理下，ZZM2、JM11葉片中防御相關(guān)基因表達(dá)量存在差異，兩品種的基因表達(dá)規(guī)律基本一致，葉片中、、在25—28 ℃處理下表達(dá)量降低，低于22或32 ℃處理（圖5）。

2.4.2 對(duì)棉花葉片中活性氧（ROS）爆發(fā)的影響 在22—32 ℃范圍內(nèi)，接種大麗輪枝菌后，JM11、ZZM2葉片中出現(xiàn)ROS爆發(fā)，誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)，但抗病品種ZZM2葉片中棕褐色沉積較多，ROS爆發(fā)更強(qiáng)烈。與22—28 ℃相比，無(wú)論是否接種病原菌，JM11、ZZM2在32 ℃處理下棕褐色沉積顏色更深，沉積點(diǎn)更多，產(chǎn)生的ROS爆發(fā)更強(qiáng)烈（圖6）。

不同小寫(xiě)字母表示棉花中Vd080定殖量在同一時(shí)間的不同處理間差異顯著（P＜0.05）Different lowercase letters indicate significant differences in the colonization of Vd080 in cotton at the same time of different treatments (P＜0.05)

圖5 溫度對(duì)棉花防御相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4.3 對(duì)棉花葉片中過(guò)氧化氫含量的影響 在22—32 ℃范圍內(nèi)，與對(duì)照CK相比，接種大麗輪枝菌后，JM11、ZZM2葉片中H2O2含量均提高，但抗病品種ZZM2葉片中H2O2含量高于感病品種JM11。接種大麗輪枝菌后，在32 ℃處理下，JM11、ZZM2葉片中H2O2含量分別為7.67、8.67 μmol·g-1，顯著高于25—28 ℃處理；而在25 ℃處理下，JM11、ZZM2葉片中H2O2含量最低（圖7）。表明接種大麗輪枝菌后誘導(dǎo)棉花葉片中H2O2含量升高，32 ℃處理下棉花葉片中H2O2含量最高。

2.4.4 對(duì)棉花葉片中胼胝質(zhì)積累的影響 在22—32 ℃范圍內(nèi)，與對(duì)照CK相比，接種大麗輪枝菌后，JM11、ZZM2葉片胼胝質(zhì)積累均提高，但抗病品種ZZM2葉片胼胝質(zhì)積累量高于感病品種JM11。接種大麗輪枝菌后，在32 ℃處理下，JM11、ZZM2葉片胼胝質(zhì)積累量較高，分別為575、817個(gè)/mm2，是對(duì)照CK的1.80、2.04倍；而在25 ℃處理下，JM11、ZZM2葉片胼胝質(zhì)積累量最低，分別為325、400個(gè)/mm2，是對(duì)照CK的1.70、1.60倍（圖8）。表明接種大麗輪枝菌后誘導(dǎo)棉花葉片中胼胝質(zhì)積累，在22或32 ℃處理下，棉花葉片中胼胝質(zhì)積累量較高。

A：接種大麗輪枝菌后，不同溫度處理下冀棉11葉片中活性氧爆發(fā)ROS outbreak in leaves of JM11 under different temperature treatments after inoculation with V. dahliae；B：接種大麗輪枝菌后，不同溫度處理下中植棉2號(hào)葉片中活性氧爆發(fā)ROS outbreak in leaves of ZZM2 under different temperature treatments after inoculation with V. dahliae

圖7 溫度對(duì)棉花葉片中過(guò)氧化氫含量的影響

2.5 自然變溫對(duì)棉花黃萎病發(fā)生的影響

根據(jù)2022年7、8月氣溫?cái)?shù)據(jù)，將氣溫變化分為5個(gè)時(shí)期：7月上旬溫度變化幅度大，溫度最高為30.45 ℃，最低為22.71 ℃；7月中旬及下旬日均溫度在25 ℃波動(dòng)，穩(wěn)定在22—29 ℃范圍內(nèi)，最高溫度不超過(guò)35℃，最低溫度不低于19 ℃；8月上旬處于相對(duì)高溫期，日均溫度在30 ℃波動(dòng)，最高可達(dá)37.01 ℃，最低溫度不低于24 ℃；8月中旬日均溫度在28 ℃波動(dòng)，穩(wěn)定在24—30 ℃范圍內(nèi)；8月下旬，溫度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在20 ℃波動(dòng)。田間自然變溫條件下棉花黃萎病的發(fā)生情況如圖9所示，感病品種JM11出現(xiàn)黃萎病癥狀較早。結(jié)合田間氣溫變化，在7月中旬及下旬日均溫度在25 ℃波動(dòng)期，JM11黃萎病快速發(fā)生，在7月25日，病情指數(shù)為40.63，隨后呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)；8月上旬進(jìn)入日均溫度30 ℃的相對(duì)高溫期后，JM11病情指數(shù)的增長(zhǎng)幅度有所降低，于8月16日病情指數(shù)達(dá)到最大值62.39；隨后8月下旬的相對(duì)低溫期，病情指數(shù)開(kāi)始下降。與JM11相比，抗病品種ZZM2出現(xiàn)黃萎病癥狀較晚且輕，病情指數(shù)波動(dòng)幅度較小，最大值為6.50（8月11日），顯著低于JM11，但與JM11病情指數(shù)呈現(xiàn)的規(guī)律一致，當(dāng)日均溫度在25 ℃時(shí)，病情指數(shù)上升，遇到日均溫度30 ℃左右的高溫時(shí)，病情指數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。表明日平均溫度25 ℃左右有利于田間黃萎病的發(fā)生，而日均溫度在30 ℃左右的高溫和低于22 ℃的低溫則不利于田間黃萎病的發(fā)生。

圖8 溫度對(duì)棉花葉片中胼胝質(zhì)積累的影響

圖9 自然變溫對(duì)棉花黃萎病發(fā)生的影響

2.6 自然變溫對(duì)大麗輪枝菌定殖的影響

為進(jìn)一步解析田間自然變溫對(duì)大麗輪枝菌定殖的影響，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)棉花倒四葉中大麗輪枝菌定殖量。結(jié)果表明（圖10），7月15日以后，JM11中大麗輪枝菌定殖量顯著高于ZZM2。結(jié)合田間氣溫變化，在7月中旬及下旬日均溫度25 ℃左右的穩(wěn)定期，JM11葉片中大麗輪枝菌定殖量急劇增加，于7月22日達(dá)到峰值0.65；隨后定殖量急劇減少，于7月29日降至0.10；8月上旬日均溫度30 ℃左右的高溫期時(shí)，JM11葉片中定殖量開(kāi)始減少，于8月5日低至0.09；此后溫度降至日均溫度28 ℃左右時(shí)，定殖量開(kāi)始呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；隨后進(jìn)入低于22 ℃的低溫期，JM11中大麗輪枝菌定殖量卻仍然在增加，并達(dá)到最高值0.92（8月30日）。與JM11相比，ZZM2葉片中大麗輪枝菌定殖量呈現(xiàn)的規(guī)律一致，7月22日達(dá)到峰值0.09。此外，除個(gè)別時(shí)間段外，棉花中大麗輪枝菌定殖量與田間黃萎病病情指數(shù)的增長(zhǎng)呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，表明25 ℃左右有利于田間棉花中大麗輪枝菌定殖。

3 討論

3.1 溫度影響病原菌生長(zhǎng)

溫度與病原真菌的生長(zhǎng)繁殖密切相關(guān)，溫度不僅影響菌絲的生長(zhǎng)，還會(huì)影響病原菌的產(chǎn)孢量以及孢子形狀、大小等，最終影響病原菌的萌發(fā)、侵染和傳播[27-28]。此外，不同病原菌甚至同一種病原菌不同小種侵染寄主所需要的適宜溫度仍有所不同[29]。本研究結(jié)果表明大麗輪枝菌Vd080生長(zhǎng)易受到溫度影響，25 ℃為最適菌絲生長(zhǎng)溫度，在22—28 ℃范圍內(nèi)正常產(chǎn)孢。這與前人研究結(jié)果基本一致[12,30]。同時(shí)，本研究通過(guò)棉花葉片提取液模擬棉花的生理環(huán)境，測(cè)定棉花葉片提取液對(duì)大麗輪枝菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明抗病品種ZZM2、感病品種JM11均對(duì)大麗輪枝菌的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，并且在25—28 ℃范圍內(nèi)促進(jìn)作用更強(qiáng)。然而，袁虹霞等[31]研究表明感病品種的根部分泌物對(duì)大麗輪枝菌的菌絲生長(zhǎng)與孢子萌發(fā)具有促進(jìn)作用，而抗病品種則具有相反的抑制作用。研究結(jié)果的差異可能是由于棉花的根部分泌物與葉片提取液中具有不同的物質(zhì)導(dǎo)致，也可能是棉花組織液的濃度差異引起。

圖10 自然變溫對(duì)棉花葉片中大麗輪枝菌定殖的影響

3.2 溫度影響植物病害發(fā)生

溫度是病原菌生長(zhǎng)、致病等過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)境因子，關(guān)于溫度過(guò)高或過(guò)低對(duì)病原菌生長(zhǎng)和侵染有抑制作用的研究報(bào)道較多。溫度在12—25 ℃之間波動(dòng)有利于大豆銹病的發(fā)生，但將受感染的植株暴露在37 ℃下1 h后出現(xiàn)隱癥[32]；在開(kāi)花前約15 d，每日高溫與小麥赤霉病流行表現(xiàn)出很強(qiáng)的正相關(guān)性，但在開(kāi)花后10 d，這種相關(guān)性會(huì)變成負(fù)相關(guān)[33]；Fan等[29]研究表明對(duì)于稻曲病菌（），15 ℃的夜間溫度可誘導(dǎo)黑粉球和菌核的形成；而對(duì)于稻瘟病菌，溫度變化會(huì)顯著影響附著體的形成速度[34]。對(duì)于許多真菌病原體來(lái)說(shuō)，適宜溫度和高濕度的結(jié)合為病害的發(fā)生提供了最佳條件[35]；當(dāng)田間環(huán)境滿足低溫、多雨和高濕度3個(gè)條件會(huì)導(dǎo)致棉花黃萎病嚴(yán)重發(fā)生[10-12]。本研究采用室內(nèi)實(shí)驗(yàn)與病圃實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，系統(tǒng)解析恒定溫度和自然變溫對(duì)棉花黃萎病發(fā)生的影響，結(jié)果表明棉花黃萎病的發(fā)生與溫度有很大關(guān)系，當(dāng)溫度為25—28 ℃時(shí)，無(wú)論抗病品種ZZM2、感病品種JM11黃萎病均發(fā)生較重，低溫22 ℃或高溫32 ℃均不利于棉花發(fā)病。有報(bào)道棉花中黃萎病菌生物量與棉花的抗性呈負(fù)相關(guān)[36-37]。本研究發(fā)現(xiàn)不同溫度處理下棉花根部組織中大麗輪枝菌Vd080定殖量在抗、感品種中存在顯著差異，在25 ℃處理下，棉花中大麗輪枝菌侵染定殖能力強(qiáng)，感病品種JM11比抗病品種ZZM2更易受大麗輪枝菌侵染，與棉花黃萎病病情指數(shù)的結(jié)果基本一致。

3.3 溫度影響寄主防御反應(yīng)

溫度變化除了影響病原體的致病性外，還影響植物的防御系統(tǒng)，包括R基因介導(dǎo)的抗性和寄主基礎(chǔ)抗性[17]。當(dāng)棉花受到大麗輪枝菌侵染時(shí)，會(huì)發(fā)生一系列的物理和化學(xué)變化，產(chǎn)生組織結(jié)構(gòu)抗性和生理生化抗性，如細(xì)胞壁加厚、胼胝質(zhì)和木質(zhì)素積累、ROS爆發(fā)、防御相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)等，很大程度上阻止了病菌的侵染和棉株內(nèi)擴(kuò)散[1,4]。然而，溫度調(diào)節(jié)寄主基礎(chǔ)抗性的分子機(jī)制以及溫度波動(dòng)對(duì)棉花基礎(chǔ)抗性的影響尚不清楚。張夢(mèng)婕等[38]研究發(fā)現(xiàn)胼胝質(zhì)積累數(shù)量與植株抗蟲(chóng)性呈正相關(guān)，在抗蟲(chóng)品種中積累更多；在受到高溫或低溫處理時(shí)，ROS會(huì)大量增加，造成氧化脅迫[39]；馬曉寒等[40]研究得出在低溫處理下煙草幼苗體內(nèi)的H2O2、O2-等物質(zhì)含量顯著升高，高溫處理下也會(huì)引起ROS爆發(fā)。本研究結(jié)果表明不論是否有大麗輪枝菌侵染，棉花在22或32 ℃處理下ROS爆發(fā)均比25、28 ℃處理下ROS爆發(fā)更強(qiáng)烈，推測(cè)棉花植株除了受大麗輪枝菌侵染影響外，還存在22 ℃的低溫逆境與32 ℃的高溫逆境造成的影響，雙重脅迫導(dǎo)致22、32 ℃下棉花植株的防御反應(yīng)更加強(qiáng)烈。同時(shí)，在25 ℃處理下植株的防御相關(guān)基因、和相對(duì)表達(dá)量最小。綜上，溫度誘導(dǎo)植物基礎(chǔ)抗性的下降是大麗輪枝菌能夠侵染棉花的重要原因之一。然而，目前對(duì)這種環(huán)境免疫關(guān)系的理解仍處于早期階段，需要不斷揭示溫度調(diào)節(jié)棉花抵抗黃萎病的潛在機(jī)制，以便為制定黃萎病防控策略和培育抗病品種以適應(yīng)全球溫度變化提供參考。

4 結(jié)論

溫度對(duì)大麗輪枝菌生長(zhǎng)、寄主防御反應(yīng)具有雙重作用，進(jìn)而影響棉花黃萎病發(fā)生。25 ℃是大麗輪枝菌菌絲生長(zhǎng)最適溫度，22—28 ℃范圍內(nèi)適宜產(chǎn)孢，感病品種JM11葉片提取液對(duì)大麗輪枝菌的生長(zhǎng)促進(jìn)作用更強(qiáng)。與低溫22 ℃或高溫32 ℃相比，25、28 ℃處理下接種大麗輪枝菌后，棉花葉片ROS爆發(fā)、H2O2含量、胼胝質(zhì)積累、防御相關(guān)基因的表達(dá)等寄主防御反應(yīng)顯著降低。同時(shí)，無(wú)論恒定溫度、自然變溫，25—28 ℃均有利于大麗輪枝菌在棉花中侵染定殖，導(dǎo)致棉花黃萎病嚴(yán)重發(fā)生。綜上，溫度誘導(dǎo)植物基礎(chǔ)抗性的下降是大麗輪枝菌能夠侵染棉花的重要原因之一。

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Effect of Temperature on the Occurrence of Cotton Verticillium Wilt and Host Defense Response

ZHANG YaLin1,2, JIANG Yan2, ZHAO LiHong2, FENG ZiLi2, FENG HongJie2, WEI Feng2, ZHOU JingLong2, ZHU HeQin2, MA ZhiYing1

1College of Agronomy, Hebei Agricultural University/State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation/Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Hebei, Baoding 071000, Hebei;2Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Laboratory of Cotton Bio-breeding and Integrated Utilization, Anyang 455000, Henan

【Objective】The objectiveofthis study is to analyze the effect of different temperatures on the occurrence of cotton Verticillium wilt and the mechanism of regulating host defense response, reveal the dual effects of temperature on pathogen and host, and to provide a theoretical basis for the green control and temperature regulation of this disease.【Method】Cotton Verticillium wilt resistant variety Zhongzhimian 2 (ZZM2) and susceptible variety Jimian 11 (JM11) were employed as experimental materials, indoor experiments and disease nursery experiments were jointly used to set constant temperatures (22, 25, 28, and 32 ℃) and natural temperature variation to determine the effect of temperature on the growth, infection and colonization of, and the occurrence of cotton Verticillium wilt. The mechanism of temperature regulation of cotton host defense response was analyzed by utilizing indicators such as reactive oxygen species (ROS) outbreak, H2O2content, callose accumulation, and the expression of defense-related genes.【Result】On the culture media, 25 ℃ was the optimal temperature for the mycelial growth of, and the range of 22-28 ℃ was suitable for spore yield. Compared with the culture media, the leaf extracts of resistant variety ZZM2 and susceptible variety JM11 had a promoting effect on the growth of, and JM11 promoted stronger. when the temperatures were between 25 and 28 ℃, both ZZM2 and JM11 suffered from severe Verticillium wilt, and low temperature 22 ℃and high temperature 32 ℃ were not conducive to the occurrence of Verticillium wilt. Meanwhile, under 25 ℃treatment, the colonization ability ofin cotton was strong, JM11 was more susceptible toinfection than ZZM2, which was basically consistent with the results of the cotton Verticillium wilt disease index. furthermore, temperature significantly affected the host defense response of cotton: compared with 22-28 ℃, whether inoculated withor not, the ROS outbreak produced by ZZM2 and JM11 under 32 ℃ treatment was stronger; under 25 ℃ treatment, the H2O2content in ZZM2 and JM11 leaves was the lowest; under 32 ℃ treatment, the accumulation of callose in ZZM2 and JM11 leaves was higher, which was 2.04 and 1.80 times higher than that of the untreated control, respectively; the expression level of,, anddefense-related genes in cotton leaves decreased under treatments at 25-28 ℃, which was lower than that under treatments at 22 and 32 ℃.【Conclusion】Temperature has a dual effect on the growth ofand host defense response, which in turn affects the occurrence of cotton Verticillium wilt. Regardless of constant temperature or natural temperature variation, 25-28 ℃ are beneficial for the colonization ofin cotton, significantly reduce the host defense response, and lead to severe cotton Verticillium wilt.

temperature; cotton Verticillium wilt;; defense response; infection

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.23.009

2023-08-02；

2023-09-03

國(guó)家自然科學(xué)基金（32201752）、第七師胡楊河市財(cái)政科技計(jì)劃項(xiàng)目（2023C07）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-ICR）

張亞林，E-mail：zhangyalin@caas.cn。通信作者朱荷琴，E-mail：heqinanyang@163.com。通信作者馬峙英，E-mail：mzhy@hebau.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）