黨媛玥，馬建江，楊書賢，宋吉坤，賈冰，馮盼，陳全家，于霽雯

棉花β-tubulin基因家族的鑒定及其在纖維發(fā)育中的表達

黨媛玥1,2，馬建江2，楊書賢2，宋吉坤1,2，賈冰1,2，馮盼2，陳全家1，于霽雯1,2

1新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/棉花教育部工程研究中心，烏魯木齊 830052；2中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物育種及產(chǎn)業(yè)技術(shù)國家工程研究中心，河南安陽 455000

【目的】β-微管蛋白是棉纖維細胞形態(tài)建成的基本結(jié)構(gòu)單位，在纖維發(fā)育過程中具有重要作用。通過鑒定棉花β-tubulin基因家族成員，并進行生物信息學和表達模式分析，為深入探究β-tubulin基因在棉花纖維發(fā)育中的作用提供理論依據(jù)。【方法】利用BLAST方法，在4個棉種基因組中鑒定β-tubulin基因家族成員，并結(jié)合ProtParam tool分析理化性質(zhì)、MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹、Mapchart2.2繪制染色體定位圖、MEME分析保守基序、PlantCARE分析啟動子順式作用元件；根據(jù)39個材料發(fā)育纖維轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析陸地棉β-tubulin基因家族的表達水平，并利用Spearman相關(guān)性分析鑒定影響纖維品質(zhì)性狀形成的β-tubulin基因?！窘Y(jié)果】在陸地棉（，AD1）、海島棉（，AD2）、亞洲棉（，A2）和雷蒙德氏棉（，D5）基因組中分別鑒定到36、37、19和18個β-tubulin基因，且在四倍體棉種中的數(shù)目約是二倍體棉種數(shù)目的二倍，系統(tǒng)進化將其分為ClusterⅠ—ClusterⅤ共5個亞組。系統(tǒng)進化與共線性分析發(fā)現(xiàn)，與陸地棉β-tubulin基因家族相比，海島棉與二倍體亞洲棉和雷蒙德氏棉親緣關(guān)系更近。保守結(jié)構(gòu)域均具有典型的Tubulin和Tubulin-C。理化性質(zhì)分析表明，該家族基因編碼的氨基酸數(shù)目為421—508，等電點為4.68—5.09。啟動子順式作用元件分析獲得生長發(fā)育響應(yīng)相關(guān)元件、激素響應(yīng)相關(guān)元件和脅迫響應(yīng)相關(guān)元件等，表明β-tubulin基因參與細胞的生長調(diào)節(jié)。利用TM-1轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對36個陸地棉β-tubulin基因表達模式進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)有42%基因在纖維中優(yōu)勢表達；此外，利用海陸群體動態(tài)纖維轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選到1、6和11個β-tubulin基因分別與纖維馬克隆值、比強度和纖維長度顯著相關(guān)，其中4個基因同時影響纖維長度和比強度性狀?！窘Y(jié)論】4個棉種中共鑒定出110個β-tubulin基因家族成員，氨基酸理化性質(zhì)和序列高度保守而啟動子序列調(diào)控元件多樣；篩選出陸地棉纖維優(yōu)勢表達的β-tubulin基因家族成員，并發(fā)掘潛在調(diào)控纖維發(fā)育的候選基因。

棉花；β-tubulin基因家族；生物信息學；表達分析；纖維發(fā)育

0 引言

【研究意義】棉花是全球最重要的天然纖維作物和主要的經(jīng)濟作物。隨著人們生活水平的提高，對綠色健康的高品質(zhì)紡織品的需求日益增加[1]。然而，近年來，中國棉花總產(chǎn)量隨著植棉面積的減少呈現(xiàn)逐年下降趨勢，其中，優(yōu)質(zhì)棉花品種的缺乏（纖維長度≥30 mm、纖維強度≥30 cN·tex-1）制約中國高品質(zhì)棉紡產(chǎn)品的生產(chǎn)，為此，中國每年有高達200萬t的優(yōu)質(zhì)棉依賴進口[2]。因此，改良棉纖維品質(zhì)成為現(xiàn)階段棉花育種的主要目標。【前人研究進展】微管是細胞骨架的主要成分，主要由微管蛋白構(gòu)成[3]。在棉纖維細胞發(fā)育過程中微管隨著纖維細胞的發(fā)育呈現(xiàn)不同的排列方式，因此，纖維細胞發(fā)育與微管密切相關(guān)[4]。微管作為細胞骨架的核心成分，在細胞遷移、有絲分裂、機械應(yīng)激、細胞極性、細胞內(nèi)運輸、細胞分裂和細胞形態(tài)發(fā)生中起著關(guān)鍵作用[5-7]。組成微管的各類蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為微管蛋白，現(xiàn)階段研究證實，在真核生物中至少存在α、β、γ、δ、ε、ζ和η-微管蛋白[8]，而在微管形成中起主要作用的是α微管蛋白（α-tubulin，TubA）和β-微管蛋白（β-tubulin，TubB）2種[9-10]。微管蛋白具有高度保守性，含有Tubulin與Tubulin-C 2個保守結(jié)構(gòu)域[11]，多數(shù)α-微管蛋白和β-微管蛋白的氨基酸序列同源性可達88%，這種高度保守的情況在植物微管蛋白中同樣存在[12]。盡管微管蛋白家族在序列上高度保守，但不同微管蛋白成員在功能上可能存在較大差異。隨著對擬南芥等模式植物微管蛋白研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)植物基因組中常常有多個微管蛋白基因，而基因間的表達模式也因受不同生長信號調(diào)控存在一定差異，部分基因在特定組織和器官中特異表達或優(yōu)勢表達對特定組織的生長和發(fā)育具有重要作用[13-14]。當前，β-tubulin基因家族成員在哺乳動物、昆蟲和微生物中研究較為廣泛。在擬南芥（L）[15]、亞麻（L.）[16]、柳樹（L.）[17]、慈竹（L.）[18]和龍眼（L.）[19]等植物部分基因家族成員中也得到了鑒定與分析。研究表明，β-tubulin基因家族成員在一些特定的植物組織中高表達以調(diào)控植物的生長發(fā)育。如，Li等[20]研究證明在棉鈴發(fā)育早期優(yōu)先在纖維中高表達，在胚珠中低表達，在棉花其他組織中表達量極低，說明可能在纖維發(fā)育時期特異性表達；Qin等[21]探索長纖維和短纖維棉材料之間的基因表達差異時發(fā)現(xiàn)，53個差異表達基因（DEGs）中有12個纖維發(fā)育的良好候選基因，包括2個β-tubulin基因，其中，在纖維細胞發(fā)育起始時期表達豐度高，而在纖維細胞伸長時期高度表達；棉花是纖維特異性較強的纖維發(fā)育后期基因，其在擬南芥中超表達抑制了根的伸長，在棉花中超量表達抑制了纖維的伸長，而反義抑制則促進纖維伸長[22]；毛竹中的2個微管蛋白基因和經(jīng)體外表達具有生物活性并能夠促進細胞生長[23]；在亞麻中，通過對β-tubulin基因的表達分析，發(fā)現(xiàn)一些β-tubulin基因可使細胞伸長，且細胞伸長早于細胞壁沉積和增厚[16]?！颈狙芯壳腥朦c】棉纖維作為重要的經(jīng)濟產(chǎn)物，在人們?nèi)粘Ｉ钪邪l(fā)揮著重要作用。β-微管蛋白是棉纖維細胞骨架形成的重要元件，而β-tubulin基因在4個棉種中的全基因組鑒定及在纖維中的表達分析還未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對棉花β-tubulin基因家族系統(tǒng)分析及棉纖維發(fā)育中β-tubulin基因的表達水平與表型性狀相關(guān)性分析，發(fā)掘參與棉纖維發(fā)育的重要β-tubulin基因，為進一步研究棉花β-tubulin基因在棉纖維發(fā)育中的重要作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 β-tubulin基因家族成員的鑒定及系統(tǒng)進化分析

從Cottongen（https://www.cottongen.org/）網(wǎng)站下載亞洲棉（CRI_V1.0）[24]、雷蒙德氏棉（JGI_v2.1）[25]、陸地棉TM-1（ZJU_v2.1）和海島棉H7124（ZJU_v1.1）[26]的基因組數(shù)據(jù)庫。從TAIR網(wǎng)站（http://www.arabidopsis. org）下載擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫。以擬南芥的β-tubulin的氨基酸序列為參考系列，4個棉種的氨基酸序列為庫，利用本地blast（E-value為1e-5）比對得到4個棉種β-tubulin的待選基因。再利用Batch-CDD程序（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）檢索基因中是否存在β-tubulin蛋白保守結(jié)構(gòu)域，利用在線SMART網(wǎng)站庫[27]（http://smart.embl- heidelberg.de/）對結(jié)構(gòu)域進一步確定。用Clustal X2.0[28]對設(shè)定閾值以內(nèi)的β-tubulin基因氨基酸序列進行多重序列比對，依據(jù)鄰近法（NG），利用MEGA7.0[29]構(gòu)建進化樹，再利用網(wǎng)站EvolView（https://evolgenius. info//evolview-v2）對結(jié)果進行可視化。

1.2 β-tubulin基因家族成員的理化性質(zhì)分析

利用在線軟件ProtParam tool[30]（https://web. expasy.org/）預測每個β-tubulin候選基因的蛋白長度、分子量和等電點。利用在線網(wǎng)站W(wǎng)oLF PSORT（https:// wolfpsort.hgc.jp/）預測亞細胞定位。

1.3 染色體定位及共線性分析

根據(jù)染色體注釋文件GFF3調(diào)取基因的物理位置和染色體信息，利用Mapchart2.2[31]軟件繪制染色體定位圖。共線性分析首先利用TBtools[32]對β-tubulin基因家族的氨基酸序列進行比對；比對上的區(qū)域占較長氨基酸序列80%以上，對比區(qū)域的相似度大于80%。4種棉花的片段重復基因?qū)τ糜贑ircos作圖[33]。

1.4 基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析

根據(jù)下載的CDS序列與DNA全長序列，使用TBtools軟件繪制外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖。利用在線軟件MEME[34]（http://meme-suite.org/）分析每個蛋白序列的motif。

1.5 順式作用元件分析

根據(jù)下載的基因組數(shù)據(jù)，利用TBtools提取基因上游的2 000 bp序列進行順式作用元件分析。將提取的序列提交至在線網(wǎng)站PlantCARE[35]（http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行啟動子順式作用元件分析。并利用TBtools將其可視化處理。

1.6 表達模式分析

從浙江大學棉花數(shù)據(jù)庫（http://cotton.zju.edu. cn/index.htm）下載陸地棉不同發(fā)育時期胚珠、纖維和不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[26]，對數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2（FPKM+ 1）標準化處理，并使用TBtools對其進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 棉花β-tubulin基因家族成員的鑒定及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

以擬南芥β-tubulin基因家族的氨基酸序列為參考，運用本地blast，以下載的4個棉種基因組數(shù)據(jù)為庫進行BlastP搜索。將得到的候選序列提交至NCBI Batch-CDD數(shù)據(jù)庫，進一步分析確認候選基因的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域。最終在4個棉種中共鑒定得到110個β-tubulin基因，即，陸地棉36個、海島棉37個、亞洲棉19個、雷蒙德氏棉18個。

通過對4個棉種（陸地棉、海島棉、亞洲棉和雷蒙德氏棉）及擬南芥的β-tubulin基因家族氨基酸序列進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結(jié)果表明，β-tubulin基因家族被分為5個亞組，其中ClusterⅠ成員最多，包含64個（53%）家族成員。

2.2 棉花β-tubulin基因家族成員的理化性質(zhì)分析

將鑒定得到的β-tubulin基因進行理化性質(zhì)分析（表1），蛋白序列長度最大值為508 aa（），且與其余成員長度相差較大，最小值為421 aa（），分子量在47.37（）—57.42 kDa（），理論等電點為4.68— 5.09。亞細胞定位預測顯示，19個β-tubulin基因定位于細胞質(zhì)，其中，陸地棉7個（、、、、、和）、海島棉6個（、、、、和）、亞洲棉3個（、和）、雷蒙德氏棉3個（、和）；3個β-tubulin基因定位于葉綠體，其中，陸地棉1個（）、海島棉2個（和）；2個β-tubulin基因定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其中，陸地棉1個（）、海島棉1個（）。其余β-tubulin基因均定位于細胞核。

續(xù)表1 Continued table 1

2.3 棉花β-tubulin基因家族染色體定位及共線性分析

將β-tubulin基因家族進行染色體定位分析。發(fā)現(xiàn)亞洲棉19個分布在Chr.01、Chr.03、Chr.05、Chr.06、Chr.07、Chr.08、Chr.09、Chr.11和Chr.13染色體上，其中，在Chr.01染色體上存在最多，5個（圖2-A）；雷蒙德氏棉18個家族成員分布在除Chr.08、Chr.11和Chr.12外的其余10條染色體上，其中，在Chr.03染色體上存在最多，4個（圖2-B）。另外，陸地棉37個和海島棉36個均定位到除A02、A04、A07、A10、A12、D04、D10和D12外的18個染色體上，在陸地棉和海島棉的A03染色體均含有最多，5個（圖2-C—D）。通過比較β-tubulin基因家族成員在陸地棉和海島棉染色體上的分布，發(fā)現(xiàn)除海島棉外，其余海島棉和陸地棉β-tubulin基因家族成員在染色體的物理位置分布大體相近，表明β-tubulin基因家族在不同棉種之間的進化有相似性。

為了闡明4個棉種β-tubulin基因的擴增機制和進化情況，分別對亞洲棉和陸地棉（A亞組）、亞洲棉和海島棉（A亞組），以及雷蒙德氏棉和陸地棉（D亞組）、雷蒙德氏棉和海島棉（D亞組）進行共線性分析，發(fā)現(xiàn)26、23、32、37對共線性基因（圖3）。陸地棉與亞洲棉和雷蒙德氏棉的共線性基因?qū)Ρ群u棉少，而系統(tǒng)發(fā)育分析中，亞洲棉和雷蒙德氏棉也大都與海島棉聚類，與陸地棉相比，海島棉可能與亞洲棉和雷蒙德氏棉之間的親緣關(guān)系較近。

2.4 β-tubulin基因家族的結(jié)構(gòu)分析

為探究β-tubulin基因家族成員間的功能異同，對其基因結(jié)構(gòu)和功能域進行分析，并將β-tubulin基因家族成員的motif、CDS及氨基酸序列進行了可視化分析（圖4-A），有67個β-tubulin基因含有3個外顯子，4個β-tubulin基因（、、和）含有2個外顯子，2個基因（和）含有4個外顯子。利用在線NCBIBatch CDD數(shù)據(jù)庫和SMART數(shù)據(jù)庫對β-tubulin蛋白進行蛋白結(jié)構(gòu)域的預測和矯正（圖4-B），所有β-tubulin蛋白都含有Tubulin與Tubulin-C 2個典型結(jié)構(gòu)域。此外，還通過在線MEME軟件預測β-tubulin基因家族成員的motif（圖4-C）。結(jié)果表明，除中缺少motif1外，其余基序在β-tubulin蛋白中均保守。

2.5 順式作用元件分析

利用PlantCARE對棉花的β-tubulin基因上游2 000 bp的序列進行順式作用元件分析（圖5），結(jié)果表明，β-tubulin基因家族成員啟動子順式作用元件主要分為3種：生長發(fā)育響應(yīng)相關(guān)元件（如GGTTAA、GATGACATGG、TCAAACGGT等）、激素響應(yīng)相關(guān)元件（如CGTCA、ACGTG、CCATCTTTTT等）和脅迫響應(yīng)相關(guān)元件（如AAATTTCCT、GTTTTCTTAC、CAACTG等）。其中，光響應(yīng)元件最多，達53%，此外，生長發(fā)育響應(yīng)元件還包括分生組織表達、胚乳表達、玉米蛋白代謝、類黃酮生物合成、晝夜節(jié)律調(diào)控、柵欄葉肉細胞及細胞周期調(diào)控等元件；激素響應(yīng)相關(guān)元件包括生長素、脫落酸、茉莉酸、赤霉素及水楊酸等；脅迫響應(yīng)相關(guān)元件有干旱誘導、低溫響應(yīng)、應(yīng)激響應(yīng)、創(chuàng)傷反應(yīng)及厭氧誘導等。在所有β-tubulin基因家族成員中，除的作用元件主要分布在起始密碼子上游1 000 bp外，其他家族成員順式作用元件多均勻分布在上游2 000 bp。

2.6 陸地棉β-tubulin基因家族成員表達模式分析

利用陸地棉TM-1根、莖、葉、花、胚珠和纖維的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對36個GhTUBs基因家族成員進行不同組織表達模式聚類分析（圖6）。結(jié)果表明，將分為5個簇，簇Ⅰ中的3個基因（、和）在不同組織不同時期均有表達；簇Ⅱ中的15個基因在各組織表達量均較高且在纖維發(fā)育時期優(yōu)勢表達；簇Ⅲ中的4個基因（、、和）在葉、花及胚珠發(fā)育的各個時期低表達，而在根、莖及纖維組織中的表達量相對較高；簇Ⅳ中的7個基因主要在根、莖、葉、花等組織中高表達，其中和僅在根、莖、葉、花等組織中特異性高表達，胚珠和纖維發(fā)育的各個時期表達量都較低；簇Ⅴ中的7個基因在不同組織不同時期表達量均較低，其中，同源基因和在以上組織中幾乎不表達。

A：β-tubulin基因的內(nèi)含子、外顯子示意圖；B：β-tubulin蛋白結(jié)構(gòu)域預測；C：β-tubulin基因的motif預測分析

利用已有的39個海陸群體長、短纖維材料5、10和15 DPA的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及成熟纖維的馬克隆值、強度、長度表型數(shù)據(jù)，分別對36個GhTUBs基因進行各個時期表達模式與纖維的馬克隆值、強度、長度之間的相關(guān)性分析，鑒定到13個基因的表達與3個纖維性狀的表型數(shù)據(jù)存在顯著相關(guān)（圖7）。其中，5 DPA纖維中的表達水平與馬克隆值顯著相關(guān)；5 DPA纖維中的表達水平與纖維強度顯著相關(guān)，10 DPA纖維中和的表達水平與纖維強度顯著相關(guān)，15 DPA纖維中、和的表達水平與纖維強度顯著相關(guān)；10 DPA纖維中、、、和的表達水平與纖維長度顯著相關(guān)，15 DPA纖維中和的表達水平與纖維長度顯著相關(guān)。

圖5 棉花β-tubulin基因啟動子順式作用元件

圖6 36個GhTUBs在陸地棉不同組織中的表達模式

3 討論

3.1 β-tubulin基因家族成員鑒定及分析

微管是植物細胞骨架的主要組成部分[3]，參與植物細胞的形態(tài)建成。β-微管基因家族鑒定相關(guān)研究已在多種植物中完成，如擬南芥中有9個β-tubulin[13]、亞麻中有14個[16]、水稻中有8個[36]、柳樹中有20個[37]。本研究利用生物信息學方法在二倍體和四倍體棉種中分別鑒定到18、19和36、37個β-tubulin基因家族成員。通過系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，4個棉種中的76（69.09%）個β-tubulin基因和擬南芥中的9個β-tubulin基因親緣關(guān)系較近，聚類到Cluster Ⅰ、Cluster Ⅱ和Cluster Ⅲ，說明大多數(shù)棉花β-tubulin基因在不同物種中具有較高的功能保守性。此外，棉花中有34個基因聚在了Cluster Ⅳ和Cluster Ⅴ與擬南芥相比親緣關(guān)系較遠，推測這類家族基因與棉花發(fā)育的多樣性相關(guān)。

3.2 候選基因表達模式與功能分析

棉花纖維品質(zhì)性狀改良是棉花育種工作的重點，本研究通過分析陸地棉的36個GhTUBs基因在根、莖、葉、花、胚珠和纖維的表達模式，可將其分為5個簇，其中簇Ⅱ的基因在纖維發(fā)育時期優(yōu)勢表達，占總數(shù)的42%，該結(jié)果暗示較多的β-tubulin基因家族成員潛在調(diào)控棉花纖維的生長發(fā)育。通過比對表達模式的5個簇與進化樹分析的5個簇基因之間的異同發(fā)現(xiàn)，兩者間存在較大程度重疊。進化樹Cluster Ⅱ和ClusterⅤ中的所有陸地棉β-tubulin基因分別聚類到表達模式中的簇Ⅱ和簇Ⅳ中，同時表達模式簇Ⅰ中67%的基因位于進化樹分析的ClusterⅠ中，表明親緣關(guān)系較近的在不同組織或發(fā)育時期往往具有相似的表達模式。此外，結(jié)合海陸群體纖維表型數(shù)據(jù)與基因表達水平，篩選到1、6和11個β-tubulin基因分別與馬克隆值、纖維比強度和纖維長度顯著相關(guān)，其中4個基因（、、和）同時與纖維長度和比強度性狀顯著相關(guān)。近年來，已有研究表明β-tubulin基因潛在調(diào)控棉纖維的生長、發(fā)育[4]。如Li等[20]通過篩選棉花基因組DNA文庫和組織化學分析，發(fā)現(xiàn)和在纖維發(fā)育早期高表達，在其他組織中表達量極低，說明該基因可能在纖維發(fā)育中起著重要作用。Qin等[21]通過分析長短纖維轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和基因功能注釋發(fā)現(xiàn)可能是纖維發(fā)育相關(guān)的β-tubulin基因，該基因在10 DPA時高表達，說明該基因在纖維伸長過程中起作用。曾志鋒[22]發(fā)現(xiàn)和在纖維發(fā)育次生壁合成期特異性高表達，將該基因過表達轉(zhuǎn)化擬南芥發(fā)現(xiàn)根長明顯受到抑制，過表達轉(zhuǎn)化棉花發(fā)現(xiàn)與野生型相比纖維長度明顯降低，而反義抑制則促進了纖維的伸長；而CHEN等[38]通過分析陸地棉微管蛋白基因并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，該基因可能在調(diào)控纖維長度的同時還調(diào)控纖維強度。以上研究篩選出的β-tubulin基因為揭示其在纖維發(fā)育中的功能提供了一定的基因資源。然而，有關(guān)β-tubulin基因家族成員在較多材料中的表達模式及其與品質(zhì)性狀之間的關(guān)系研究尚未被系統(tǒng)闡述，其制約了對β-tubulin基因家族成員的較為全面的篩選。以上結(jié)果進一步表明，β-tubulin基因家族成員可能調(diào)控纖維發(fā)育，并存在一因多效。

圖7 13個基因5、10、15 DPA纖維轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與馬克隆值、纖維強度、纖維長度相關(guān)性分析

4 結(jié)論

在4個棉種中共鑒定出110個β-tubulin基因家族成員，氨基酸理化性質(zhì)和序列高度保守而啟動子序列調(diào)控元件多樣；篩選出15個陸地棉纖維優(yōu)勢表達的β-tubulin基因家族成員，并發(fā)掘出潛在調(diào)控馬克隆值性狀的基因，及潛在同時調(diào)控纖維長度和比強度性狀的候選基因、、和。

[1] 肖水平, 宋國立, 余進祥. 棉花纖維品質(zhì)相關(guān)基因挖掘及功能基因研究進展. 棉花科學, 2020, 42(2): 3-14.

XIAO S P, SONG G L, YU J X. Research progress of cotton fiber quality related gene mining and functional genes. Cotton Sciences, 2020, 42(2): 3-14. (in Chinese)

[2] 楊君, 馬峙英, 王省芬. 棉花纖維品質(zhì)改良相關(guān)基因研究進展. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2016, 49(22): 4310-4322.

YANG J, MA Z Y, WANG X F. Progress in studies on genes related to fiber quality improvement of cotton. Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(22): 4310-4322. (in Chinese)

[3] Dixon D C, Seagull R W, Triplett B A. Changes in the accumulation of [alpha]- and [beta]-tubulin isotypes during cotton fiber development. Plant physiology, 1994, 105(4): 1347-1353.

[4] Kost B, Chua N H. The plant cytoskeleton: vacuoles and cell walls make the difference. Cell, 2002, 108(1): 9-12.

[5] He X C, Qin Y M, Xu Y, Hu C Y, Zhu Y X. Molecular cloning, expression profiling, and yeast complementation of 19 β-tubulin cDNAs from developing cotton ovules. Journal of Experimental Botany, 2008, 59(10): 2687-2695.

[6] Nieuwenhuis J, Brummelkamp T R. The tubulin detyrosination cycle: Function and enzymes. Trends in Cell Biology, 2019, 29(1): 80-92.

[7] Meiring J C M, Shneyer B I, Akhmanova A. Generation and regulation of microtubule network asymmetry to drive cell polarity. Current Opinion in Cell Biology, 2020, 62: 86-95.

[8] McKean P G, Vaughan S, Gull K. The extended tubulin superfamily. Journal of Cell Science, 2001, 114(15): 2723-2733.

[9] Seagull R W. Cytoskeletal stability affects cotton fiber initiation. International Journal of Plant Sciences, 1998, 159(4): 590-598.

[10] Oakley R V, Wang Y S, Ramakrishna W, Harding S A, Tsai C J. Differential expansion and expression of α- and β-tubulin gene families in. Plant Physiology, 2007, 145(3): 961-973.

[11] Mubeen H, Shoaib M W, Raza S. In silico analysis and comparison of alpha tubulin gene with other tubulin families. Journal of Advance in Biology & Biotecnology, 2016, 7(4): 1-7.

[12] LI Y L, SUN J, LI C H, ZHU Y Q, XIA G X. Specific expression of agene () in developing cotton fibers. Science in China Series C: Life Sciences, 2003, 46(3): 235-242.

[13] Snustad D P, Haas N A, Kopczak S D, Silflow C D. The small genome ofcontains at least nine expressed beta-tubulin genes. The Plant Cell, 1992, 4(5): 549-556.

[14] Cheng Z G, Carter J V. Temporal and spatial expression patterns of, a β-tubulin gene of. Plant Molecular Biology, 2001, 47(3): 389-398.

[15] 楊建霞.對擬南芥生長發(fā)育的影響和基因新功能分析[D]. 蘭州: 蘭州大學, 2015.

YANG J X. The effects ofongrowth and development and the analysis of the new role of[D]. Lanzhou: Lanzhou University, 2015. (in Chinese)

[16] Gavazzi F, Pigna G, Braglia L, Gianì S, Breviario D, Morello L. Evolutionary characterization and transcript profiling of β-tubulin genes in flax (L.) during plant development. BMC Plant Biology, 2017, 17(1): 237.

[17] 睢金凱, 饒國棟, 張建國. 柳樹β微管蛋白基因家族的克隆和序列分析. 西北植物學報, 2016, 36(5): 902-909.

SUI J K, RAO G D, ZHANG J G. Cloning and sequence analysis of β-tubulin gene families in willows. Acta Botanica Boreali- Occidentalia Sinica, 2016, 36(5): 902-909. (in Chinese)

[18] 黃勝雄, 胡尚連, 孫霞, 蔣瑤. 慈竹基因片段的克隆及序列分析. 福建林業(yè)科技, 2009, 36(1): 7-10, 42.

HUANG S X, HU S L, SUN X, JIANG Y. Cloning and sequence analysis ofgene fragments of. Fujian Forestry Science and Technology, 2009, 36(1): 7-10, 42. (in Chinese)

[19] 王亞婷, 林玉玲, 曾麗蘭, 賴鐘雄. 龍眼胚性愈傷組織微管蛋白基因-克隆及序列分析. 福建農(nóng)林大學學報(自然科學版), 2014, 43(1): 49-54.

WANG Y T, LIN Y L, ZENG L L, LAI Z X. Cloning and sequence analysis of-gene from embryogenic callus inLour. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition), 2014, 43(1): 49-54. (in Chinese)

[20] Li X B, Cai L, Cheng N H, Liu J W. Molecular characterization of the cottongene that is preferentially expressed in fiber. Plant Physiology, 2002, 130(2): 666-674.

[21] Qin Y, Sun H R, Hao P B, Wang H T, Wang C C, Ma L, Wei H L, Yu S X. Transcriptome analysis reveals differences in the mechanisms of fiber initiation and elongation between long- and short-fiber cotton (L.) lines. BMC Genomics, 2019, 20(1): 633.

[22] 曾志鋒.在棉纖維發(fā)育中的功能[D]. 重慶: 西南大學, 2016.

ZENG Z F. The function of

[23] 李彩麗. 毛竹細胞骨架微管蛋基因和研究[D]. 北京: 中國林業(yè)科學研究院, 2012.

LI C L. Study onandencoding micro tuhulin of cvtoskeleton in moso bamboo () [D]. Beijing: Chinese Academy of Forestry, 2012. (in Chinese)

[24] Du X M, Huang G, He S P, Yang Z E, Sun G F, Ma X F, Li N, Zhang X Y, Sun J L, Liu M, Jia Y H, Pan Z E, Gong W F, Liu Z H, Zhu H Q, Ma L, Liu F Y, Yang D G, Wang F, Fan W, Gong Q, Peng Z, Wang L R, Wang X Y, Xu S J, Shang H H, Lu C R, Zheng H K, Huang S W, Lin T, Zhu Y X, Li F G. Resequencing of 243 diploid cotton accessions based on an updated A genome identifies the genetic basis of key agronomic traits. Nature Genetics, 2018, 50(6): 796-802.

[25] Paterson A H, Wendel J F, Gundlach H, Guo H, Jenkins J, Jin D C, Llewellyn D, Showmaker K C, Shu S Q, Udall J, Yoo M J, Byers R, Chen W, Doron-Faigenboim A, Duke M V, Gong L, Grimwood J, Grover C, Grupp K, Hu G J, Lee T H, Li J P, Lin L F, Liu T, Marler B S, Page J T, Roberts A W, Romanel E, Sanders W S, Szadkowski E, Tan X, Tang H B, Xu C M, Wang J P, Wang Z N, Zhang D, Zhang L, Ashrafi H, Bedon F, Bowers J E, Brubaker C L, Chee P W, Das S, Gingle A R, Haigler C H, Harker D, Hoffmann L V, Hovav R, Jones D C, Lemke C, Mansoor S, ur Rahman M, Rainville L N, Rambani A, Reddy U K, Rong J K, Saranga Y, Scheffler B E, Scheffler J A, Stelly D M, Triplett B A, Van Deynze A, Vaslin M F S, Waghmare V N, Walford S A, Wright R J, Zaki E A, Zhang T Z, Dennis E S, Mayer K F X, Peterson D G, Rokhsar D S, Wang X Y, Schmutz J. Repeated polyploidization ofgenomes and the evolution of spinnable cotton fibres. Nature, 2012, 492(7429): 423-427.

[26] Hu Y, Chen J D, Fang L, Zhang Z Y, Ma W, Niu Y C, Ju L Z, Deng J Q, Zhao T, Lian J M, Baruch K B, Fang D, Liu X, Ruan Y L, Rahman M U, Han J L, Wang K, Wang Q, Wu H T, Mei G F, Zang Y H, Han Z G, Xu C Y, Shen W J, Yang D F, Si Z F, Dai F, Zou L F, Huang F, Bai Y L, Zhang Y G, Brodt A, Ben-Hamo H, Zhu X F, Zhou B L, Guan X Y, Zhu S J, Chen X Y, Zhang T Z.andgenomes provide insights into the origin and evolution of allotetraploid cotton. Nature Genetics, 2019, 51(4): 739-748.

[27] Letunic I, Doerks T, Bork P. SMART: recent updates, new developments and status in 2015. Nucleic Acids Research, 2015, 43(D1): D257-D260.

[28] Larkin M A, Blackshields G, Brown N P, Chenna R, McGettigan P A, McWilliam H, Valentin F, Wallace I M, Wilm A, Lopez R, Thompson J D, Gibson T J, Higgins D G. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 2007, 23(21): 2947-2948.

[29] Kumar S, Stecher G, Tamura K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution, 2016, 33(7): 1870-1874.

[30] Bjellqvist B, Basse B, Olsen E, Celis J E. Reference points for comparisons of two-dimensional maps of proteins from different human cell types defined in a pH scale where isoelectric points correlate with polypeptide compositions. Electrophoresis, 1994, 15(3/4): 529-539.

[31] Voorrips R E. MapChart: software for the graphical presentation of linkage maps and QTLs. Journal of Heredity, 2002, 93(1): 77-78.

[32] Chen C J, Chen H, Zhang Y, Thomas H R, Frank M H, He Y H, Xia R. TBtools: An integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data. Molecular Plant, 2020, 13(8): 1194-1202.

[33] Krzywinski M, Schein J, Birol I, Connors J, Gascoyne R, Horsman D, Jones S J, Marra M A. Circos: an information aesthetic for comparative genomics. Genome Research, 2009, 19(9): 1639-1645.

[34] Bailey T L, Boden M, Buske F A, Frith M, Grant C E, Clementi L, Ren J Y, Li W W, Noble W S. MEME Suite: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Research, 2009, 37(supp1_2): W202- W208.

[35] Lescot M, Déhais P, Thijs G, Marchal K, Moreau Y, Van de Peer Y, Rouzé P, Rombauts S. PlantCARE, a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences. Nucleic Acids Research, 2002, 30(1): 325-327.

[36] Yoshikawa M, Yang G X, Kawaguchi K, Komatsu S. Expression analyses of β-tubulin isotype genes in rice. Plant and Cell Physiology, 2003, 44(11): 1202-1207.

[37] Rao G D, Zeng Y F, He C Y, Zhang J G. Characterization and putative post-translational regulation of- andgene families in. Scientific Reports, 2016, 6: 19258.

[38] CHEN B J, ZHAO J J, FU G Y, PEI X X, PAN Z E, LI H G, AHMED H, HE S P, DU X M. Identification and expression analysis of Tubulin gene family in upland cotton. Journal of Cotton Research, 2021, 4(3): 229-238.

Genome-Wide Identification and Expression Analysis of β-tubulin Family in Cotton fiber development

DANG YuanYue1,2, MA JianJiang2, YANG ShuXian2, SONG JiKun1,2, JIA Bing1,2, FENG Pan2, CHEN QuanJia1, YU JiWen1,2

1College of Agriculture, Xinjiang Agricultural University/Engineering Research Centre of Cotton, Ministry of Education, Urumqi 830052;2Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Engineering Research Center of Cotton Biology Breeding and Industrial Technology, Anyang 455000, Henan

【Objective】β-tubulin is the basic structural unit of cotton fiber, regulates fiber cell morphogenesis, and plays a vital role in fiber development. But there is less understood how β-tubulin gene influenced the distinct characteristic of fiber quality traits in cotton. In this study, members of the β-tubulin gene family were identified in cotton, their expression profiles were analyzed, and role of β-tubulin genes were explored for fiber quality. 【Method】BLAST method was used to identify members of the β-tubulin gene family in the genomes of four cotton species. ProtParam tool was utilized to analyze physicochemical properties, MEGA7.0 to construct phylogenetic tree, Mapchart2.2 to draw chromosomal localization map, MEME to analyze conserved motif, and PlantCARE to analyze promoter cis-acting elements. Expression levels of β-tubulin genes were characterized by using transcriptome data from 39 studies on fiber development. Spearman correlation analysis was used to identify candidate genes for fiber quality traits. 【Result】Importantly, 36, 37, 19 and 18 β-tubulin genes were identified in the genomes of(AD1),(AD2),(A2) and(D5), respectively. The number of β-tubulin genes in tetraploid cotton species is almost double than that of diploid cotton species. Phylogenetic analysis classified these genes into 5 main clusters. Phylogenetic and collinearity analysis revealed that β-tubulin genes inis closely related toandas compared to. Furthermore, all genes have typical conservative domains with Tubulin and Tubulin-C. The genes physicochemical properties showed amino acids range from 421 to 508 with isoelectric point of 4.68 to 5.09. The analysis of promoter cis-acting elements identified growth responsive, hormone responsive, and stress responsive elements which showed β-tubulin mediates various mechanisms of cell growth regulation. Interestingly, cluster analysis on 36 β-tubulin gene expression profiles showed 42% genes in cluster П had dominant expression in fiber. In particular, 1, 6, and 11 β-tubulin genes exhibited significant correlation with fiber micronaire value, fiber strength, and fiber length, respectively. Four genes were found to influence fiber length and fiber strength traits simultaneously. 【Conclusion】A total of 110 β-tubulin gene family members were identified in the four cotton species. Their physicochemical properties and sequences of amino acids were highly conserved and the promoter sequence had diverse regulatory elements. This study characterized the expression profiles as well as molecular function of β-tubulin gene family in cotton fiber. Further discovered the potential candidate genes that probably regulate fiber quality traits in cotton. Our results may have great potential for cotton fiber quality improvement by genetic engineering.

cotton; β-tubulin gene family; bioinformatics; expression analysis; fiber development

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.23.003

2022-12-10；

2023-02-22

國家自然科學基金青年科學基金（32101716）、國家重點研發(fā)計劃（2022YFD1200300）

黨媛玥，E-mail：1015258312@qq.com。通信作者陳全家，E-mail：chqjia@126.com。通信作者于霽雯，E-mail：yujw666@hotmail.com

（責任編輯 李莉）