俞凡，王一清，戴國梁，嚴倩華，曹陽，余江毅

南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院（江蘇省中醫(yī)院），江蘇 南京 210029

糖痹通絡(luò)方由石斛、牛膝、雞血藤、絡(luò)石藤、鉤藤、川芎、當歸、地龍、紅花組成，已在江蘇省中醫(yī)院內(nèi)分泌科臨床使用多年，治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的效果顯著。內(nèi)分泌科已將此方劑申請成為院內(nèi)制劑，委托制劑部制成顆粒劑，便于患者服用。方中石斛益胃生津、滋陰清熱，牛膝散淤血、消癰腫、補肝腎、強筋骨，鉤藤清熱平肝、息風定驚，雞血藤、絡(luò)石藤活血通絡(luò)，川芎、當歸、地龍、紅花活血行氣通絡(luò)止痛。根據(jù)《中國藥典》2020 年版一部和相關(guān)研究報道[1-6]，絡(luò)石苷、阿魏酸、β-蛻皮激素、羥基紅花黃色素A 分別是絡(luò)石藤、當歸和川芎、牛膝、紅花中含量測定的指標性成分，而原兒茶酸經(jīng)常用于雞血藤的含量測定，作為雞血藤藥材質(zhì)量控制的重要成分[7]。對香豆酸是紅花中重要組成成分，經(jīng)常作為紅花的質(zhì)量控制成分[8]，此外，對香豆酸也存在于當歸、鐵皮石斛中[9-10]；現(xiàn)代藥理研究表明，對香豆酸具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、抗炎、預(yù)防和改善糖尿病、神經(jīng)保護作用[11]。本實驗采用HPLC 法同時測定糖痹通絡(luò)顆粒中原兒茶酸、羥基紅花黃色素A、對香豆酸、阿魏酸、β-蛻皮激素、絡(luò)石苷，為完善糖痹通絡(luò)顆粒的質(zhì)量控制標準提供參考。

1 材料

Agilent HP 1100 型高效液相色譜系統(tǒng)，配有Chem Station A.10.02 色譜工作站；CPA225D 電子天平；Millipore Q-A10 型超純水儀；Thermomicro17型高速冷凍離心機；KH5200E 超聲波清洗機；WH-2 微型旋渦混合儀。

糖痹通絡(luò)顆粒樣品由江蘇省中醫(yī)院制劑部提供，規(guī)格12 g/袋，批號分別為210922、210923、210924；原兒茶酸（批號MUST-22041413，質(zhì)量分數(shù)99.87%）、羥基紅花黃色素A（批號MUST-22062311，質(zhì)量分數(shù)99.82%）、對香豆酸（批號MUST-22050303，質(zhì)量分數(shù)99.96%）、阿魏酸（批號MUST-22052411，質(zhì)量分數(shù)99.96%）、β-蛻皮激素（批號MUST-22061107，質(zhì)量分數(shù)99.12%）、絡(luò)石苷（批號MUST-22061312，質(zhì)量分數(shù)98.46%）對照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用ACE 5 C18-AR 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）–0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～8% A；5～8 min，8% A；8～10 min，8%～9% A；10～15 min，9%～10% A；15～20 min，10%～12% A；20～30 min,12%～18%A；30～32 min，18% A；32～37 min，18%～20%A；37～45 min，20%～25% A；45～50 min，25%～30% A；50～55 min，30%～40% A；55～60 min，40%～60% A；60～62 min，60%～5% A）；檢測波長260 nm（原兒茶酸、β-蛻皮激素）、280 nm（對香豆酸、阿魏酸、絡(luò)石苷）、360 nm（羥基紅花黃色素A）；體積流量1 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取原兒茶酸、羥基紅花黃色素A、對香豆酸、阿魏酸、β-蛻皮激素、絡(luò)石苷對照品適量，加甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為1.07、0.93、1.18、1.07、1.13、1.20 mg/mL 的貯備液，再分別吸取上述對照品儲備液適量，加50%甲醇溶液定容并制成質(zhì)量濃度分別為21.4、55.8、47.2、64.2、79.1、192 0 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取2 g 糖痹通絡(luò)顆粒，加入10 mL 甲醇，混合均勻，超聲30 min，12 000 r/min 離心10 min，取500 μL 上清液，加入500 μL 純水，渦旋30 s，再12 000 r/min 離心10 min，取200 μL 上清液放入進樣瓶內(nèi)襯管中，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按照糖痹通絡(luò)顆粒的處方和工藝，分別制備缺絡(luò)石藤、紅花、牛膝的陰性樣品，按照供試品溶液的制備項下方法制得各陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

取糖痹通絡(luò)顆粒供試品、混合對照品溶液、各陰性樣品溶液，進樣測定，結(jié)果見圖1?？梢娫瓋翰杷?、羥基紅花黃色素A、對香豆酸、阿魏酸、β-蛻皮激素、絡(luò)石苷的保留時間分別為8.75、20.78、25.81、30.71、33.93、45.90 min，各成分在對應(yīng)位置無干擾。

圖1 糖痹通絡(luò)顆粒（A）、混合對照品（B）、缺絡(luò)石藤陰性樣品（C）、缺紅花陰性樣品（D）和缺牛膝陰性樣品（E）的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Tangbi Tongluo Granules (A),mixed reference substances (B),negative sample without Trachelospermi Caulis (C),negative sample without Carthamii Flos (D),negative sample without Achyranthis Bidentatae Radix (E)

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品溶液，50%甲醇依次稀釋2、4、8、16、32 倍，進樣測定。以各成分的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行回歸，結(jié)果見表1?？芍鞒煞衷诟髯苑秶鷥?nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Table 1 linear relationships of various components

2.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液，連續(xù)進樣6 次，測定峰面積孩子，計算得原兒茶酸、羥基紅花黃色素A、對香豆酸、阿魏酸、β-蛻皮激素、絡(luò)石苷峰面積的RSD 值分別為0.84%、1.28%、1.18%、1.37%、1.00%、1.14%。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密稱取批號210922 的糖痹通絡(luò)顆粒2 g，制備供試品溶液，常溫下放置，在0、2、4、6、8、12、24 h 分別測定峰面積，計算得原兒茶酸、羥基紅花黃色素A、對香豆酸、阿魏酸、β-蛻皮激素、絡(luò)石苷峰面積的RSD 值分別為1.53%、1.75%、1.69%、1.97%、1.18%、0.83%，表明供試品溶液中各成分在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

精密稱取批號210922 的糖痹通絡(luò)顆粒6 份，制備供試品溶液，進樣測定峰面積，計算得原兒茶酸、羥基紅花黃色素A、對香豆酸、阿魏酸、β-蛻皮激素、絡(luò)石苷質(zhì)量分數(shù)的RSD 值分別為1.82%、1.54%、1.13%、1.86%、1.63%、0.90%。

2.8 回收率試驗

精密稱取批號210922 的糖痹通絡(luò)顆粒樣品6份，各約1 g，分別加入原兒茶酸、羥基紅花黃色素A、對香豆酸、阿魏酸、β-蛻皮激素、絡(luò)石苷對照品0.064 2、0.230 4、0.047 2、0.226 8、0.159 6、0.673 2 mg，制備供試品溶液，進樣，根據(jù)測得的結(jié)果計算回收率。結(jié)果顯示原兒茶酸、羥基紅花黃色素A、對香豆酸、阿魏酸、β-蛻皮激素、絡(luò)石苷的平均加樣回收率分別為103.63%、96.93%、103.18%、97.09%、102.38%、100.08%，RSD 值分別為1.01%、0.88%、1.27%、0.90%、1.35%、1.05%。

2.9 樣品測定

精密稱取不同批次糖痹通絡(luò)顆粒2 g，制備供試品溶液，進樣測定，平行3 次，標準曲線法計算其中原兒茶酸、羥基紅花黃色素A、對香豆酸、阿魏酸、β-蛻皮激素、絡(luò)石苷質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 糖痹通絡(luò)顆粒中原兒茶酸、羥基紅花黃色素A、對香豆酸、阿魏酸、β-蛻皮激素和絡(luò)石苷的測定結(jié)果（n＝3）Table 2 Determination of protocatechuic acid,hydroxysafflor yellow A,p-coumaric acid,ferulic acid,β-ecdysterone,and tracheloside in Tangbi Tongluo Granules (n＝3)

3 討論

本實驗考察了甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇超聲提取的方法，發(fā)現(xiàn)甲醇提取時基線最低，峰形最好，所以選擇甲醇提取。本實驗也考察了甲醇超聲15、30、45 min 的方法，發(fā)現(xiàn)甲醇超聲處理30 min 效率最高，所以選擇超聲30 min。

本實驗考察了Zorbax SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）和ACE 5 C18-AR 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），發(fā)現(xiàn)ACE 5 C18-AR 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）的分離效果更優(yōu)，所以選擇該色譜柱。

本實驗考察了流動相甲醇–0.1%磷酸溶液、甲醇–乙腈（1∶1，含0.1%磷酸）、乙腈–0.1%磷酸水溶液，發(fā)現(xiàn)乙腈–0.1%磷酸水溶液的分離度最優(yōu)，分離的效率也最高，峰形也最好看。以磷酸鹽作為流動相，必須要減壓抽濾，否則不僅會對色譜柱造成損傷，還會導致峰的保留時間出現(xiàn)漂移的情況。

由于糖痹通絡(luò)顆粒中6 個成分在相同的波長條件下響應(yīng)值不高，所以選擇波長切換法測定各成分。羥基紅花黃色素A 在403 nm 處吸收峰最高[12]，但鑒于設(shè)備條件的限制，無法達到此波長。經(jīng)過多次試驗，把波長設(shè)置在360 nm。在該波長條件下，基線整體比較平穩(wěn)，不會出現(xiàn)突然拔高的現(xiàn)象。經(jīng)全波長掃描法確認β-蛻皮激素在240 nm 左右吸收峰最高[13]，但是把波長設(shè)定在260 nm 處，峰形最好，原兒茶酸在260 nm 處的吸收峰也較高。而絡(luò)石苷在270、280 nm 處都有吸收峰[14-15]，但在280 nm處吸收峰峰形最好，且對香豆酸、阿魏酸在280 nm處均有吸收，所以選擇該波長。

本實驗建立HPLC 法同時測定糖痹通絡(luò)顆粒中原兒茶酸、羥基紅花黃色素A、對香豆酸、阿魏酸、β-蛻皮激素、絡(luò)石苷，結(jié)果表明該方法簡單準確、穩(wěn)定可靠、重復性好，可用于糖痹通絡(luò)顆粒的質(zhì)量控制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突