黃巧波，劉明平

廣州中醫(yī)藥大學 中藥學教研室，廣東 廣州 510006

大黃具有廣泛的藥理作用如調(diào)節(jié)胃腸道蠕動、保護肝細胞、促進胰液分泌等[1]，其中蒽醌和鞣質(zhì)類成分對肝臟具有保護和損傷雙向作用[2-4]，大黃具有一定的肝毒性。因此，進一步深入探究大黃的肝毒性作用機制，減少不良反應具有重要的意義。近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)在中藥研究領(lǐng)域中的應用越來越受到關(guān)注[5]。通過構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)藥理學可在復雜體系中尋找大黃毒性物質(zhì)、預測已知化合物的不良反應[6]；分子對接技術(shù)可以通過模擬藥物化合物與蛋白靶點的結(jié)合，預測它們的結(jié)合模式及結(jié)合自由能[7]，驗證篩選的核心成分與關(guān)鍵靶標是否能有效結(jié)合。本研究將2 種技術(shù)相結(jié)合探討大黃肝毒性的核心成分、關(guān)鍵靶點及毒理機制，為為進一步探究大黃的肝毒性提供了新的線索。

1 材料與方法

1.1 大黃活性成分和潛在肝毒性成分的篩選

TCMSP 數(shù)據(jù)庫輸入“大黃”，獲得大黃活性成分，以生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為條件進行篩選。查找文獻對篩選的大黃活性成分進行肝毒性驗證和獲取其他潛在肝毒性成分。

1.2 大黃活性及潛在肝毒性成分作用靶點的預測

在PubChem 數(shù)據(jù)庫輸入TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取的活性成分及文獻獲取的潛在肝毒性成分對應InChIKey 信息，將大黃成分轉(zhuǎn)化為標準Canonical SMILES 格式，導入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫，獲得大黃活性及潛在肝毒性成分靶點，結(jié)合TCMSP數(shù)據(jù)庫對大黃成分靶點進行補充。

1.3 人類肝毒性相關(guān)靶點的獲取

在GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫中輸入“l(fā)iver toxic”，集合數(shù)據(jù)庫靶點并去重得到人類肝毒性相關(guān)靶點。

1.4 預測大黃肝毒性潛在作用靶點

將1.2 項下獲取的大黃成分作用靶點與1.3 項下獲取的人類肝毒性相關(guān)靶點導入在線韋恩平臺取交集，即可能是大黃肝毒性潛在作用靶點。

1.5 “大黃成分–肝毒性作用靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心成分的篩選

將1.1 項下收集的大黃活性及潛在肝毒性成分與1.4 項下收集的大黃肝毒性潛在作用靶點導入通過Cytoscape 3.9.1 軟件，建立“大黃成分–肝毒性作用靶點”網(wǎng)絡(luò)。利用Network Analyzer 功能篩選該網(wǎng)絡(luò)中degree 值排名前5 位的成分，即可能是大黃肝毒性核心成分。

1.6 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點的篩選

將1.4 項下獲得的大黃肝毒性潛在作用基因靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖和蛋白靶點相互作用數(shù)據(jù)，利用Cytoscape 3.9.1 軟件進行可視化分析。采用Network Analyzer 功能篩選該網(wǎng)絡(luò)中degree 值排名前5 位的靶點，即可能是大黃肝毒性關(guān)鍵靶點。

1.7 富集分析

將大黃肝毒性潛在作用靶點導入在DAVID 數(shù)據(jù)庫，進行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析，并制作氣泡圖。

1.8 分子對接

采用PDB、TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和核心成分結(jié)構(gòu)，利用AutoDock 軟件將小分子和蛋白進行半柔性對接，Pymol 軟件對部分構(gòu)象進行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 大黃候選肝毒性成分

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選得到候選活性成分共16 種（表1），其中番瀉苷E（sennoside E_qt）未尋找到相關(guān)靶點，故舍棄。結(jié)合文獻報道，具有肝毒性的大黃酸苷A（rheinoside A）[1]、大黃素甲醚（physcion）、大黃酚（chrysophanol）、大黃素（emodin）、沒食子酸（gallic acid）[2]、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate）[8]6 種，共得到21 種成分。

表1 大黃候選活性成分Table 1 Candidate active ingredients of Rhei Radix et Rhizoma

2.2 大黃肝毒性潛在作用靶點的預測

利用Swiss Target Prediction、TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得21 種成分的作用靶并去重共724 個。GeneCards中以relevance score＞10 為條件進行篩選，結(jié)合OMIM 數(shù)據(jù)庫去重后得到957 個人類肝毒性相關(guān)靶點。采用在線韋恩工具對大黃成分作用靶點與人類肝毒性相關(guān)靶點進行交集，獲得共同靶點151 個（圖1），即為大黃肝毒性潛在作用靶點。

圖1 大黃成分–肝毒性靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Rhei Radix et Rhizoma components-hepatic toxicity targets

2.3 “大黃成分–肝毒性作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖及核心成分

將上述得到的大黃候選肝毒性成分和肝毒性潛在作用靶點數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.9.1 軟件中繪制“大黃成分–肝毒性作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)包括745 個節(jié)點（圖2）。Network Analyzer 功能分析顯示，degree 值排名前5 位的成分見表2。確定為大黃肝毒性的核心成分。

圖2 “大黃成分–肝毒性作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of “Rhei Radix et Rhizoma -hepatotoxicity targets”

表2 大黃核心成分degree 值Table 2 Degree values of core components of Rhei Radix et Rhizoma

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖及關(guān)鍵靶點

借助STRING 數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 3.9.1 軟件得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，共涉及149 個節(jié)點（圖3）。Network Analyzer 功能分析顯示，該網(wǎng)絡(luò)中degree 值排名前5 位的靶點見表3。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram

表3 PPI 網(wǎng)絡(luò)靶點degree 值Table 3 PPI network target degree value

2.5 GO 功能富集分析

利用DIVAD 進行GO 功能富集分析共獲得生物過程（BP）745 個條目，細胞組成（CC）83 個條目和分子功能（MF）162 個條目，其中P＜0.01，BP 有366 條，CC 有40 條，MF 有84 條。將排名前10 位條目可視化，見圖4。

圖4 GO 功能分析Fig.4 GO function analysis

2.6 KEGG 通路富集分析

利用DIVAD 進行KEGG 通路富集分析，得到大黃肝毒性的相關(guān)通路共164 條，其中P＜0.01 的有139 條，排名前10 位的通路可視化，見圖5。

圖5 KEGG 通路分析Fig.5 KEGG pathway analysis

2.7 分子對接

選擇上述網(wǎng)絡(luò)圖中degree 值靠前的大黃酚、β-谷甾醇、大黃素-1-O-β-D-葡萄糖硫苷、大黃素甲醚二葡萄糖苷、大黃酸為分子對接配體；選取PPI 網(wǎng)絡(luò)中degree 值排名前3 位的關(guān)鍵靶點ALB、Akt1、TP53 為對接受體。小分子與蛋白結(jié)合能小于-4.25 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）表示兩者有一定的結(jié)合能力，小于-5.0 kcal/mol 表示有較好的結(jié)合能力，小于-7.0 kcal/mol 表示兩者具備良好的結(jié)合能力[9]。通過Autodock 軟件進行分子對接并計算出結(jié)合能（表4），部分對接結(jié)果利用Pymol 軟件繪圖，見圖6。

圖6 大黃肝毒性核心成分與關(guān)鍵靶點部分對接結(jié)果圖Fig.6 Results of partial docking between core components of Rhei Radix et Rhizoma hepatotoxicity and key targets

表4 大黃核心成分與關(guān)鍵靶點結(jié)合能Table 4 Binding energy of core components of Rhei Radix et Rhizoma and key targets

3 討論

大黃的主要肝毒性成分為蒽醌類成分和鞣質(zhì)類。大黃成分–肝毒性靶點網(wǎng)絡(luò)degree 值前10 位均為這兩類成分。已有研究表明，游離蒽醌類成分如大黃酚、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、蘆薈大黃素等和結(jié)合型蒽醌苷如大黃素葡萄糖苷、蘆薈大黃素葡萄糖苷等具有肝毒性，毒性機制多表現(xiàn)在促細胞凋亡、氧化應激、線粒體功能損傷等[10-15]。而劉俊[10]的研究結(jié)果表明，結(jié)合型蒽醌類化合物溶解度較大，大黃酸和大黃素甲醚溶解度較小。TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到大黃活性成分結(jié)果顯示，游離大黃素和游離大黃素甲醚OB 值均比其苷類成分低，而游離大黃酸卻相反。大黃酚OB 值較低，但成分–靶點網(wǎng)絡(luò)中degree 值最高，分析其作用靶點可能在胃腸道，通過作用于腸–肝軸而表現(xiàn)肝毒性。王敏等[2,16]研究證實，大黃鞣質(zhì)具有一定的肝損傷作用，一般認為沒食子酸的肝毒性大于兒茶素。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，ALB、Akt1、TP53、TNF、VEGFA 等靶點是大黃肝毒性的關(guān)鍵靶點。KEGG 富集分析顯示，大黃致肝損傷主要通路主要包括癌癥通路、前列腺癌、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等。另外，degree 值較高的還涉及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 信號通路、癌癥中的中心碳代謝、化學致癌–受體激活、白細胞介素（IL）-17 信號通路、TNF 信號通路等通路，大黃致肝損傷的通路多涉及癌癥與炎癥反應等方面。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突