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        紫杉醇/低分子肝素-胱胺-維生素E 琥珀酸酯膠束的制備及其體外細(xì)胞毒性

        2023-12-27 08:33:40艾丹萬(wàn)莉莉張琦雷銘道
        現(xiàn)代藥物與臨床 2023年12期
        關(guān)鍵詞:紫杉醇質(zhì)量

        艾丹,萬(wàn)莉莉,張琦,雷銘道*

        1.江西省婦幼保健院,江西 南昌 330004

        2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 人文學(xué)院,江西 南昌 330006

        3.江西中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,江西 南昌 330006

        紫杉醇是從紅豆杉樹(shù)皮中分離提純的天然次生代謝產(chǎn)物,具有良好的抗腫瘤作用,在臨床上廣泛使用[1]。但紫杉醇幾乎不溶于水,這成為紫杉醇制劑開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用的一個(gè)重要障礙。紫杉醇還會(huì)導(dǎo)致骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)等嚴(yán)重不良反應(yīng)。兩親性高分子聚合物可以在水溶液中自組裝成具有疏水性?xún)?nèi)核和親水性外殼的結(jié)構(gòu),疏水性的內(nèi)核能包裹難溶性藥物,由此形成的載藥聚合物膠束是一種新型的靶向給藥系統(tǒng)[2-3]。開(kāi)發(fā)紫杉醇靶向膠束給藥系統(tǒng)是一個(gè)非常好的提高溶解度、降低不良反應(yīng)的途徑。本課題組設(shè)計(jì)和合成了低分子肝素為親水基團(tuán)、維生素E 琥珀酸酯為疏水基團(tuán)的兩親性聚合物低分子肝素–胱胺–維生素E 琥珀酸酯(LMWHcys-TOS),所使用的連接臂是對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽敏感的胱胺基團(tuán)[4-7]。本實(shí)驗(yàn)以LMWHcys-TOS 為骨架材料,利用自組裝方式包裹紫杉醇,構(gòu)建載藥聚合物紫杉醇/低分子肝素–胱胺–維生素E 琥珀酸酯(PTX/LMWH-cys-TOS)膠束,研究了其制劑學(xué)性質(zhì)和體外細(xì)胞毒性,以期為以紫杉醇為代表的難溶性藥物臨床使用提供一種有前景的新型膠束遞送系統(tǒng)。

        1 儀器和試劑

        ZEN3690 馬爾文粒度測(cè)定儀(英國(guó)Malvern 公司);SpectraMaxi3 多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices 公司);Waters e2695 型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters 公司);DF-101S 磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司);EYELA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會(huì)社);Milli-Q 超純水儀(美國(guó)密理博公司);SORVALL ST 8R 型冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo fisher 公司);JY92-2D 超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

        LMWH-cys-TOS(實(shí)驗(yàn)室自制,數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為8.1×104)[7];紫杉醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,南京本草益康生物科技有限公司,批號(hào)20201003);乙醇(分析純,西隴科學(xué)股份有限公司,批號(hào)20211098);二甲基亞砜(DMSO,安耐吉化學(xué)試劑有限公司,貨號(hào) NC0239609);HCT-15、HCT-15/Taxol 細(xì)胞(上海畢合生物化學(xué)技術(shù)有限公司);透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量3 500,北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào)MD44-3500D);二硫蘇糖醇(上海源葉生物科技有限公司,批號(hào)20220912);胎牛血清(100%,上海MRC 生物科技中心,批號(hào)20221202);磷酸鹽緩沖液(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào)P1010-2L);CCK8 溶液(≥99.5%,大連美侖生物科技有限公司,批號(hào)20211215);RPMI-1640 培養(yǎng)基(南昌市暉石科技有限公司,貨號(hào)P3007)。

        2 方法和結(jié)果

        2.1 LMWH-cys-TOS 臨界膠束濃度的測(cè)定

        將尼羅紅溶解在二氯甲烷溶液中,使尼羅紅的最終濃度是1 μmol/L。取20 μL 尼羅紅溶液置于小燒杯中,分別加入適量8.00、16.00、32.00、64.00、128.00、256.00、512.00 μg/mL LMWH-cys-TOS 空白膠束溶液,避光條件下持續(xù)攪拌過(guò)夜,將尼羅紅包裹進(jìn)入LMWH-cys-TOS 膠束的疏水性?xún)?nèi)核之中。在激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm 的條件下使用酶標(biāo)儀測(cè)定不同質(zhì)量濃度的LMWH-cys-TOS 膠束的熒光強(qiáng)度。以膠束的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),測(cè)定的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖,兩條切線的交點(diǎn)即為臨界膠束濃度。由圖1 可知,LMWH-cys-TOS臨界膠束質(zhì)量濃度是27.3 μg/mL。此臨界膠束質(zhì)量濃度較小,表明LMWH-cys-TOS 具有良好的自組裝能力和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,可作為膠束載體材料包裹難溶性藥物。

        圖1 尼羅紅熒光強(qiáng)度與LMWH-cys-TOS 聚合物濃度關(guān)系Fig.1 Correlation of fluorescense density of nile red against LMWH-cys-TOS polymer concentration

        2.2 PTX/LMWH-cys-TOS 膠束的制備

        2.2.1 膠束的制備方法 將15 mg LMWH-cys-TOS溶解在5 mL 水中,攪拌條件下緩慢滴加紫杉醇乙醇溶液。為進(jìn)一步促進(jìn)載藥膠束的形成,在冰水浴中將混合溶液用探頭超聲10 min,然后繼續(xù)攪拌30 min,轉(zhuǎn)速1 200 r/min,減壓蒸去或透析除去有機(jī)溶劑,然后5 000 r/min 離心除去沒(méi)有包載的紫杉醇,冷凍干燥,即得PTX/LMWH-cys-TOS 膠束的凍干產(chǎn)品。

        2.2.2 包封率和載藥率的測(cè)定 色譜條件:Welch XB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈–水(45∶55);檢測(cè)波長(zhǎng):227 nm;柱溫:30 ℃;體積流量:1 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。精密稱(chēng)取一定量的PTX/LMWH-cys-TOS 膠束凍干產(chǎn)品,加入甲醇破壞膠束的結(jié)構(gòu),并稀釋至質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL,采用HPLC 法測(cè)定膠束中紫杉醇的質(zhì)量濃度,計(jì)算膠束的包封率和載藥率[8]。

        包封率=膠束中紫杉醇質(zhì)量/紫杉醇的總投藥量

        載藥率=膠束中紫杉醇質(zhì)量/(紫杉醇的總投藥量+高分子聚合物的總投藥量)

        2.2.3 有機(jī)溶劑對(duì)膠束載藥能力的影響 從表1 可以看出,乙醇作為溶劑制備的膠束具有最大的載藥率和最大的包封率??赡苁悄z束載藥的過(guò)程是載體中疏水性?xún)?nèi)核和有機(jī)溶劑競(jìng)爭(zhēng)溶解紫杉醇的過(guò)程,在能充分溶解藥物的前提下,選擇藥物溶解度相對(duì)低一點(diǎn)的溶劑更有助于藥物進(jìn)入疏水性?xún)?nèi)核,更有利于載藥膠束的形成。經(jīng)過(guò)測(cè)定,紫杉醇在DMSO、甲醇和乙醇的溶解度分別為150、50、1.5 mg/mL,與DMSO、甲醇相比,紫杉醇在乙醇中的溶解度最小,因此乙醇作為溶劑非常有利于紫杉醇進(jìn)入膠束的疏水性?xún)?nèi)核。

        表1 不同溶劑對(duì)膠束載藥率和包封率影響(,n=3)Table 1 Effect of various of solvents on drug loading capacity and entrapment efficiency of micelles (,n=3)

        表1 不同溶劑對(duì)膠束載藥率和包封率影響(,n=3)Table 1 Effect of various of solvents on drug loading capacity and entrapment efficiency of micelles (,n=3)

        2.2.4 藥物載體比例對(duì)膠束載藥能力的影響 以乙醇作為溶劑,不同的藥物載體比例對(duì)膠束粒徑、載藥率和包封率的影響結(jié)果見(jiàn)表2??梢钥闯?,隨著紫杉醇和載體材料之間比例的增加,載藥率增加,但是包封率卻不斷下降。因?yàn)殡S著紫杉醇量的增加,結(jié)合到LMWH-cys-TOS 疏水性?xún)?nèi)核中藥物的量也會(huì)相應(yīng)的增加,但是隨著內(nèi)核中結(jié)合的紫杉醇分子的增多,分子之間的空間位阻也會(huì)越來(lái)越大,導(dǎo)致疏水性?xún)?nèi)核無(wú)法結(jié)合更多的紫杉醇分子,因此藥量增加雖然在一定程度上能增加載藥率,但是相對(duì)于加入的藥量,包裹進(jìn)入疏水區(qū)域的過(guò)程中損失的藥量也會(huì)增加,從而使包封率隨之降低。雖然較高的載藥率能滿(mǎn)足臨床所需的治療濃度,但是較低的包封率會(huì)增加藥物的成本。從粒徑、載藥率和包封率3 個(gè)方面綜合考慮,將紫杉醇與LMWHcys-TOS 的最佳藥物載體比例設(shè)定為1∶3.6。

        表2 不同藥物載體比例對(duì)膠束粒徑、載藥率和包封率的影響(,n=3)Table 2 Effect of drug-carrier ratio on particle size,loading capacity,and entrapment efficiency of micelles(,n=3)

        表2 不同藥物載體比例對(duì)膠束粒徑、載藥率和包封率的影響(,n=3)Table 2 Effect of drug-carrier ratio on particle size,loading capacity,and entrapment efficiency of micelles(,n=3)

        2.2.5 最佳處方 采用最優(yōu)處方制備PTX/LMWHcys-TOS 膠束,即紫杉醇和LMWH-cys-TOS 的最佳比例是1∶3.6,使用乙醇作為有機(jī)溶劑制備膠束。

        2.3 膠束載藥率和包封率的測(cè)定

        取一定量PTX/LMWH-cys-TOS 膠束,測(cè)得載藥率和包封率分別為(18.7±4.3)%、(77.5±13.2)%。

        2.4 膠束粒徑和Zeta 電位的測(cè)定

        精密稱(chēng)取一定量的PTX/LMWH-cys-TOS 膠束的凍干產(chǎn)品,用5%葡萄糖溶液復(fù)溶,稀釋至質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL,使用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定粒徑和Zeta 電位,結(jié)果見(jiàn)圖2。PTX/LMWH-cys-TOS 膠束的粒徑是118.9 nm,多分散指數(shù)(PDI)是0.164,較小的PDI 值說(shuō)明膠束的粒徑分布比較均一。Zeta電位是-30.37 mV。肝素是一種陰離子多糖,在水性介質(zhì)中肝素帶負(fù)電荷;如果電位的絕對(duì)值大于30 mV,膠束粒子之間的排斥力會(huì)比較大,較大的電荷排斥力能夠阻止膠束粒子的聚集,能很好地維持膠束的穩(wěn)定性[8]。粒子表面的負(fù)電荷還可以降低膠束和血液中蛋白的相互作用,避免粒子被快速清除。

        圖2 PTX/LMWH-cys-TOS 膠束的粒徑和Zeta 電位Fig.2 Particle size and Zeta potential of PTX/ LMWH-cys-TOS micelle

        2.5 膠束凍干粉針?lè)€(wěn)定性研究

        使用2%的乳糖作為凍干保護(hù)劑,采用冷凍干燥法制備PTX/LMWH-cys-TOS 膠束凍干粉針,取適量,加入5%葡萄糖溶液復(fù)溶,分別于4、23 ℃避光保存,在24、72 h 取樣,測(cè)定膠束溶液中紫杉醇的質(zhì)量濃度和膠束的粒徑,以0 d 的膠束溶液作為對(duì)照。結(jié)果加入凍干保護(hù)劑的膠束表面均勻,沒(méi)有塌陷和皺縮,提示5%葡萄糖溶液具有很好的復(fù)溶性,見(jiàn)表3。在4 ℃下,膠束溶液保存24 h 后,溶液的外觀無(wú)明顯變化,載藥率和粒徑?jīng)]有明顯改變,但在23 ℃條件下放置24 h,膠束的載藥率和粒徑均發(fā)生變化,尤其載藥率顯著降低。72 h 后,在4、23 ℃條件下,載藥率和粒徑均發(fā)生顯著變化。溫度對(duì)膠束復(fù)溶溶液的穩(wěn)定性影響顯著,復(fù)溶后的膠束應(yīng)該在4 ℃保存,而且要盡快使用。

        表3 PTX/LMWH-cys-TOS 膠束凍干粉針的復(fù)溶穩(wěn)定性(,n=3)Table 3 Stability of PTX/LMWH-cys-TOS micelle freezedried powder injection (,n=3)

        表3 PTX/LMWH-cys-TOS 膠束凍干粉針的復(fù)溶穩(wěn)定性(,n=3)Table 3 Stability of PTX/LMWH-cys-TOS micelle freezedried powder injection (,n=3)

        2.6 體外釋放動(dòng)力學(xué)

        采用透析法測(cè)定PTX/LMWH-cys-TOS 膠束的體外釋放特性。將載藥膠束稀釋至紫杉醇的質(zhì)量濃度是0.8 mg/mL,精密量取膠束溶液1 mL,置于透析袋中,然后將透析袋置于盛有100 mL 溶出介質(zhì)[含有0、20 μmol/L、20 mmol/L 二硫蘇糖醇的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)]的小燒杯中,在水浴恒溫振蕩器中進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn),溫度是(37±1)℃,振蕩頻率是100 次/min,在預(yù)先設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)取樣,采用HPLC 法測(cè)定釋放介質(zhì)中紫杉醇的質(zhì)量濃度,繪制累積釋放率–時(shí)間曲線,結(jié)果見(jiàn)圖3。在所有釋放介質(zhì)中,紫杉醇都不存在突釋現(xiàn)象,說(shuō)明紫杉醇主要包裹在疏水性的內(nèi)核中,而不是吸附在膠束的表面。在不含二硫蘇糖醇的磷酸鹽緩沖液中,24 h 內(nèi)紫杉醇的累積釋放率約為15%,當(dāng)釋放介質(zhì)中含有二硫蘇糖醇時(shí),紫杉醇的釋放率會(huì)明顯增加,主要的原因是二硫蘇糖醇斷裂了二硫鍵,破壞了LMWH-cys-TOS 膠束的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致紫杉醇的快速釋放。隨著二硫蘇糖醇濃度的增加,紫杉醇的釋放量增加得更快,二硫蘇糖醇的濃度是20 μmol/L 時(shí),紫杉醇36 h 的累積釋放量?jī)H為19%,而二硫蘇糖醇的濃度是20 mmol/L 時(shí),紫杉醇的36 h 的累積釋放量高達(dá)93%。

        圖3 不同濃度二硫蘇糖醇條件下膠束中紫杉醇的累積釋放率-時(shí)間曲線Fig.3 Accumulative release-time curve of paclitaxel from micelles under different concentrations of dithiothreitol

        2.7 體外細(xì)胞毒性

        采用CCK8 法研究膠束對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15 的毒性,利用耐紫杉醇的HCT-15/Taxol 作為對(duì)照。將HCT-15、HCT-15/TaxoL 細(xì)胞復(fù)蘇,傳代至較好的細(xì)胞狀態(tài),轉(zhuǎn)移至96 孔板,每孔加入約5×104個(gè)細(xì)胞,在RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。將96 孔板中原有的培養(yǎng)基吸出,并加入紫杉醇或配制好的含PTX/LMWH-cys-TOS 膠束的培養(yǎng)基(以紫杉醇計(jì)算的等效質(zhì)量濃度為0~1.0 μg/mL),于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48、72 h。吸出上清液,每個(gè)孔中加入100 μL 含10 μL CCK8 的培養(yǎng)基混合液,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育6 h,使用酶標(biāo)儀在450 nm 測(cè)定吸光度值。通過(guò)SPSS 軟件分別計(jì)算48、72 h 抑瘤率IC50值,見(jiàn)表4。

        表4 PTX/LMWH-cys-TOS 膠束和紫杉醇在HCT15 和HCT-15/Taxol 細(xì)胞上的毒性(,n=3)Table 4 Cytotoxicity of PTX/LMWH-cys-TOS micelle and free paclitaxel in HCT15 or HCT-15/Taxol cell(,n=3)

        表4 PTX/LMWH-cys-TOS 膠束和紫杉醇在HCT15 和HCT-15/Taxol 細(xì)胞上的毒性(,n=3)Table 4 Cytotoxicity of PTX/LMWH-cys-TOS micelle and free paclitaxel in HCT15 or HCT-15/Taxol cell(,n=3)

        與HCT-15+紫杉醇組比較:**P<0.01**P<0.05 vs HCT-15 + paclitaxel group

        從表4 中可以看出,在紫杉醇敏感的HCT15 細(xì)胞和耐藥的HCT15/Taxol 細(xì)胞上,PTX/LMWH-cys-TOS 膠束的IC50沒(méi)有顯著差異,說(shuō)明膠束能克服腫瘤的耐藥性,而紫杉醇在耐藥細(xì)胞HCT15 和敏感細(xì)胞HCT15/Taxol 上的IC50有顯著差異(P<0.01)。

        2.8 細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的測(cè)定

        細(xì)胞培養(yǎng)和加藥過(guò)程同2.7 項(xiàng)下方法,但在48、72 h 時(shí)取未加入CCK8 的細(xì)胞株,吸去培養(yǎng)基,利用空白的磷酸鹽緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞3 次,吸去緩沖液后,加入500 μL 乙腈溶液,探頭超聲3 min 破碎細(xì)胞。3 000 r/min 離心5 min,取上清液,采用HPLC 法測(cè)定紫杉醇的質(zhì)量濃度,計(jì)算攝取進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的紫杉醇的量,結(jié)果見(jiàn)表5。

        表5 PTX/LMWH-cys-TOS 膠束和紫杉醇在HCT15 和HCT-15/Taxol 細(xì)胞內(nèi)的濃度(,n=3)Table 5 Concentration of paclitaxel in HCT15 and HCT-15/Taxol cell of PTX/LMWH-cys-TOS micelle and free paclitaxel in HCT15 or HCT-15/Taxol cell(,n=3)

        表5 PTX/LMWH-cys-TOS 膠束和紫杉醇在HCT15 和HCT-15/Taxol 細(xì)胞內(nèi)的濃度(,n=3)Table 5 Concentration of paclitaxel in HCT15 and HCT-15/Taxol cell of PTX/LMWH-cys-TOS micelle and free paclitaxel in HCT15 or HCT-15/Taxol cell(,n=3)

        與HCT-15+紫杉醇組比較:**P<0.01**P<0.05 vs HCT-15 + paclitaxel group

        紫杉醇在細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)量濃度也驗(yàn)證了2.7 項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在HCT15 和HCT15/Taxol 細(xì)胞上,膠束給藥后紫杉醇的質(zhì)量濃度沒(méi)有顯著差異,但是紫杉醇溶液給藥后,在HCT15 內(nèi)的質(zhì)量濃度顯著高于在HCT15/Taxol 細(xì)胞內(nèi)的紫杉醇質(zhì)量濃度(P<0.01)。

        3 討論

        紫杉醇作為一個(gè)經(jīng)典的抗腫瘤藥物,在臨床上應(yīng)用非常廣泛,用于很多腫瘤的治療,但是紫杉醇理化性質(zhì)具有缺陷,尤其是在生物相容性溶劑中的溶解度較低,是其制劑開(kāi)發(fā)一個(gè)很大的障礙。因此采用膠束制劑方式是提高紫杉醇溶解度和實(shí)現(xiàn)靶向給藥的重要?jiǎng)┬汀?/p>

        采用透析法測(cè)定了PTX/LMWH-cys-TOS 膠束在含不同濃度二硫蘇糖醇的磷酸鹽緩沖液中的釋放,結(jié)果紫杉醇的釋放量隨著二硫蘇糖醇濃度的增加而增加。正常細(xì)胞外環(huán)境中還原型谷胱甘肽的濃度為2~20 μmol/L,而腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的濃度為2~20 mmol/L,當(dāng)磷酸鹽緩沖液中二硫蘇糖醇的濃度為20 mmol/L 時(shí),36 h 的累積釋放量高達(dá)93%,因此采用cys 作為連接臂,有助于膠束在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的靶向釋放,減少了藥物在正常組織中的質(zhì)量濃度,從而降低紫杉醇的毒性[9]。

        利用CCK8 法研究了PTX/LMWH-cys-TOS 膠束在紫杉醇敏感細(xì)胞HCT15 和耐藥細(xì)胞HCT15/Taxol 上的細(xì)胞毒性??梢?jiàn)PTX/LMWH-cys-TOS 膠束可以克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性。阿霉素和肝素聯(lián)合使用后,阿霉素在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的攝取量和抗腫瘤活性都增加了,可能是肝素能抑制P-gp 等外排蛋白的功能,減少抗腫瘤藥物被外排到細(xì)胞外面[9-10]。實(shí)驗(yàn)中,PTX/LMWH-cys-TOS 進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部后,在還原型谷胱甘肽作用下,膠束發(fā)生解體,肝素和紫杉醇從膠束中釋放,肝素開(kāi)始發(fā)揮抑制腫瘤耐藥的作用,提高了紫杉醇的活性。PTX/LMWH-cys-TOS膠束比紫杉醇更好地抑制腫瘤生長(zhǎng),可能還與膠束以一種胞飲的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部有關(guān)系。因此,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的PTX/LMWH-cys-TOS 膠束利用了肝素和cys 各自的功能,發(fā)揮了兩者的協(xié)同作用[10-11]。

        利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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