何山，歐水平，葉林虎，王森*，吳大章,

1.遵義醫(yī)科大學 藥學院，貴州 遵義 563000

2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義 563000

3.華南理工大學附屬第六醫(yī)院，廣東 佛山 528000

4.太極集團重慶桐君閣藥廠有限公司，重慶 401366

川楝子又名川楝實，是楝科植物川楝Melia toosendanSieb.et Zucc.的干燥成熟果實，主要分布在我國的四川、湖南、湖北、貴州等地區(qū)，因入藥以四川產(chǎn)為道地藥材，故名為川楝子[1]。川楝子中富含萜類、黃酮類、有機酸以及多糖等多種活性成分[2]，具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、消炎鎮(zhèn)痛、驅蟲等廣泛藥理作用[3]。隨著對川楝子的研究，發(fā)現(xiàn)其除了具有藥理作用，還具有一定的毒性作用，在川楝子毒性方面的研究中，早期有報道稱，在用川楝子進行驅蟲時，發(fā)現(xiàn)有28 例發(fā)生中毒現(xiàn)象，10 例死亡病例[4]。近年來，通過對其毒性研究發(fā)現(xiàn)其具有肝毒性、妊娠毒性、肌無力、神經(jīng)肌肉毒性[5]、消化系統(tǒng)[6]等，主要表現(xiàn)在胃腸道刺激和肝毒性方面。胃腸道刺激方面，有報道稱服用川楝子的患者通常在服藥后1～2 h 內就會發(fā)生胃腸刺激反應[7]。肝毒性方面，近年來，越來越多的文獻研究表明川楝子確實可導致肝毒性，在報道的92 例中藥致藥物性肝損傷的病例中，其使用的有大部分中藥及制劑含有川楝子等成分[8]；趙筱萍等[9]快速篩查川楝子肝毒性成分并鑒定發(fā)現(xiàn)，川楝子中的meliasenin B、trichilinin D、1-O-tigloy-1-O-debenzoylohchinal 可能引起肝毒性，王昆陽等[6]研究中報道這3 者是川楝子致肝毒性的物質基礎。大多數(shù)認為毒性蛋白和川楝素類化合物是川楝子的毒性來源[10]，但目前針對川楝子毒性物質基礎和毒性機制尚未完全明確，因此，本研究通過網(wǎng)絡藥理學[11]及分子對接技術探討川楝子致肝毒性的物質基礎和機制，以期為臨床研究提供理論依據(jù)。

1 方法

1.1 川楝子候選毒性化合物的篩選

在中藥藥理數(shù)據(jù)庫及分析平臺（TCMSP）中輸入“川楝子”進行搜索，獲取川楝子活性化合物，并通過設置口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，對川楝子活性成分進行篩選，然后將從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中篩選出的化合物在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中下載候選成分的化學結構。并將其上傳至Swiss ADME 平臺（http://www.swissadme.ch），以腸胃吸收為“high”和類藥性五原則（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）中至少有2 個結果是“Yes”為標準進行篩選，得到川楝子的活性成分，將活性成分輸入CTD 數(shù)據(jù)庫進行毒性篩選，結合文獻報道[9,12,13,14]的毒性成分補充，最終確定川楝子潛在毒性成分。

1.2 川楝子潛在毒性成分靶點的預測

通過 PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫下載毒性成分的2D 結構的sdf 格式文件，并將下載的毒性成分的2D 結構式或標準的Smiles 號導入SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫中，屬性設置為“homo sapiens”，分別進行不同毒性成分的靶點基因預測，并用TCMSP 中已有的靶點進行補充。

1.3 肝臟相關靶點的獲取

在 GeneCards 數(shù)據(jù)庫中輸入主題詞“l(fā)iver toxicity”進行檢索，以score 值中位數(shù)為標準，篩選score 值大于中位數(shù)的靶點，即為肝臟相關靶點。

1.4 川楝子肝臟毒性潛在作用靶點預測

將川楝子毒性成分的靶點與肝臟損傷相關靶點上傳到在線韋恩圖（www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html），以川楝子毒性成分靶點和肝毒性靶點進行作圖，二者的交集即為川楝子的肝臟毒性潛在作用靶點。

1.5 川楝子“毒性成分–預測靶點”“毒性成分–潛在作用靶點”網(wǎng)絡的構建

整理川楝子毒性成分與對應靶點信息及1.4 項下的交集靶點信息，利用軟件Cytoscape 3.8.2 版構建川楝子“毒性成分–預測靶點”“毒性成分–潛在作用靶點”網(wǎng)絡圖。

1.6 潛在作用靶點基因的蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡的構建

將川楝子毒性成分靶點基因與肝臟損傷相關靶點基因的交集導入String 數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org/）中，選定研究物種為“Homo Sapiens”，設置連接評分值＞0.7，隱藏相互沒有鏈接的蛋白，得到PPI 網(wǎng)絡圖。并應用軟件Cytoscape 3.8.2 版對網(wǎng)絡進行可視化處理和分析。

1.7 靶點蛋白的基因功能和通路分析

應用生物學信息注冊數(shù)據(jù)庫DAVID（https://david.ncifcrf.gov）對川楝子毒性成分肝臟潛在作用靶點進行基因本體（GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，獲得川楝子毒性成分對肝臟作用的主要生物過程和主要信號通路。并利用微生信數(shù)據(jù)庫（www.bio informatics.con.cn）在線構建GO 功能富集網(wǎng)絡圖，再利用軟件Cytoscape 3.8.2 版以KEGG 分析結果中的顯著通路數(shù)據(jù)信息構建川楝子致肝毒性的“毒性成分–潛在靶點–核心通路”網(wǎng)絡圖，對該網(wǎng)絡進行拓撲學性質分析，篩選川楝子致肝毒性的核心成分及核心靶點。

1.8 分子對接

將待對接成分從PubChem 數(shù)據(jù)庫中下載結構的sdf 格式文件，通過Open Babel（https://openbabel.org）軟件將sdf 文件格式轉化為pdb 格式文件，采用AutoDock Tools 1.5.6 軟件對分子進行加氫和結構優(yōu)化，并輸出其格式為pdbqt 文件格式作為分子對接中的配體。從PDB（http://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫下載帶對接靶點3D 結構，對其結構進行預處理，去除水分子和配體殘基，采用AutoDock Tools 1.5.6軟件進行和加氫等操作，輸出其pdbqt 格式作為分子對接中的受體。將受體與配體的pdbqt 格式文件導入AutoDock Tools 1.5.6 軟件中獲得相應毒性口袋，設置Gridbox 做標及大小，運行AutoDock Vina腳本進行分子對接，得到其結合情況評估參數(shù)affinity 值，并通過開源軟件Pymol 對其對接結果進行可視化。

2 結果

2.1 川楝子的潛在毒性化合物的篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中共檢索到33 個川楝子活性化合物，按照OB≥30%和DL≥0.18 篩選后得到9 個活性化合物，見表1。通過CTD 數(shù)據(jù)庫和文獻搜索共搜集到6 個毒性化合物（通過篩選發(fā)現(xiàn)表1中的9 個活性成分均沒有肝毒性，因此，表2 中的6 個毒性成分均來自于文獻報告，并通過CTD 數(shù)據(jù)庫驗證），見表2。

表1 TCMSP 數(shù)據(jù)庫中川楝子的9 個活性成分Table 1 Nine active components of Toosendan Fructus in TCMSP database

表2 川楝子的毒性成分Table 2 Toxic components of Toosendan Fructus

2.2 川楝子“毒性成分–預測靶點”網(wǎng)絡的構建

川楝子的毒性成分預測出350 個作用靶點，將毒性成分、靶點導入軟件Cytoscape 3.8.2 版中，刪除未連線靶點，從而得到川楝子“毒性成分–預測靶點”網(wǎng)絡圖，見圖1。在該網(wǎng)絡圖中，共有263 個節(jié)點，686 條邊，其中圓形節(jié)點代表川楝子毒性成分的預測靶點，棱形節(jié)點代表川楝子的毒性成分，中間“V”節(jié)點代表川楝子。degree 值代表與該節(jié)點相連的邊的數(shù)量，在該網(wǎng)絡圖中，degree 值＞2 倍中位數(shù)的靶點中前10 位的靶點有花生四烯酸5-脂氧合酶（ALOX5）、羧酸脂酶2（CES2）、羥基類固醇11-β 脫氫酶1（HSD11B1）、雙微粒體2（MDM2）、脾酪氨酸激酶（SYK）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、大麻素受體1（CNR1）、大麻素受體2（CNR2）、磷酸二酯酶10A（PDE10A）。

圖1 川楝子“毒性成分–預測靶點”網(wǎng)絡Fig.1 “Toosendan Fructus toxic component-predictive target” network

2.3 川楝子致肝毒性“毒性成分–潛在作用靶點”網(wǎng)絡的構建

在GeneCards 中檢索到關于肝臟損傷的基因，并篩選出score 值≥中位數(shù)的靶點，得1 295 個肝臟損傷靶點，與川楝子毒性成分預測靶點取交集，得到103 個交集靶點，即為川楝子致肝毒性的潛在作用靶點，見圖2。

圖2 川楝子毒性成分預測靶點與肝臟損傷靶點交集Fig.2 Intersection of predicted targets of Toosendan Fructus toxicity components with liver injury targets

根據(jù)103 個川楝子肝毒性潛在作用靶點，將其導入軟件Cytoscape 3.8.2 版中構建得到川楝子“毒性成分–肝臟潛在作用靶點”網(wǎng)絡圖，見圖3。在該網(wǎng)絡圖中，共有110 個節(jié)點，包括103 個靶點和6 個毒性化合物，301 條邊，圖中棱形節(jié)點代表川楝子毒性成分，方形節(jié)點代表川楝子毒性成分致肝臟毒性潛在作用靶點。節(jié)點的degree 值代表與該節(jié)點相連的邊的數(shù)量，節(jié)點的大小與其degree值呈正比，該網(wǎng)絡中degree＞2 倍中位數(shù)即degree＞2 的靶點有CES2、HSD11B1、MDM2、SYK、MAPK14、髓樣細胞白血病蛋白1（MCL1）、表皮生長因子受體（EGFR）、磷脂酰肌醇激酶-3 催化亞單位α 基因（PIK3CA）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）。

圖3 川楝子“毒性成分–肝臟潛在作用靶點”網(wǎng)絡圖Fig.3 Network diagram of “toxic constituents-potential liver targets” of Toosendan Fructus

2.4 川楝子致肝臟毒性潛在作用靶點的PPI 網(wǎng)絡的構建

將篩選出的川楝子肝臟毒性103 個潛在作用靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫在線分析，將分析結果數(shù)據(jù)導入Cytocape 3.8.2 軟件中構建PPI 網(wǎng)絡，見圖4。該網(wǎng)絡中共有96 個節(jié)點，1 652 條邊，網(wǎng)絡中degree排名前10 位的靶點為熱休克蛋白90α 家族A 類成員1（HSP90AA1）、MAPK3、轉錄因子AP-1（JUN）、EGFR、MAPK1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）、PIK3CA、腫瘤壞死因子（TNF）、雌激素受體α（ESR1）、MAPK8，見表3。

圖4 川楝子致肝毒性潛在作用靶點PPI 網(wǎng)絡Fig.4 PPI network of potential targets of Toosendan Fructus hepatotoxicity

表3 PPI 網(wǎng)絡中毒性潛在作用靶點degree 值排名前10 位的靶點Table 3 Top 10 targets in the PPI network in terms of degree value for toxicity potential effect targets

2.5 川楝子致肝毒性潛在靶點的GO、KEGG 富集分析

川楝子致肝毒性的103 個潛在毒性靶點在GO富集分析（P＜0.05），其中生物功能（BP）共富集394 個條目，前20 個條目涉及凋亡過程的負調控、對激酶活性的正向調控、蛋白質磷酸化、基因表達的正向調節(jié)、MAPK 級聯(lián)的正調節(jié)、對MAP 激酶活性的正向調節(jié)等過程；細胞組分（CC）共富集60個條目，前20 個條目涉及受體復合體、胞質、核質體、漿膜、大分子復合體、內質網(wǎng)腔體等部位；分子功能（MF）共富集108 個條目，前20 個條目包括蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酸激酶活性、ATP 結合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、酶結合等功能，見圖5。川楝子致肝毒性的103 個潛在靶點在KEGG 富集中共富集到154 條信號通路，前20 條通路包括癌癥通路、前列腺癌通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抗性、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路、卡波西肉瘤相關的皰疹病毒感染、乙型肝炎、癌癥中的碳代謝、催乳素信號通路、白細胞介素-17（IL-17）信號傳導等通路，見圖5。

圖5 川楝子致肝毒性潛在作用靶點GO 和KEGG 分析Fig.5 GO and KEGG analysis of potential targets of Toosendan Fructus hepatotoxicity

2.6 川楝子致肝毒性“毒性成分–潛在作用靶點–核心通路”網(wǎng)絡的構建

以KEGG 富集分析中富集程度顯著的通路構建川楝子致肝毒性“毒性成分–潛在作用靶點–核心通路”網(wǎng)絡。該網(wǎng)絡中共有128 個節(jié)點，1 004 條邊，網(wǎng)絡中四邊形節(jié)點代表潛在作用靶點；圓形節(jié)點代表核心通路；棱形節(jié)點代表毒性成分，節(jié)點大小與其degree 值呈正比，見圖6。

圖6 川楝子致肝毒性“毒性成分–潛在作用靶點–核心通路”網(wǎng)絡Fig.6 Toosendan Fructus hepatotoxicity “toxic component-potential target-core pathway” network

在“毒性成分–潛在毒性作用靶點–核心通路”網(wǎng)絡中，毒性成分及degree 值見表4，網(wǎng)絡中靶點degree 值排列在前10 位的靶點為MAPK1、MAPK3、PIK3CA、MAP2K1、EGFR、MAPK14、MAPK8、mTOR、MAPK10、JUN，見表5。

表4 關鍵毒性成分Table 4 Key toxicological components

表5 關鍵靶點Table 5 Key targets

2.7 分子對接

將“毒性成分–潛在毒性靶點–核心通路”網(wǎng)絡中degree 值前5 位的靶點作為受體，得到受體靶點為MAPK1（degree＝21）、MAPK3（degree＝21）、PIK3CA（degree＝19）、MAPK8（degree＝18）、MAPK10（degree＝17），其PDB ID 分別是2y9q、4qtb、7jiu、2xrw、3oy1，并將與受體對應的毒性成分作為對接的配體，應用軟件AutoDock 1.5.6 版進行分子對接，對接信息見表6。其中PIK3CA 和MAPK8 均分別與2 個毒性成分進行對接，5 個受體與trichilinin D 對接，以分子對接結合能作為評價對接結果驗證的指標，在所有對接結果中，結合能均＜-1.5 kcal/mol（1 kcal＝4.2 kJ），表明關鍵毒性成分與關鍵靶點有較好的結合能力，可以在不需要外界能量的條件下進行對接。

表6 對接結合能Table 6 Docking binding energy

使用PyMOL 軟件對對接結果進行可視化示例，圖中主要顯示為小分子配體和于其相結合的受體結合位點氨基酸，均選用棍狀結構顯示，見圖7。

圖7 核心節(jié)點對接結果的可視化處理Fig.7 Visualization of core node docking results

3 討論

近年來，關于川楝子及其制劑肝毒性的文獻報道越來越多，在動物實驗、細胞實驗、以及不同的炮制工藝等實驗中均驗證了川楝子具有肝毒性。烏日漢等[15]通過設計劑量差異驗證了川楝子高劑量（2.571 4 g/kg）組導致小鼠肝臟的丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉移酶（AST）顯著升高，肝細胞發(fā)生明顯的水脹以及出現(xiàn)大小不同的水泡；中劑量組的甘油三酯（TG）顯著升高，個別肝細胞發(fā)生水脹、胞質疏松，提示川楝子具有一定的肝臟毒性且毒性作用存在一定的劑量相關性，隨劑量的增加而毒性增強。通過代謝組學驗證了川楝子肝毒性機制可能與ABC 轉運蛋白紊亂，氨基酸、嘌呤、嘧啶代謝有關[16]；劉偉等[17]和Yu 等[18]報道川楝子可能通過PI3K/Akt 信號、p53 信號和PTEN 信號3 種途徑介導肝細胞凋亡而引起肝毒性；齊雙巖等[19]報道川楝子的肝毒性機制可能與炎癥因子有關。川楝子因其存在的肝臟毒性作用，導致其臨床應用受到一定的限制。

本研究通過建立川楝子毒性成分–預測靶點、毒性成分–潛在作用靶點、蛋白質相互作用、生物功能和通路網(wǎng)絡、毒性成分–潛在毒性作用靶點–核心通路網(wǎng)絡以及分子對接技術探討川楝子的肝毒性機制。本次篩選共得到6 個毒性相關成分，川楝素（toosendanin）、meliasenin B、trichilinin D、1-O-tigloy-1-O-debenzoylohchinal、丁烯酸內酯（butenolide）、5-羥甲基糠醛（5-hydxoy methylfurfural）。其中，對川楝素的肝毒性機制研究已有較多文獻報道，目前已被報道的毒性機制包括（1）蛋白共價結合和修飾：Yu 等[12]的報道稱，川楝素在體內的代謝途徑主要是酯解和與氨基酸結合，川楝素被細胞色素P450 家族中的CYP3A4 酶激活后會生成順丁烯-1,4-雙環(huán)中間體，該中間體易與氨基酸中的氨基和谷胱甘肽發(fā)生加成反應，這可能是川楝素產(chǎn)生肝毒性的原因。（2）線粒體功能障礙：線粒體是合成能量物質ATP 的主要場所，ATP 在細胞的生長、繁殖、代謝過程中起著關鍵作用，Zhang等[20]的研究稱，川楝素通過使線粒體發(fā)生功能障礙，使線粒體膜電位和細胞內ATP 水平降低，以及激活caspase-8、9、3，進而誘導大鼠原代肝細胞死亡。（3）細胞凋亡：細胞凋亡是由絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的激活所介導發(fā)生的，有報道稱，MiRNAs 可能是反映川楝素致肝毒性的潛在毒理學標志物[17]。以此為依據(jù)，Zheng 等[21]分析川楝子水提物染毒小鼠外周血中的miRNAs 探討川楝子致肝毒性機制，分析表明，川楝子誘導的肝臟毒性可能與細胞凋亡、細胞周期紊亂和線立體功能障礙有關。（4）氧化應激：齊雙巖等[19]通過川楝子大鼠給藥與正常大鼠肝組織進行比較發(fā)現(xiàn)，川楝子給藥大鼠的肝組織中的超氧化物歧化酶（SOD）顯著下降，丙二醛（MDA）顯著上升，γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GT）顯著上升，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）顯著降低，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量升高，細胞間黏附分子-1（ICAM-1）陽性表達顯著增強，提示川楝子的肝毒性機制可能與氧化應激和炎癥反應有關。（5）溶酶體功能障礙：Luo 等[22]的研究報道稱，川楝素通過抑制TFEB 介導的溶酶體功能障礙抑制自噬通量可能是導致肝臟毒性的機制。近期Chang等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞壞死、脂質代謝問題和線粒體功能障礙是川楝素致肝毒性的主要因素。除川楝素外，對其他毒性成分的機制研究較少，彭雙清等[13]的研究報道稱丁烯酸內酯可能導致粒細胞增加，血漿蛋白減少而引發(fā)肝損傷。El Bohi 等[14]的研究發(fā)現(xiàn)5-hydxoy methylfurfural 不僅會產(chǎn)生遺傳毒性和細胞凋亡，還能抑制小鼠的抗氧化機制，從而改變肝臟的結構和功能。

關鍵靶點MAPK1、MAPK3、PIK3CA、MAPK8、MAPK10 涉及多條通路，其中MAPK1、MAPK3 和PIK3CA 均主要涉及PI3K/Akt 信號通路。PI3K/Akt信號通路可被細胞刺激或毒性損傷而激活，PI3K/Akt 通路與調控細胞生長增殖、細胞凋亡、代謝有關，PI3K 被激活后活化下游的Akt 磷酸化，進一步促進肝損傷[24-25]。MAPK3、MAPK1、MAPK8、MAPK10 均是MAPKs 家族的重要成員，在調控細胞生長、增殖、凋亡等生物過程中起著重要作用，倪佳等[26]通過克隆MAPK3 證明MAPK3 對肝、癌細胞的增殖、遷移以及侵襲具有促進作用。MAPK1與MAPK3 常共同組成MAPK1/3，研究表明，MAPK1/3 不僅與細胞的生理功能有關，還與細胞的生物過程（生長、增殖、分化、凋亡等）有關。MAPK8又稱JNK1，Li 等[27]研究稱，MAPK8（JNK1）在肝細胞癌中可以通過促進c-Myc 基因的表達和降低增值抑制因子p21 的表達來腫瘤的生長。MAPK10（JNK3）是多種生化信號的結合點，通過廣泛影響細胞過程而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，Li 等[27]的研究報道稱，MAPK10 的表達是肝癌病人生存的重要預后因素；Li 等[28]證實了Circ-0000515 通過降低MAPK10 的表達進而加重肝癌的惡性表達。PIK3CA 是PI3K 的α 亞基，是一種促癌基因[29]，近年來，研究發(fā)現(xiàn)PIK3CA 在肝癌、胃癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中發(fā)生突變，是目前發(fā)現(xiàn)的在促癌基因中發(fā)生突變頻率最高的基因之一[30]。提示川楝子中毒性化合物可能通過對PI3K/Akt 信號通路中相關靶蛋白的調控而引發(fā)肝毒性。

分子對接驗證選擇5 個關鍵靶蛋白分別于對應的潛在毒性化合物進行分子對接，結果顯示，川楝子潛在毒性成分川楝素、trichilinin D、1-O-tigloy-1-O-debenzoylohchinal 與MAPK1、MAPK3、PIK3CA、MAPK8、MAPK10 具有較好的結合能力，結合文獻對川楝子肝毒性和毒性成分的研究以及部分機制研究，提示網(wǎng)絡藥理學與分子對接預測川楝子致肝毒性的可靠性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突