趙曼彤，曹霞，林佳子，王曉，楊夢茹，梁藍(lán)元，岳義民，鐘璐陽，杜杰勇，余佳敏，周彤，李建華，沈?qū)W娟，王毅，舒尊鵬

廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

代謝相關(guān)脂肪性肝病是一種與胰島素抵抗（IR）和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，是排除酒精以外其他因素造成的肝臟彌漫性脂肪浸潤，包括單純性脂肪肝及脂肪性肝炎，其病理特征為肝細(xì)胞脂肪變與脂質(zhì)蓄積[1]。近年來，隨著我國人民生活水平的不斷提高，高糖、高脂的不良飲食以及習(xí)慣性長期久坐、缺乏運(yùn)動(dòng)的生活方式使人群患上代謝相關(guān)脂肪性肝病的風(fēng)險(xiǎn)提高[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近10 年代謝相關(guān)脂肪性肝病的患病率逐年提高，其在兒童中的患病率為8%～12%，在成人中的患病率為25%～48%。已成為中國經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)最常見的慢性肝病。代謝相關(guān)脂肪性肝病不僅會(huì)導(dǎo)致肝損傷，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致2 型糖尿病、心腦血管疾病等系列疾病的發(fā)生，嚴(yán)重威脅我國人民的健康安全[3-4]。由于其無特異性癥狀與體征的隱匿性，迄今為止代謝相關(guān)脂肪性肝病的發(fā)病機(jī)制仍存在爭議。目前，西醫(yī)臨床上治療代謝相關(guān)脂肪性肝病多采用調(diào)脂類藥物，但效果甚微[5]。我國傳統(tǒng)中醫(yī)理論中未有“代謝相關(guān)脂肪性肝病”之名，但根據(jù)臨床病因可歸屬于“肝癖”“脅痛”“黃疸”“積聚”等范疇[6]，其病機(jī)主要為過食肥甘厚膩之物，或情志不調(diào)，或久病體虛，致使體內(nèi)痰濕之邪大量聚集導(dǎo)致痰濕內(nèi)阻，阻礙脾氣上升，使脾失健運(yùn)，化脂膏痰濁于肝，并留積于肝臟，氣機(jī)阻滯于中焦，津液運(yùn)行受阻，氣滯血瘀，導(dǎo)致腎肝脾功能失調(diào)，最終誘發(fā)代謝相關(guān)脂肪性肝病[7-8]。由此可知代謝相關(guān)脂肪性肝病的病變部位雖主要在肝，但其治療關(guān)鍵在脾。

陳皮為蕓香科植物橘Citrus reticulataBlanco 及其栽培變種的干燥成熟果皮，其種類分為“陳皮”和“廣陳皮”[9]。廣陳皮為茶枝苷的栽培變種，以廣東新會(huì)（茶枝柑的主產(chǎn)地）所產(chǎn)的質(zhì)量為優(yōu)。陳皮含有豐富的黃酮、檸檬苦素、生物堿及揮發(fā)油等化合物[10]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，陳皮可用于咳嗽痰多、脾虛氣滯[11]?！侗静莘纸?jīng)》中記載“廣陳皮，辛、苦、溫。入脾、肺氣分，能散、能和、能燥、能瀉。利氣調(diào)中，消痰快膈，宣通五臟，統(tǒng)治百病”?！侗静莺分杏涊d：“橘皮，廣東新會(huì)皮為勝，陳久者良，理氣和中妙品”?！墩委懼改稀分杏涊d的“陳皮半夏湯”，《宋·太平惠民和劑局方》中記載的“二陳湯”，均以陳皮為主藥，發(fā)揮理氣健脾、燥濕化痰之效，為臨床常用于調(diào)理中樞氣機(jī)的要藥。結(jié)合已有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在治療代謝相關(guān)脂肪性肝病的各類藥物中，理氣中藥的使用頻次靠前；在中藥處方中，陳皮的使用頻率排名靠前[12-13]。由此可見，陳皮作為理氣類藥物對于代謝相關(guān)脂肪性肝病可能具有潛在的治療作用。

目前已有研究表明陳皮具有改善代謝相關(guān)脂肪性肝病的作用，但其發(fā)揮功效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與分子機(jī)制尚不明確[14]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一個(gè)多學(xué)科的研究領(lǐng)域，它將生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)與藥理學(xué)信息相整合，通過計(jì)算和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法來預(yù)測藥物在體內(nèi)可能的作用機(jī)制[15]。因此本實(shí)驗(yàn)利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，借助TCMSP、GeneCards等多個(gè)數(shù)據(jù)庫對陳皮理氣功效的活性化合物和潛在的蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，采用Cytoscape 構(gòu)建“化合物–靶點(diǎn)–通路”網(wǎng)絡(luò)，并利用分子對接技術(shù)驗(yàn)證陳皮中化合物與靶點(diǎn)的相互關(guān)系，探究陳皮理氣功效治療代謝相關(guān)脂肪性肝病的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 陳皮化合物、化合物潛在作用靶點(diǎn)、理氣功效靶點(diǎn)、代謝相關(guān)脂肪性肝病疾病靶點(diǎn)的搜集

以“陳皮”為檢索詞，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)（TCMSP，http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行全成分的檢索，通過PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫對陳皮現(xiàn)有靶點(diǎn)進(jìn)行收集，利用SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫對陳皮潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，將所得成分與化合物靶點(diǎn)進(jìn)行整合，得到藥物成分與化合物靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)集合。

以“regulatingqi”“non-alcoholic fatty liver disease”為關(guān)鍵詞，在GeneCards（http://www.Genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，將獲取的靶點(diǎn)結(jié)果進(jìn)行篩選匯總后去重，得到理氣功效與代謝相關(guān)脂肪性肝病疾病的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 陳皮–理氣映射靶點(diǎn)、陳皮–理氣–代謝相關(guān)脂肪性肝病映射靶點(diǎn)的獲取

將陳皮目標(biāo)化合物靶點(diǎn)集合與理氣靶點(diǎn)集合之后對二者進(jìn)行映射，得到和陳皮–理氣功效靶點(diǎn)；隨后將陳皮–理氣靶點(diǎn)與代謝相關(guān)脂肪性肝病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到陳皮–理氣–代謝相關(guān)脂肪性肝病關(guān)鍵靶點(diǎn)。利用JP Online 在線作圖工具，制作陳皮功效成分作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相交的Venn 圖。

1.3 陳皮理氣功效關(guān)鍵化合物的篩選

參考以下條件對陳皮理氣功效治療代謝相關(guān)脂肪性肝病的主要功效成分進(jìn)行篩選：（1）陳皮在《中國藥典》2020 年版中規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)志物；（2）通過CNKI 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫與Web of Science 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫檢索陳皮理氣功效與陳皮治療代謝相關(guān)脂肪性肝病的活性化合物，得到陳皮目前已經(jīng)被證明具有藥理活性或在藥物中含量較高的有效成分。

1.4 陳皮理氣功效治療代謝相關(guān)脂肪性肝病蛋白相互作用（PPI）的分析及網(wǎng)絡(luò)可視化的構(gòu)建

將56 個(gè)映射靶點(diǎn)輸入到STRING 數(shù)據(jù)庫中，選擇“multiple proteins”，置信度蛋白參數(shù)評分值＞0.4，去掉單一靶點(diǎn)進(jìn)行分析，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，并將數(shù)據(jù)結(jié)果以TSV 格式導(dǎo)出。將輸出數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 中，對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，并運(yùn)用“network analyzer”功能對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)的分析，根據(jù)degree 值排序?qū)?jié)點(diǎn)的顏色深淺與大小進(jìn)行調(diào)節(jié)，得到PPI 關(guān)系可視化網(wǎng)絡(luò)，挖掘網(wǎng)絡(luò)中的核心作用靶點(diǎn)。

1.5 潛在靶標(biāo)基因本體（GO）與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫是一個(gè)生物信息數(shù)據(jù)庫，為大規(guī)模的基因蛋白提供綜合的生物功能注釋信息，將1.2 項(xiàng)下所得到的藥物–疾病靶點(diǎn)輸入到DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行靶點(diǎn)通路分析，篩選P＜0.05 的通路作為分析的關(guān)鍵通路，并通過微生信在線作圖工具（http://www.bioinformatics.com.cn/）輸出GO、KEGG通路富集分析氣泡圖。

1.6 陳皮理氣功效的“化合物–靶點(diǎn)–通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

根據(jù)陳皮藥物主要活性成分，及其所調(diào)控的關(guān)鍵靶點(diǎn)和靶點(diǎn)所關(guān)聯(lián)的通路，利用Cytoscape 3.9.0構(gòu)建“化合物–靶點(diǎn)–通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.7 分子對接

分子對接能夠準(zhǔn)確預(yù)測已知結(jié)構(gòu)的小分子配體在合適蛋白配體的結(jié)合部位，并評估其結(jié)合模式和結(jié)合親和力，是新藥開發(fā)領(lǐng)域廣泛使用的計(jì)算工具[16]。本研究選擇的候選蛋白來于PPI 網(wǎng)絡(luò)中degree 值較高的靶點(diǎn)，并在RCSB-PDB 數(shù)據(jù)庫中選擇蛋白結(jié)構(gòu)；選擇對接的候選化合物為1.3 項(xiàng)下得到的關(guān)鍵化合物，其三維結(jié)構(gòu)來自Pubchem 數(shù)據(jù)庫。使用AutoDock Vina 將這些功效化合物與蛋白對接，對接結(jié)果被導(dǎo)入Pymol 進(jìn)行三維可視化。

2 結(jié)果

2.1 陳皮潛在作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)搜集情況

通過對 TCMSP、PubChem、SwissTarget Prediction 3大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜集與篩選共得到目標(biāo)化合物63 個(gè)，將其作為陳皮的候選成分，見表1。進(jìn)一步分析，陳皮中63 個(gè)候選成分共獲得了540 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。另外，通過對GeneCards 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝相關(guān)脂肪性肝病疾病靶點(diǎn)搜索，共得到580個(gè)與理氣相關(guān)的靶點(diǎn)信息，478 個(gè)與代謝相關(guān)脂肪性肝病相關(guān)的靶點(diǎn)信息。

表1 陳皮的活性成分Table 1 Active ingredients of t Citrus Reticulata

2.2 陳皮–理氣–代謝相關(guān)脂肪性肝病映射靶點(diǎn)分析

為了進(jìn)一步理解陳皮化合物成分與理氣靶點(diǎn)之間的復(fù)雜關(guān)系，將陳皮目標(biāo)化合物作用靶點(diǎn)與理氣靶點(diǎn)經(jīng)行映射，得到陳皮–理氣映射靶點(diǎn)共127個(gè)，包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt1）、酪氨酸激酶（SRC）、表皮生長因子受體（EGFR）、原癌基因c（JUN）等；具有理氣功效的藥效成分14 個(gè)，包括柚皮素（naringenin）、川陳皮素（nobiletin）、橘皮素（tangeretin）等，見圖1。將陳皮–理氣靶點(diǎn)與478 個(gè)代謝相關(guān)脂肪性肝病疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射得到56 個(gè)陳皮–理氣–代謝相關(guān)脂肪性肝病關(guān)鍵靶點(diǎn)，包括Akt1、VEGF、EGFR、JUN、雌激素受體α（ESR1）等，見圖2。為了更好地展示藥物作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)之間的邏輯聯(lián)系，本實(shí)驗(yàn)利用VP Online 在線作圖工具將陳皮藥物靶點(diǎn)、理氣功效靶點(diǎn)、代謝相關(guān)脂肪性肝病疾病靶點(diǎn)取交集，直觀展示各個(gè)集合之間的特征關(guān)系，見圖3。

圖1 陳皮–理氣藥效成分、映射靶點(diǎn)圖Fig.1 Citrus Reticulata -regulating qi pharmacological components,mapping targets

圖2 陳皮–理氣–代謝相關(guān)脂肪性肝病藥效成分、映射靶點(diǎn)圖Fig.2 Citrus Reticulata -regulating qi-metabolic associated fatty liver disease pharmacodynamic components,mapping targets

圖3 陳皮–理氣–代謝相關(guān)脂肪性肝病交集靶點(diǎn)Venn 圖Fig.3 Citrus Reticulata-regulating qi-metabolic associated fatty liver disease intersecting target Venn diagram

2.3 陳皮理氣功效關(guān)鍵化合物的篩選

通過《中國藥典》2020 年版和以發(fā)表文獻(xiàn)[17-18]中被證實(shí)陳皮理氣功效與治療代謝相關(guān)脂肪性肝病的藥效成分，對14 個(gè)候選成分進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)陳皮發(fā)揮理氣功效治療代謝相關(guān)脂肪性肝病的有效成分主要為黃酮類物質(zhì)，其中陳皮發(fā)揮理氣功效的化合物為多甲氧基黃酮類物質(zhì)（包括川陳皮素、二氫川陳皮素、橘皮素）和二氫黃酮類（包括橙皮苷、柚皮素、柚皮苷）[18]，在具有理氣功效的化合物中可治療代謝相關(guān)脂肪性肝病的藥效物質(zhì)為川陳皮素、橘皮素、橙皮苷、柚皮苷、柚皮素。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

將STRING 數(shù)據(jù)庫中得到的陳皮理氣功效治療代謝相關(guān)脂肪性肝病靶點(diǎn)的degree 值（表2）。按照degree 值大小進(jìn)行排序，degree 值高的靶點(diǎn)有Akt1、EGFR、白蛋白（ALB）、JUN、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）等，可以認(rèn)為這些靶點(diǎn)在陳皮理氣功效治療代謝相關(guān)脂肪性肝病中起到主要的作用，并在Cytoscape 軟件中建立PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖4。

圖4 陳皮理氣功效治療代謝相關(guān)脂肪性肝病PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 PPI interaction network of Citrus Reticulata in treatment of metabolic associated fatty liver disease by regulating qi

表2 陳皮理氣功效治療代謝相關(guān)脂肪性肝病核心網(wǎng)絡(luò)潛在靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)分析Table 2 Analysis of potential target topology parameters of the core network of Citrus Reticulata in treatment of metabolic associated fatty liver disease by regulating qi

2.5 通路富集分析結(jié)果

在DAVID 數(shù)據(jù)庫中將陳皮理氣功效治療非酒精性的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG、GO 通路富集分析。以P＜0.05 為篩選條件，GO 分析可通過富集得到蛋白靶點(diǎn)作用的生物過程（BP），分析結(jié)果提示陳皮發(fā)揮理氣功效治療代謝相關(guān)脂肪性肝病的BP 顯著富集在細(xì)胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄、葡萄糖穩(wěn)態(tài)等225 個(gè)BP 中，GO 富集氣泡圖如圖5 所示。以P＜0.05 為篩選條件，得到關(guān)鍵的信號通路圖如圖6 所示，KEGG 富集分析表示，許多靶基因與細(xì)胞增殖凋亡通路，如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 信號通路、Ras 信號通路；免疫炎癥相關(guān)通路，如Toll樣受體信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路；胰島素抵抗通路和代謝相關(guān)脂肪性肝病信號通路密切相關(guān)。

圖5 陳皮理氣功效治療代謝相關(guān)脂肪性肝病的GO 富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble plot of GO enrichment analysis of Citrus Reticulata in treatment of metabolic associated fatty liver disease by regulating qi

圖6 陳皮理氣功效治療代謝相關(guān)脂肪性肝病的KEGG 通路富集分析氣泡圖Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis bubble plots of Citrus Reticulata for metabolic associated fatty liver disease by regulating qi

2.6 “化合物–靶點(diǎn)–通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將5 個(gè)候選成分、56 個(gè)映射靶點(diǎn)與關(guān)鍵通路在Cytoscape 軟件中建立“化合物–靶點(diǎn)–通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖7。其中川陳皮素、柚皮素、橙皮苷、柚皮苷、橘皮素為陳皮發(fā)揮理氣功效治療代謝相關(guān)脂肪性肝病的關(guān)鍵成分，Akt1、EGFR、ESR1、PPARγ，PPARα、JUN、VEGFA 為陳皮發(fā)揮理氣功效治療代謝相關(guān)脂肪性肝病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖7 陳皮理氣功效治療代謝相關(guān)脂肪性肝病“化合物–靶點(diǎn)–通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 “Compound– target-pathway” network diagram of Citrus Reticulata in treatment of metabolic associated fatty liver disease by regulating qi

2.7 分子對接驗(yàn)證

將PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選的degree 值較大關(guān)鍵靶點(diǎn)與藥物中對應(yīng)的活性成分進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，從PDB 數(shù)據(jù)庫獲得所需文件：Akt1（PDB ID：6CCY）、PPARγ（PDB ID：2ATH）、PPARα（PDB ID：3VI8）、EGFR（PDB ID：3IKA）、JUN（2P33），所有受體文件均做刪除有機(jī)物、水分子及加氫分配電荷處理。柚皮素、柚皮苷、川陳皮素的三維結(jié)構(gòu)來自PubChem。使用Pymol 對對接結(jié)果進(jìn)行三維可視化處理?！鞍悬c(diǎn)蛋白–活性分子”繪制成對接模式圖，見圖8。結(jié)果表明，柚皮素、川陳皮素等活性成分與Akt1、JUN 等關(guān)鍵靶點(diǎn)之間有很好的親和力，可通過作用于相關(guān)靶點(diǎn)治療或改善代謝相關(guān)脂肪性肝病。

圖8 分子對接結(jié)果圖Fig.8 Plot of molecular docking results

3 討論

代謝相關(guān)脂肪性肝病是指除酒精和其他明確的損肝因素外所致的代謝綜合征，其發(fā)病機(jī)制尚待研究，目前“二次打擊”學(xué)說所引申出的“多重打擊”學(xué)說為代謝相關(guān)脂肪性肝病病機(jī)提供了更為精準(zhǔn)的解釋。大量文獻(xiàn)報(bào)道表明在代謝相關(guān)脂肪性肝病研究早期，IR 所導(dǎo)致的肝脂肪變性，造成了肝內(nèi)脂肪酸聚集即第一次打擊；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化等作用下，引發(fā)了一系列的肝細(xì)胞損傷、壞死、炎癥、纖維化即第二次打擊；隨著相關(guān)研究的深入，目前出現(xiàn)的“多重打擊”學(xué)說包含脂毒性、線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、脂肪組織功能障礙、炎性細(xì)胞因子等多重打擊因素，為代謝相關(guān)脂肪性肝病的病機(jī)提供了新的解釋[19]。目前臨床中多采用保肝、調(diào)脂等治療手段，但其效果甚微，因此，尋找新藥物治療代謝相關(guān)脂肪性肝病疾病迫在眉睫?，F(xiàn)已有研究表明，陳皮可以明顯針對此種疾病，但其潛在的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制還有待研究[14]。

根據(jù)記載，傳統(tǒng)中醫(yī)古籍中并無代謝相關(guān)脂肪性肝病，總結(jié)多數(shù)醫(yī)家經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為脾虛、痰濕為非酒精性脂肪肝最為常見的證型特點(diǎn)[20]。基于此特點(diǎn)，治療時(shí)要始終抓住疏肝健脾、化痰利濕這2 大原則。陳皮作為理氣類良藥，其味苦“能燥脾家之濕證”，具有理氣健脾、燥濕化痰功效，適用于各種因素所致的脾胃氣滯證。姜萍等[21]發(fā)現(xiàn)陳皮等理氣類藥物可降低高脂誘導(dǎo)的大鼠模型脂肪勻漿中TNF-α 水平，抑制代謝相關(guān)脂肪性肝病大鼠肝臟炎癥，還證明了“脾不升清”是肥胖產(chǎn)生及發(fā)展的病機(jī)關(guān)鍵之一，說明陳皮可發(fā)揮健脾理氣的功效，干預(yù)肥胖所引發(fā)的代謝綜合征疾病。二陳湯在中藥古籍中具有理氣健脾、燥濕化痰之功效，其主治濕痰、咳嗽痰多等癥狀，近年來臨床中采用二陳湯治療代謝相關(guān)脂肪性肝病，且療效顯著。石磊等[22]發(fā)現(xiàn)二陳湯中的陳皮具有降低高脂飲食小鼠肝臟氧化應(yīng)激的作用，減緩代謝相關(guān)脂肪性肝病病情的發(fā)展。但由于陳皮中所含化學(xué)成分復(fù)雜，調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)眾多，導(dǎo)致其發(fā)揮理氣功效治療代謝相關(guān)脂肪性肝病的作用機(jī)制尚不明確。故本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接方法探究陳皮潛在的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及可能的作用通路，應(yīng)用大數(shù)據(jù)挖掘的手段，從系統(tǒng)性、整體性和相關(guān)性探討陳皮理氣功效對代謝相關(guān)脂肪性肝病的改善作用，為陳皮的臨床應(yīng)用及功效開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

在陳皮藥效物質(zhì)的研究中，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)收集并預(yù)篩選了陳皮的化學(xué)成分，共篩選出柚皮素、橙皮苷、柚皮苷、橘皮素、川陳皮素、二氫川陳皮素等63 個(gè)主要活性化合物。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，在上述成分中，橙皮苷對代謝相關(guān)脂肪性肝病大鼠肝臟有明顯的保護(hù)作用，其可減少肝細(xì)胞脂肪變性，抑制匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤，減輕肝損傷程度[23]。另有王焱等[24]發(fā)現(xiàn)橙皮苷能降低代謝相關(guān)脂肪性肝病大鼠血清中TNF-α、白細(xì)胞介素（IL）-6 等炎癥因子的水平，同時(shí)提高IL-10 抗炎因子的水平，發(fā)揮改善代謝相關(guān)脂肪性肝病大鼠肝細(xì)胞的損傷作用。汪嬌等[25]通過建立代謝相關(guān)脂肪性肝病細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)川陳皮素具有改善代謝相關(guān)脂肪性肝病脂肪功能障礙作用，其分子機(jī)制主要是川陳皮素通過抑制肝臟中l(wèi)ncLSTR 上調(diào)，降低肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，增加肝臟甘油三酯清除率。柚皮苷是發(fā)揮止咳化痰理氣作用的主要功效成分，柚皮素為其代謝產(chǎn)物,具有抗炎、抗氧化等特性[26]。此外，文獻(xiàn)還報(bào)道了橘皮素可增加核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）的核轉(zhuǎn)位，上調(diào)其下游因子血紅素加氧酶-1（HO-1）、谷氨酸半胱氨酸連接酶亞基（GCLC）的表達(dá)，降低肝臟中的氧化應(yīng)激，進(jìn)而緩解代謝相關(guān)脂肪性肝病[27]。柚皮素可減少脂肪的從頭合成，增加脂肪酸氧化并改善代謝紊亂，減少代謝相關(guān)脂肪性肝病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[28]。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測及上述文獻(xiàn)報(bào)道的共同論證，本研究最終確定柚皮素、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素可能為陳皮利用理氣功效治療代謝相關(guān)脂肪性肝病的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

基于上述陳皮利用理氣功效抗代謝相關(guān)脂肪性肝病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究后，對代謝相關(guān)脂肪性肝病的核心靶點(diǎn)和信號通路進(jìn)行篩選與富集，得到相關(guān)蛋白靶點(diǎn)56 個(gè)，通過PPI 網(wǎng)絡(luò)互作分析發(fā)現(xiàn)，Akt1、EGFR、PPARα、PPARγ、c-JUN 為陳皮通過理氣功效發(fā)揮抗代謝相關(guān)脂肪性肝病核心網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。根據(jù)相關(guān)研究表明，Akt1 可作為多條信號通路的交叉點(diǎn)，通過影響下游多種因子的活化，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和糖代謝過程[29]。Xie 等[30]發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可以通過Akt1/叉頭框蛋白O1（FoxO1）信號通路，抑制FoxO1 的表達(dá)，從而改善代謝相關(guān)脂肪性肝病。另有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是肝臟炎癥和代謝性肝病發(fā)病機(jī)制的重要過程，c-Jun 能夠保護(hù)肝細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞存活[31]。Yan等[32]發(fā)現(xiàn)JNK/c-Jun 能夠直接結(jié)合先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（C7ORF41）的啟動(dòng)子，抑制C7ORF41的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而保護(hù)棕櫚酸誘導(dǎo)的代謝相關(guān)脂肪性肝病小鼠的肝臟炎癥。EGFR 屬于ErbB 受體酪氨酸激酶家族，其通過調(diào)控脂肪酸合成和脂肪分解的轉(zhuǎn)錄因子，在代謝相關(guān)脂肪性肝病小鼠模型的脂肪變性中發(fā)揮了重要作用[33]。PPARα 和PPARγ 是過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）核受體超家族中的2 種亞型，在調(diào)節(jié)炎癥和脂質(zhì)等方面發(fā)揮作用。PPARα 能夠促進(jìn)脂肪酸氧化、調(diào)節(jié)炎癥、改善胰島素敏感性。PPARγ 能夠調(diào)節(jié)脂肪組織的增殖與分化，減少肝細(xì)胞的脂肪生成；同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ 的激動(dòng)劑，能夠抑制TNF-α、纖溶酶原激活物抑制因子-1（PAI-1）、IL-6 等炎癥因子的表達(dá)，間接減少炎癥狀態(tài)下炎癥產(chǎn)物的生成，從而改善代謝相關(guān)脂肪性肝病[34]。Goldwasser 等[35]證明柚皮素是PPARα 和PPARγ 的激動(dòng)劑，其可誘導(dǎo)PPARγ 調(diào)節(jié)脂肪酸氧化基因（CYP4A11、ACOX），增加脂肪酸的氧化，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)代謝相關(guān)脂肪性肝病的癥狀?；谏鲜鑫墨I(xiàn)報(bào)道，Akt1、EGFR、PPARα、PPARγ、c-JUN 等關(guān)鍵蛋白參與生物學(xué)過程中多個(gè)重要環(huán)節(jié)，因此認(rèn)為這5 種關(guān)鍵蛋白可能為代謝相關(guān)脂肪性肝病發(fā)病機(jī)制中重要調(diào)節(jié)因子。

基于上述關(guān)鍵靶點(diǎn)的預(yù)測，進(jìn)行了KEGG 通路富集分析。結(jié)果表明，許多關(guān)鍵靶點(diǎn)與PI3K/Akt 信號通路、Ras 信號通路、胰島素信號通路、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路、核因子-κB（NFκB）信號通路等密切相關(guān)。其中PI3K/Akt 信號通路和AMPK 信號通路為胰島素信號傳導(dǎo)與胰島素抵抗相關(guān)的關(guān)鍵途徑，在代謝相關(guān)脂肪性肝病中發(fā)揮重要作用。胰島素通過與胰島素受體（InsR）結(jié)合，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)胰島素受體底物IRS 家族的磷酸化，磷酸化的IRS 與PI3K 的p85 調(diào)節(jié)亞基的結(jié)合，導(dǎo)致其下游的信號分子Akt 磷酸化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種活動(dòng)[36]。此外胰島素除了活化Akt 以促進(jìn)脂肪形成外，還可激活A(yù)MPK 促進(jìn)脂肪酸的合成，而激活后的AMPK 又可以間接抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1）以改善胰島素抵抗，進(jìn)而改善代謝相關(guān)脂肪性肝病[37-38]。彭慧敏[39]研究發(fā)現(xiàn)，川陳皮素能夠活化AMPK 信號通路，降低3T3-L1 細(xì)胞中脂質(zhì)的積累。理氣消癭方中主要的藥物為陳皮，此方具有理氣健脾、燥濕化痰的功效，田曼等[40]發(fā)現(xiàn)，理氣消癭方可抑制PI3K/Akt 信號通路激活，調(diào)控甲狀腺腫大鼠模型的細(xì)胞凋亡/增殖，發(fā)揮理氣功效對病癥起到治療效果。陳袁等[41]發(fā)現(xiàn)，川陳皮素通過抑制PI3K/Akt 通路的激活，促進(jìn)代謝相關(guān)脂肪性肝病大鼠機(jī)體肝細(xì)胞自噬，減輕肝細(xì)胞脂肪變性，改善代謝相關(guān)脂肪性肝病的癥狀。由此推測，陳皮中的川陳皮素，可通過抑制PI3K/Akt 通路的激活，發(fā)揮理氣化痰的功效，促進(jìn)代謝相關(guān)脂肪性肝病患者肝細(xì)胞的凋亡/增殖，達(dá)到改善代謝相關(guān)脂肪性肝病的目的。Bhattacharya 等[42]揭示了，柚皮素通過上調(diào)Akt1 蛋白，促進(jìn)胰島素信號通路的表達(dá)，增強(qiáng)INS-1E 細(xì)胞中胰島素分泌和葡萄糖敏感性，恢復(fù)胰島β細(xì)胞中與脂毒性相關(guān)基因的調(diào)控，減輕代謝相關(guān)脂肪性肝病的脂毒性。Yang 等[43]發(fā)現(xiàn)柚皮素通過EGFR/PI3K/Akt 信號通路，下調(diào)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，抑制NF-κB 的活性，減少氣道炎癥過程中黏液的生成，發(fā)揮化痰理氣作用。由此推測，柚皮素可通過抑制EGFR 表達(dá)，影響PI3K/Akt 信號通路，發(fā)揮理氣作用；同時(shí)上調(diào)Akt1 蛋白表達(dá)，促進(jìn)胰島素信號通路的傳導(dǎo)，減輕代謝相關(guān)脂肪性肝病的脂毒性?；谏鲜鲇懻?，推測PI3K/Akt 信號通路、Ras信號通路、胰島素信號通路、AMPK 信號通路、NFκB 信號通路與陳皮發(fā)揮理氣功效治療代謝相關(guān)脂肪性肝病密切相關(guān)。

綜上所述，陳皮中的橘皮素、柚皮苷、柚皮素、川陳皮素、橙皮苷可能為其發(fā)揮理氣功效的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，其通過調(diào)節(jié)Akt1、PPARγ、JUN、ESR1、PPARα 等蛋白靶點(diǎn)，調(diào)控PI3K-Akt 信號通路、Ras信號通路、胰島素信號通路、AMPK 信號通路、NFκB 信號通路等信號通路，發(fā)揮理氣功效改善代謝相關(guān)脂肪性肝病的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突