王艷青，張?chǎng)雾?/p>

河北生殖婦產(chǎn)醫(yī)院 麻醉科，河北 石家莊 050000

子宮內(nèi)膜癌是常見的女性生殖惡性腫瘤，起源于子宮內(nèi)膜上皮，具有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。盡管大多數(shù)子宮內(nèi)膜癌患者通過手術(shù)、放療、化療和激素等綜合治療得到有效控制，但晚期或轉(zhuǎn)移性子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后仍然很差。因此，對(duì)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制進(jìn)行深入探索，有助于早期預(yù)防、診斷和治療該疾病。右美托咪定是一種α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，臨床上主要用作鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛劑。右美托咪定在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡中起重要作用，能抑制食管癌[2]、胃癌[3]細(xì)胞的增殖。因此，猜測(cè)右美托咪定在子宮內(nèi)膜癌的增殖、凋亡中發(fā)揮作用。Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）通路在細(xì)胞分化、增殖、存活和遷移等多種生物過程中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在癌癥中也起重要作用，與婦科惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在子宮內(nèi)膜癌中激活Wnt/β-catenin 途徑能促進(jìn)其細(xì)胞增殖、遷移、侵襲[4]。此外，右美托咪定已被證實(shí)可通過抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制卵巢癌生長(zhǎng)[5]。而右美托咪定能否通過調(diào)節(jié) Wnt/βcatenin 信號(hào)通路影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、凋亡尚不清楚，本研究對(duì)此進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與動(dòng)物

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系：Ishikawa、RL95-2 購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

雌性BALB/c 裸鼠，體質(zhì)量16～18 g，4～6 周齡，購(gòu)自武漢貝賽模式生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（鄂）2022－0029，實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)單位為河北生殖婦產(chǎn)醫(yī)院（倫理批號(hào)202204X-009）。

1.2 主要試劑與儀器

鹽酸右美托咪定氯化鈉注射液（批號(hào)20210623，規(guī)格20 mL，四川國(guó)瑞藥業(yè)有限責(zé)任公司）；胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)基（貨號(hào)15400054、16140089、10569010，美國(guó)Gibco公司）；Wnt/β-catenin 通路激活劑-氯化鋰（LiCl，貨號(hào)BLL-Ry12317，上海佰利萊生物科技公司）；CCK-8 檢測(cè)試劑盒、AnnexinV-FITC/PI 檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)C0037、C1062M，上海碧云天公司）；5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）試劑盒（貨號(hào)IE2300，北京索萊寶公司）；一抗增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 蛋白（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、c-Myc 基因（c-Myc）、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、Ki-67 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（貨號(hào)ab92552、ab32124、ab243140、ab246504、ab185656、ab134175、ab231172、ab8245，美國(guó)Abcam 公司）；二抗山羊抗兔IgG-HRP（貨號(hào)sc-2748，美國(guó)Santa 公司）。

FACSCanto II 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；Axio Observer A1 光學(xué)倒置顯微鏡（德國(guó)Zeiss 公司）；1658033 蛋白電泳儀（美國(guó)Bio-rad 公司）；DNM-9602 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（上海巴玖公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將Ishikawa、RL95-2 細(xì)胞在添加10% PBS 的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞復(fù)蘇至80%時(shí)，胰蛋白酶消化傳代，2～3 d 傳代1 次。將細(xì)胞分為對(duì)照組，右美托咪定1、10、100 nmol/L 組，以及右美托咪定＋LiCl 組。其中右美托咪定1、10、100 nmol/L 組細(xì)胞參照文獻(xiàn)報(bào)道[5]，分別選用1、10、100 nmol/L 右美托咪定進(jìn)行培養(yǎng)；右美托咪定＋LiCl 組細(xì)胞用100 nmol/L 右美托咪定和10 mmol/L LiCl[6]培養(yǎng)。

1.3.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性 將各組細(xì)胞加入96 孔板中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，每組3個(gè)重復(fù)，每孔加入10% CCK-8 溶液（10 μL）在37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀于450 nm 處測(cè)量吸光度（A）值。

1.3.3 EdU 檢測(cè)細(xì)胞增殖 將各組細(xì)胞加入96 孔板中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后按照EdU染色試劑盒進(jìn)行操作，并用DAPI 核染，觀察EdU陽性細(xì)胞率。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將各組細(xì)胞加入6 孔板中，每孔1×107個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)12 h，按照AnnexinV-FITC/PI 細(xì)胞凋亡雙染試劑盒說明書逐步進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3.5 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲取各組細(xì)胞懸浮液100 μL（1×105個(gè)/mL）接種于Transwell 小室上室，其中侵襲實(shí)驗(yàn)Transwell 小室涂有基質(zhì)膠，遷移實(shí)驗(yàn)Transwell 小室未涂基質(zhì)膠，下室加入含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)24 h。棄去上室培養(yǎng)基，擦去上室細(xì)胞后，PBS 洗滌、固定染色，顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3.6 Western blotting 檢測(cè)蛋白表達(dá) 將各組細(xì)胞破碎后提取總蛋白，定量后按步驟將蛋白SDSPAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，在4 ℃下加入一抗PCNA、Bcl-2、Bax、β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、GAPDH 過夜孵育，清洗，在4 ℃下加入二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000），孵育2 h。用ECL發(fā)光顯影，觀察拍照，各條帶灰度值用Image J 軟件處理分析。

1.3.7 體內(nèi)腫瘤形成實(shí)驗(yàn) 將24 只BALB/c 裸鼠用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，在右腋下注射1×105個(gè)（200 μL）Ishikawa 細(xì)胞構(gòu)建子宮內(nèi)膜癌裸鼠模型，根據(jù)成瘤情況將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、右美托咪定組、右美托咪定＋LiCl 組，每組8 只。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100 mm3時(shí)[7]開始給藥，右美托咪定組ip 5.0 μg/kg 右美托咪定[8]，右美托咪定＋LiCl組ip 5.0 μg/kg 右美托咪定和20 mmol/kg LiCl[9]，對(duì)照組給予相同劑量的生理鹽水，1 次/d，連續(xù)21 d。處死小鼠分離腫瘤，測(cè)量腫瘤質(zhì)量與體積。

1.3.8 蘇木精–伊紅（HE）染色和免疫組化法觀察移植瘤組織 取裸鼠瘤組織，固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切片（5 μm）后用HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。另取裸鼠瘤組織石蠟切片，封閉和透化后，使用抗Ki-67、β-catenin（1∶1 000）抗體孵育過夜，與二抗（1∶1 000）在37 ℃下孵育1 h。洗滌完成后，DAB 顯色，封片觀察，使用Imagepro Plus 6.0 分析Ki-67、β-catenin 陽性細(xì)胞率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

與對(duì)照組相比，右美托咪定1、10、100 nmol/L組Ishikawa、RL95-2 細(xì)胞A值、EdU 陽性細(xì)胞率顯著降低（P＜0.05），說明右美托咪定可以抑制Ishikawa、RL95-2 細(xì)胞的增殖；與右美托咪定100 nmol/L 組相比，右美托咪定＋LiCl 組細(xì)胞A值、EdU 陽性細(xì)胞率顯著升高（P＜0.05），見圖1、2 和表1。

表1 各組細(xì)胞增殖活力和EdU 陽性細(xì)胞率變化（，n=6）Table 1 Changes in cell proliferation activity and EdU positive cell rate in each group (,n=6)

表1 各組細(xì)胞增殖活力和EdU 陽性細(xì)胞率變化（，n=6）Table 1 Changes in cell proliferation activity and EdU positive cell rate in each group (,n=6)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與右美托咪定100 nmol?L-1組比較：#P＜0.05*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs dexmedetomidine 100 nmol?L-1 group

圖1 EdU 檢測(cè)各組Ishikawa 細(xì)胞增殖情況（×200）Fig.1 EdU detection of Ishikawa cell proliferation in each group (×200)

圖2 EdU 檢測(cè)各組RL95-2 細(xì)胞增殖情況（×200）Fig.2 EdU detection of RL95-2 cell proliferation in each group (×200)

2.2 右美托咪定對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，右美托咪定1、10、100 nmol/L組Ishikawa、RL95-2 細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與右美托咪定100 nmol/L 組相比，右美托咪定＋LiCl 組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），見圖3、表2。

表2 各組細(xì)胞凋亡情況（，n=6）Table 2 Cell apoptosis in each group (,n=6)

表2 各組細(xì)胞凋亡情況（，n=6）Table 2 Cell apoptosis in each group (,n=6)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與右美托咪定100 nmol?L-1組比較：#P＜0.05*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs dexmedetomidine 100 nmol?L-1 group

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡Fig.3 Detection of cell apoptosis by flow cytometry

2.3 右美托咪定對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

與對(duì)照組相比，右美托咪定1、10、100 nmol/L組Ishikawa、RL95-2 細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與右美托咪定100 nmol/L 組相比，右美托咪定＋LiCl 組細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著升高（P＜0.05），見圖4、表3。

表3 各組細(xì)胞遷移和侵襲情況比較（，n=6）Table 3 Comparison of cell migration and invasion in each group (,n=6)

表3 各組細(xì)胞遷移和侵襲情況比較（，n=6）Table 3 Comparison of cell migration and invasion in each group (,n=6)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與右美托咪定100 nmol?L-1組比較：#P＜0.05*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs dexmedetomidine 100 nmol?L-1 group

2.4 右美托咪定對(duì)細(xì)胞Wnt/β-catenin 通路蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，右美托咪定1、10、100 nmol/L組Ishikawa、RL95-2 細(xì)胞PCNA、Bcl-2、β-catenin、c-Myc、Cyclin D1 蛋白表達(dá)下降，Bax 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與右美托咪定100 nmol/L 組相比，右美托咪定＋LiCl 組PCNA、Bcl-2、β-catenin、c-Myc、Cyclin D1 蛋白表達(dá)上升，Bax 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見圖5、表4。

表4 各組Wnt/β-catenin 通路蛋白相對(duì)表達(dá)量（，n=6）Table 4 Relative protein expression of Wnt/β-catenin pathway proteins in each group (,n=6)

表4 各組Wnt/β-catenin 通路蛋白相對(duì)表達(dá)量（，n=6）Table 4 Relative protein expression of Wnt/β-catenin pathway proteins in each group (,n=6)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與右美托咪定100 nmol?L-1組比較：#P＜0.05*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs dexmedetomidine 100 nmol?L-1 group

圖5 各組Wnt/β-catenin 通路蛋白變化Fig.5 Changes of Wnt/β-catenin pathway proteins in each group

2.5 右美托咪定對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

與對(duì)照組比較，右美托咪定組移植瘤質(zhì)量和體積、β-catenin、Ki-67 陽性表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與右美托咪定組比較，右美托咪定＋LiCl 組移植瘤質(zhì)量和體積、β-catenin、Ki-67 陽性表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）。HE 染色結(jié)果顯示，右美托咪定組相比于對(duì)照組腫瘤組織明顯凋亡，右美托咪定＋LiCl 組腫瘤組織凋亡被逆轉(zhuǎn)，見圖6、7 和表5。

表5 右美托咪定對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)和β-catenin、Ki-67 蛋白表達(dá)的影響（，n=8）Table 5 Effect of dexmedetomidine on the growth and expression of β-catenin and Ki-67 proteins in nude mouse transplanted tumors (,n=8)

表5 右美托咪定對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)和β-catenin、Ki-67 蛋白表達(dá)的影響（，n=8）Table 5 Effect of dexmedetomidine on the growth and expression of β-catenin and Ki-67 proteins in nude mouse transplanted tumors (,n=8)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與右美托咪定組比較：#P＜0.05*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs dexmedetomidine group

圖6 各組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況（n=8）Fig.6 Growth of transplanted tumors in nude mice in each group (n=8)

圖7 腫瘤組織HE 染色和β-catenin、Ki-67 蛋白表達(dá)（×200）Fig.7 HE staining and expression of β-catenin and Ki-67 proteins in tumor tissue (×200)

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是最常見的子宮惡性腫瘤，主要癥狀為子宮異常出血、陰道分泌異常、下腹部疼痛和腫塊發(fā)生，其發(fā)病率逐年上升，且有年輕化趨勢(shì)。目前，子宮內(nèi)膜癌的主要治療方法仍然是手術(shù)和化放療，但其存在肝腎毒性、胃腸道毒性、骨髓抑制、月經(jīng)不調(diào)等嚴(yán)重不良反應(yīng)，部分患者還存在復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，影響患者預(yù)后[10]。因此，探索子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制和新療法具有重要意義。

右美托咪定是臨床手術(shù)中經(jīng)常使用的鎮(zhèn)痛藥，可顯著減少術(shù)中和術(shù)后對(duì)阿片類藥物的需求。目前研究表明，右美托咪定調(diào)節(jié)免疫功能，減少圍手術(shù)期手術(shù)患者的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制癌癥進(jìn)展[11]。已有研究表明，右美托咪定以濃度相關(guān)性方式有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)其凋亡[12]；右美托咪定還能抑制食管癌細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡降低其侵襲和遷移能力[13]。右美托咪定對(duì)婦科相關(guān)腫瘤也具有調(diào)節(jié)作用，如Tian 等[8]發(fā)現(xiàn)右美托咪定可提高卵巢癌大鼠的免疫功能，抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定能顯著降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的A值、EdU 陽性細(xì)胞率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)，提升凋亡率，提示右美托咪定能抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖活性、遷移和侵襲能力，促進(jìn)其凋亡，參與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。這與楊利利等[14]發(fā)現(xiàn)右美托咪定可增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的順鉑敏感性，抑制其凋亡，結(jié)果相似。提示右美托咪定對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、凋亡具有調(diào)節(jié)作用。

細(xì)胞增殖凋亡是影響多種癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵因素，在一定程度上決定惡性細(xì)胞的命運(yùn)。其中PCNA主要是反映細(xì)胞增殖水平的標(biāo)志物[15]；Bcl-2 家族蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Bax 是Bcl-2 家族的重要成員，Bcl-2 下調(diào)和Bax 上調(diào)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。本研究中，右美托咪定抑制PCNA、Bcl-2 蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bax 表達(dá)，進(jìn)一步說明右美托咪定具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制增殖的作用。此外，在裸鼠實(shí)驗(yàn)中，右美托咪定能抑制移植瘤的生長(zhǎng)，降低腫瘤細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67 的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證右美托咪定能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)凋亡。

Wnt 信號(hào)通路是一種高度保守的通路，控制著胚胎發(fā)育、組織生長(zhǎng)和細(xì)胞命運(yùn)等關(guān)鍵生物過程，β-catenin 是Wnt/β-catenin 途徑中關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。該通路在激活狀態(tài)下，β-catenin 分離并積聚在細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)一步易位到細(xì)胞核中，與T 細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子轉(zhuǎn)錄因子相互作用，并促進(jìn)下游靶標(biāo)c-Myc、Cyclin D1 的表達(dá)[17]。研究表明，Wnt/βcatenin 信號(hào)通路的失調(diào)與癌癥（包括子宮內(nèi)膜癌）的發(fā)病、進(jìn)展、惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)，Park 等[18]發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin 活性增加，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；Liu 等[19]發(fā)現(xiàn)通過激活Wnt/β-catenin 途徑促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，抑制凋亡，加速腫瘤生長(zhǎng)。Tian 等[5]還發(fā)現(xiàn)右美托咪定通過抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路來抑制卵巢癌的發(fā)展?；谝陨辖Y(jié)果，右美托咪定可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin 信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，促進(jìn)其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定處理后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中β-catenin、c-Myc、Cyclin D1 蛋白表達(dá)下降，提示右美托咪定可能通過抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。Liang等[20]發(fā)現(xiàn)，丁酸鹽通過抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路對(duì)胃癌的遷移、侵襲和有氧糖酵解有抑制作用，但被Wnt/β-catenin 信號(hào)通路激活劑LiCl 逆轉(zhuǎn)。為進(jìn)一步探究Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在右美托咪定抑制子宮內(nèi)膜癌增殖中的作用，本研究在右美托咪定100 nmol/L 組的基礎(chǔ)上使用LiCl，結(jié)果顯示LiCl 可逆轉(zhuǎn)右美托咪定對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制，減少細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步證實(shí)右美托咪定可能通過抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、凋亡。

綜上所述，右美托咪定能抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制Wnt/βcatenin 信號(hào)通路有關(guān)。本研究為治療子宮內(nèi)膜癌提供了新的方法和思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突