萬麗麗 王轉(zhuǎn)茸 湯謐 曾紅霞 張學(xué)軍 張娜 任儉 孫玉宏 朱志坤

摘要：以西瓜自交系D66的子葉為外植體，將外植體置于含有不同濃度乙酰乳酸合成酶（Acetolactate synthase，ALS）抑制劑類除草劑（SU除草劑、IMI除草劑）的篩選培養(yǎng)基上，根據(jù)外植體的分化率確定最適宜的除草劑濃度。探討不同植物生長調(diào)節(jié)劑（6-BA、NAA）濃度配比對不定芽的增殖作用。結(jié)果表明，SU除草劑中苯磺隆和噻吩磺隆的最適宜濃度均為0.25 mg/L，芐嘧磺隆的最適宜濃度為0.50 mg/L；IMI除草劑中滅草喹和滅草煙的最適宜濃度均為1.50 mg/L；在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基中不定芽的增殖率最高，為287.0%；根據(jù)西瓜自交系材料D66確定的除草劑最適宜濃度同樣適用于西瓜雜交種（武農(nóng)8號、黑美人、甜王1號、早佳8424）子葉外植體的篩選試驗。

關(guān)鍵詞：子葉外植體；ALS抑制類除草劑；西瓜自交系；西瓜雜交種；不定芽增殖；SU除草劑；IMI除草劑

中圖分類號：S651 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）11-0202-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.11.035 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on the differentiation of watermelon cotyledon explants by ALS inhibitor herbicides

WAN Li-li1， WANG Zhuan-rong1， TANG Mi1， ZENG Hong-xia1， ZHANG Xue-jun2，3，

ZHANG Na1， REN Jian1， SUN Yu-hong1， ZHU Zhi-kun4

（1. Wuhan Academy of Agricultural Sciences， Wuhan ?430065，China；2. The Research Center of Hami-melon， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi ?830091，China；3. Hainan Sanya Crop Breeding Experimental Center，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Sanya ?572014，Hainan，China；4.Caidian District Bureau of Agriculture and Rural Affairs， Wuhan ?430199，China）

Abstract：Using the cotyledons of watermelon inbred line D66 as explants， the explants were placed on a screening medium containing different concentrations of acetolactate synthase （ALS） inhibitor herbicides （SU herbicides， IMI herbicides）， and the optimal herbicide concentration was determined based on the differentiation rate of the explants. The effect of different plant growth regulators （6-BA， NAA） concentration ratios on the proliferation of adventitious buds was explored. The results showed that the optimal concentrations of tribenuron-methy1 and thifensulfuron-methy1 in SU herbicides were both 0.25 mg/L， while the optimal concentration of bensulfuron was 0.50 mg/L；the most suitable concentrations for IMI herbicides such imazaquin and imazapyr were both 1.50 mg/L；the highest proliferation rate of adventitious buds was observed in MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA medium， which was 287.0%；the optimal concentration of herbicides determined based on watermelon inbred line D66 materials was also suitable for screening cotyledon explants of watermelon hybrids （Wunong 8， Black Beauty， Tianwang 1， Zaojia 8424）.

Key words： cotyledon explants； ALS inhibitory herbicides； watermelon inbred line； watermelon hybrid； adventitious bud proliferation； SU herbicides； IMI herbicides

人口的增長和極端氣候環(huán)境給農(nóng)作物的生產(chǎn)帶來挑戰(zhàn)，提高作物的產(chǎn)量和對逆境脅迫的適應(yīng)性是育種工作者需要重點(diǎn)關(guān)注的問題。田間雜草與農(nóng)作物競爭光照、水肥和氧氣，影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)［1］。化學(xué)除草是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中控制雜草的主要手段。乙酰乳酸合成酶（Acetolactate synthase，ALS）抑制劑類除草劑具有廣譜性、活性高、選擇性強(qiáng)和生物安全性高的優(yōu)勢，在田間雜草防控中被廣泛應(yīng)用。主要包括5個不同結(jié)構(gòu)的化合物家族，分別是磺酰脲類（Sulfonylureas，SU）、咪唑啉酮類（Imidazolinones，IMI）、三唑嘧啶磺酰胺類（Triazolopyrimidines，TP）、嘧啶水楊酸類（Pyrimidyl-benzoates，PB）和磺酰氨羧基三唑啉酮類（Sulfonlyaminocarbonyl-triazolinones，SCT）［2］。SU和IMI是常用的除草劑，這2類除草劑主要用于1年生或多年生闊葉雜草的防除。SU除草劑主要有苯磺?。═ribenuron-methyl，TM）、噻吩磺隆（Thifensulfuron methyl，HAR）、芐嘧磺?。˙ensulfuron methyl，BM）等。IMI除草劑主要有滅草煙（Imazethapyr，IP）和滅草喹（Imazaquin，IQ）等。ALS抑制類除草劑的作用靶標(biāo)是植物內(nèi)源ALS，通過阻斷底物進(jìn)入ALS酶的活性位點(diǎn)并與之結(jié)合，進(jìn)而影響纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等支鏈氨基酸的生物合成，影響植物體內(nèi)的蛋白代謝，最終滅殺植物［3］。盡管ALS抑制劑類除草劑具有諸多優(yōu)勢，但其作用位點(diǎn)單一、長期高頻施用容易產(chǎn)生雜草耐受性，進(jìn)而產(chǎn)生抗藥性雜草種群。

植物對ALS抑制劑類除草劑產(chǎn)生的抗性機(jī)制如下。①靶標(biāo)抗性（Target-site resistance，TSR）。靶標(biāo)基因ALS保守區(qū)域發(fā)生突變引起氨基酸的改變，導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)或者空間構(gòu)象變化，對除草劑的敏感性降低進(jìn)而產(chǎn)生抗性。ALS蛋白質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，A96、P171、A179、W548和S627 5個高度保守結(jié)構(gòu)域中氨基酸突變會提高植株對除草劑的抗性［4，5］。②非靶標(biāo)抗性（Non-target-site resistance，NTSR）。通過減少除草劑的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和活化能力提高除草劑解毒、降解和誘導(dǎo)損傷修復(fù)能力［6］。細(xì)胞色素P450單氧化酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase， GSTS）和糖基轉(zhuǎn)移酶等通過催化除草劑脫烷基化、環(huán)甲基羥基化、芳環(huán)的羥基化、脫硫氧化，或者催化有害物質(zhì)的親電子基團(tuán)與還原型谷胱甘肽的巰基偶聯(lián)增加疏水性，使有害物質(zhì)更容易穿透細(xì)胞膜分解排出［7-9］?；诳笰LS抑制劑類除草劑的作用機(jī)理，通過多途徑獲得新型ALS抑制劑類除草劑抗性資源是解決雜草抗藥性的有效策略。目前有學(xué)者已經(jīng)通過種子EMS誘變與除草劑篩選相結(jié)合、植株體細(xì)胞或者小孢子細(xì)胞與除草劑共培養(yǎng)等方式獲得自發(fā)突變的抗性種子和抗性細(xì)胞系［10-12］。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術(shù)實現(xiàn)ALS與除草劑結(jié)合位點(diǎn)的突變，快速創(chuàng)制抗除草劑的種質(zhì)［13-16］。玉米ALS基因165位Ser替換為Pro，獲得抗氯磺隆除草劑的玉米種質(zhì)，西瓜內(nèi)源ALS基因190位Pro替換為Ser，獲得抗除草劑的西瓜種質(zhì)［17］。此外，隨著基因編輯工具的優(yōu)化，利用單堿基編輯器構(gòu)建ALS基因飽合突變體庫能夠快速獲得抗除草劑的基因資源。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，在含有適宜除草劑濃度的培養(yǎng)基上篩選植物的外植體，能夠獲得抗ALS抑制類除草劑的新種質(zhì)資源［18-20］。遺傳轉(zhuǎn)化的程序包含農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、分化培養(yǎng)和植株再生等，遺傳轉(zhuǎn)化后的組織培養(yǎng)程序中可以施加不同類型的ALS抑制類除草劑，作為再生細(xì)胞的選擇劑，經(jīng)過分化培養(yǎng)獲得抗不同類型除草劑的再生植株。不同的作物種類、外植體類型對除草劑的敏感性存在差異，篩選適宜的除草劑濃度對鑒定抗除草劑種質(zhì)資源顯得尤為重要。

本研究以西瓜子葉為試驗材料，置于不同濃度ALS抑制類除草劑的培養(yǎng)基中，研究除草劑對西瓜組織培養(yǎng)外植體再生的影響，為建立高效的西瓜抗除草劑遺傳轉(zhuǎn)化體系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為西瓜自交系D66、西瓜雜交種（武農(nóng)8號、黑美人、甜王1號、早佳8424）。

1.2 試劑

MS培養(yǎng)基（含維生素）購自荷蘭Duchefa公司；植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA（1 mg/mL）和IAA（1 mg/mL）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂粉Agar［西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司］、抑菌劑特美汀均購自上海泰坦科技股份有限公司；ALS抑制類除草劑磺酰脲類的苯磺隆、噻吩磺隆 、芐嘧磺隆和咪唑啉酮類的滅草喹、滅草煙均購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ALS抑制類除草劑的配制 分別稱取10 mg 苯磺隆、噻吩磺隆、芐嘧磺隆、滅草煙和滅草喹固體粉末，用100 μL 2 mol/L NaOH液體溶解，最后用去離子水定容。

1.3.2 除草劑篩選 西瓜種子置于75%乙醇中消毒30 s，1.5%次氯酸鈉消毒20 min，無菌去離子水沖洗3～5次，接種于MS+0.45 mg/L 6-BA培養(yǎng)基，26 ℃暗培養(yǎng)2～3 d直至胚根伸長至0.2～0.5 cm。從子葉和胚根接觸位置切開，去除子葉遠(yuǎn)軸端1/3的部分，將剩下的2/3子葉作為外植體。將外植體轉(zhuǎn)移至除草劑篩選培養(yǎng)基（MS+1.0 mg/L 6-BA+除草劑+0.8 g/L Agar+200 mg/L 特美汀培養(yǎng)基），其中除草劑分別為TM、HAR、BM、IQ和IP。SU除草劑設(shè)置不同濃度（A=0.01 mg/L、B=0.05 mg/L、C=0.25 mg/L、D=0.50 mg/L），苯磺隆除草劑對應(yīng)的篩選培養(yǎng)基分別為TMA、TMB、TMC、TMD，噻吩磺隆除草劑對應(yīng)的篩選培養(yǎng)基分別為HARA、HARB、HARC、HARD；芐嘧磺隆除草劑對應(yīng)的篩選培養(yǎng)基分別為BMA、BMB、BMC、BMD。IMI除草劑設(shè)置不同濃度（a=0.25 mg/L、b=0.50 mg/L、c=1.00 mg/L、d=1.50 mg/L），滅草喹除草劑對應(yīng)的篩選培養(yǎng)基分別為IQa、IQb、IQc、IQd；滅草煙除草劑對應(yīng)的篩選培養(yǎng)基分別為IPa、IPb、IPc、IPd。不含有除草劑的培養(yǎng)基為對照（CK）。組織培養(yǎng)的溫度為（25±2） ℃，光照度為1 500～3 000 lx，16 h光照、 8 h黑暗培養(yǎng)。每個處理3次重復(fù)，分別在培養(yǎng)10、25、35 d后記錄外植體的分化率，計算公式如下：

分化率=（分化出愈傷數(shù)或者不定芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）?100% ?（1）

死亡率=（外植體死亡數(shù)/接種外植體總數(shù)）?100% ? ? ? ? ? ?（2）

1.3.3 西瓜子葉誘導(dǎo)不定芽 將誘導(dǎo)生成的1～2 cm不定芽轉(zhuǎn)移到含有不同濃度6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基中，其中，6-BA濃度分別為0.5、1.0、2.0 mg/L，NAA濃度分別為0.1、0.5、1.5 mg/L。每個處理接種6～8個不定芽，3次重復(fù)。30 d后統(tǒng)計芽增殖率，計算公式如下：

芽增殖率=（新增出芽數(shù)/原有芽數(shù)）?100% ?（3）

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)用Excel 2017軟件統(tǒng)計，在SPSS 26.0軟件中采用Duncans法進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SU除草劑對西瓜子葉外植體的分化作用

將西瓜自交系D66的子葉作為外植體置于不同類型和濃度的SU除草劑篩選培養(yǎng)基，10、25、35 d后統(tǒng)計外植體的分化率和死亡率（圖1）。由表1、表2、表3可知，隨著SU除草劑濃度的增加，外植體死亡率呈上升趨勢，分化率呈下降趨勢。外植體在0.25 mg/L苯磺隆培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，外植體的分化率為0，培養(yǎng) 35 d后外植體的死亡率為42.0%；外植體在0.25 mg/L噻吩磺隆培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，外植體的分化率為0，培養(yǎng)35 d后外植體的死亡率為55.7%；在0.50 mg/L芐嘧磺隆培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，外植體的分化率為0，培養(yǎng)35 d后外植體的死亡率為52.7%。本試驗中篩選的是非轉(zhuǎn)基因西瓜材料，外植體沒有分化表明該處理下外植體不具備分化能力，為今后開展轉(zhuǎn)基因抗除草劑西瓜種質(zhì)的篩選提供參考依據(jù)。因此將最早出現(xiàn)外植體分化率為0時除草劑的濃度定義為最適宜篩選濃度，苯磺隆和噻吩磺隆除草劑的最適宜篩選濃度均為0.25 mg/L，芐嘧磺隆的最適宜篩選濃度為0.50 mg/L。

2.2 IMI除草劑對西瓜子葉外植體的分化作用

將西瓜自交系D66的子葉作為外植體置于不同類型和濃度的IMI除草劑培養(yǎng)基中。由表4、表5可知，在1.50 mg/L滅草喹除草劑培養(yǎng)基上西瓜子葉外植體的分化率為0，培養(yǎng)35 d后外植體的死亡率達(dá)49.3%；在1.50 mg/L滅草煙除草劑培養(yǎng)基上西瓜子葉外植體的分化率為0，培養(yǎng)35 d后外植體的死亡率達(dá)45.5%。將最早出現(xiàn)外植體分化率為0時除草劑的濃度定義為最佳篩選濃度，西瓜子葉外植體在滅草喹和滅草煙培養(yǎng)基上篩選濃度均為1.50 mg/L。

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比對不定芽增殖培養(yǎng)的影響

6-BA濃度分別為0.5、1.0、2.0 mg/L，NAA濃度分別為0.1、0.5、1.5 mg/L，將誘導(dǎo)生成的不定芽置于不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比的培養(yǎng)基中，由表6可知，不同植物生長調(diào)節(jié)劑（6-BA、NAA）均能促進(jìn)不定芽的增殖。在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基中不定芽的增殖率最高，為287.0%。

2.4 西瓜雜交種的子葉外植體在除草劑培養(yǎng)基上的分化研究

將西瓜雜交種（武農(nóng)8號、黑美人、甜王1號、早佳8424）和西瓜自交系D66發(fā)芽2 d后的子葉作為外植體置于除草劑培養(yǎng)基（表7），35 d后統(tǒng)計4種西瓜雜交種和西瓜自交系D66外植體的分化率和死亡率。4種西瓜雜交種和西瓜自交系D66在0.25 mg/L TM、0.25 mg/L HAR、0.5 mg/L BM、1.5 mg/L IQ和1.5 mg/L IP除草劑培養(yǎng)基中的分化率均為0。西瓜外植體在5種除草劑（TM、HAR、BM、IQ、IP）處理下的死亡率分別為40.0%～50.5%、54.7%～65.0%、40.9%～52.0%、40.7%～52.5%、39.5%～45.2%。

3 結(jié)論

1）西瓜自交系D66子葉外植體在含有SU除草劑苯磺隆和噻吩磺隆的培養(yǎng)基上最適宜濃度均為0.25 mg/L，芐嘧磺隆最適宜的濃度為0.50 mg/L。

2）西瓜自交系D66子葉外植體在含有IMI類除草劑滅草喹和滅草煙培養(yǎng)基上最適宜的濃度均為1.5 mg/L。

3）ALS抑制類除草劑篩選后得到的不定芽在含有1.0 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基中芽增殖率最高。

4）4個西瓜雜交種在0.25 mg/L苯磺隆和噻吩磺隆、0.50 mg/L芐嘧磺隆、1.50 mg/L滅草喹和滅草煙除草劑培養(yǎng)基上的分化率均為0。

4 討論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化試驗中，在培養(yǎng)基中添加篩選劑能夠有效抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞或者組織的生長及增殖。目前植物轉(zhuǎn)基因組織培養(yǎng)篩選中常用的選擇性標(biāo)記主要是Kana、Hyg及Basta等。選擇性標(biāo)記能夠?qū)D(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不能生長、發(fā)育及分化，而轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠?qū)Τ輨┊a(chǎn)生抗性。雖然選擇性標(biāo)記基因?qū)Y選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及植株提供了便利，但由于它們大多數(shù)來自于細(xì)菌或者真菌，會產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因安全問題。為了便于轉(zhuǎn)基因作物的市場化，研究者傾向于選擇來源于植物內(nèi)源突變的除草劑靶基因表達(dá)系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)化試驗的篩選。ALS抑制類除草劑的作用靶標(biāo)為ALS，該酶在生物體內(nèi)能夠阻斷底物進(jìn)入酶的活性位點(diǎn)，抑制支鏈氨基酸的生物合成，破壞生物體的蛋白質(zhì)代謝反應(yīng)，最終滅殺植物。采用長期高強(qiáng)度的除草劑選擇壓或者人工誘變來獲得ALS抑制類除草劑的種質(zhì)。擬南芥、水稻、馬鈴薯、芥菜型油菜和玉米等作物的ALS基因突變能產(chǎn)生對除草劑的抗性，這類ALS突變基因被選擇為遺傳轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記［21-25］，將水稻OsALS突變基因型作為選擇標(biāo)記應(yīng)用到大豆、小麥等作物遺傳轉(zhuǎn)化試驗［26-28］。Kawai等［29］將水稻細(xì)胞與ALS抑制類除草劑如雙草醚（Bispyribac-sodium）、氯磺?。–hlorsulfuron）、滅草喹共培養(yǎng)獲得自發(fā)突變的抗性細(xì)胞，設(shè)置的篩選濃度為1 nm/L～10 μmol/L。

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