張園園,孫竹林,趙愛(ài)華,周亞洲,楊瑞馥,張平平,魏東

1. 中國(guó)食品藥品檢定研究院國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102629; 2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100071

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis)引起的自然疫源性烈性傳染病,在《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》中被列為甲類傳染病。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)《人間傳染的病原微生物名錄》根據(jù)其危害程度,將鼠疫耶爾森菌列為第二類高致病性微生物。鼠疫耶爾森菌主要在嚙齒類動(dòng)物中引起原發(fā)性感染,經(jīng)鼠蚤或直接接觸及吸入氣溶膠傳播給人,引起的疾病主要包括腺鼠疫、肺鼠疫和敗血型鼠疫3種類型,其中肺鼠疫病死率較高[1]。人類歷史上曾發(fā)生過(guò)3次鼠疫大流行,造成上億人死亡。時(shí)至今日,很多地區(qū)如非洲、亞洲、美洲仍將鼠疫視為可能會(huì)死灰復(fù)燃的烈性傳染性疾病之一[2-4]。

根據(jù)現(xiàn)行的《鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS279-2008)》規(guī)定,鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測(cè)是鼠疫診斷過(guò)程中的重要實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目。目前有多種鼠疫耶爾森菌抗體檢測(cè)方法均很有效,如間接血凝法、膠體金法、酶聯(lián)免疫法、上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析法等[5-7],但我國(guó)尚無(wú)鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測(cè)試劑評(píng)價(jià)用國(guó)家參考品。為此,本團(tuán)隊(duì)研制了一套鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測(cè)試劑評(píng)價(jià)用國(guó)家參考品,這對(duì)鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測(cè)試劑的注冊(cè)管理及指導(dǎo)我國(guó)該類試劑的健康有序發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種鼠疫耶爾森菌EV株(CMCC～52006)、鼠疫耶爾森菌0614F株、鼠疫耶爾森菌Tjiusidej(R)株(CMCC52010)、鼠疫耶爾森菌田鼠型201株、假結(jié)核耶爾森菌(CMCC53521)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(CMCC52203)、土拉熱弗朗西絲菌LVS株、布魯菌104M株(CMCC55010)、炭疽芽孢桿菌(CMCC63001)、傷寒沙門菌(CMCC50071)均由中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collections,CMCC)提供。

1.1.2 動(dòng)物新西蘭大耳白家兔,體重2.5～3.0 kg,無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí),雄性。

1.1.3 樣本鼠疫疫苗人免血清、正常人血漿及兔抗鼠疫耶爾森菌F1抗原血清由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司提供。

1.1.4 主要試劑鼠疫耶爾森菌抗體檢測(cè)試劑盒(上轉(zhuǎn)發(fā)光法)(批號(hào):20211001)由北京熱景生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn);鼠疫耶爾森菌抗體檢測(cè)試劑盒(上轉(zhuǎn)發(fā)光法)(批號(hào):20210907)由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所生產(chǎn);鼠疫耶爾森菌抗體檢測(cè)試劑(膠體金法)(批號(hào):20210202401)由北京金豪制藥股份有限公司生產(chǎn);鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測(cè)試劑(膠體金法)(批號(hào):20210801)、鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)(批號(hào):20210201)、鼠疫耶爾森菌F1抗體診斷試劑盒(間接血凝法)(批號(hào):20210201)均由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.1.5 儀器設(shè)備生物安全柜購(gòu)自美國(guó) NuAire公司;MIR-153型恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自日本三洋公司。

1.2 方法

1.2.1 兔免血清的制備首先制備兔抗鼠疫耶爾森菌血清。將鼠疫耶爾森菌EV株(CMCC52006)、鼠疫耶爾森菌0614F株、鼠疫耶爾森菌Tjiusidej(R)株(CMCC52010)、鼠疫耶爾森菌田鼠型201株(其中除EV株外均為滅活菌體)分別免疫家兔,共免疫2次,間隔2周,背部皮下接種,每次免疫1.0 mL[含5×108個(gè)菌及1.0 mg氫氧化鋁佐劑(活疫苗除外)]。于第2次免疫后2周采血并分離血清。

再制備兔抗陰性菌血清,將假結(jié)核耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、布魯菌、炭疽芽孢桿菌、傷寒沙門菌、土拉熱弗朗西絲菌(均為滅活菌體)分別免疫家兔,共免疫4次,間隔2周,背部皮下接種,每次免疫1.0 mL(含5×108個(gè)菌及1.0 mg氫氧化鋁佐劑)。于第4次免疫后2周采血并分離血清。

1.2.2 去纖維血漿的制備每100 mL正常人血漿中加入脫纖維試劑(氯化鈣終濃度為0.012 5 mol/L,凝血酶終濃度為3.5 IU/mL),加入后立即混勻,于37 ℃水浴輕微轉(zhuǎn)動(dòng)處理30 min至纖維蛋白原凝集,12 000 g離心10 min,收集上清液,即為去纖維血漿。

1.2.3 參考品的組成首先,制備陽(yáng)性參考品,將4株鼠疫耶爾森菌免疫家兔,制備4份兔免血清。另用正常人去纖維血漿10倍稀釋鼠疫耶爾森菌EV株兔免血清,制備1份弱陽(yáng)性參考品?？紤]到本套參考品將用于評(píng)價(jià)人用鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測(cè)試劑,將1份鼠疫疫苗人免血清作為陽(yáng)性參考品。

陰性參考品包括2份正常人脫纖維血漿、6份微生物學(xué)分類接近或高致病性微生物的兔免血清。由于高致病性微生物感染者的血清難以獲得,因此使用兔免血清作為相應(yīng)陰性參考品。

采用純化的鼠疫耶爾森菌F1抗原免疫家兔,制備血清,用作最低檢出限參考品與重復(fù)性參考品。

1.2.4 參考品的分裝將6份陽(yáng)性參考品及8份陰性參考品以每支0.15 mL分裝于凍存管中。將F1抗原兔免血清用凍干保護(hù)劑稀釋后定量分裝于安瓿中,每支 0.5 mL,凍干后封口,作為最低檢出限參考品與重復(fù)性參考品。分裝精確度不高于1%,水分低于3%。分裝后參考品樣品均于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 分裝后驗(yàn)證隨機(jī)抽取一套參考品,用鼠疫耶爾森菌抗體檢測(cè)試劑進(jìn)行F1抗體檢測(cè)。

1.2.6 均勻性檢驗(yàn)隨機(jī)抽取最低檢出限參考品10支,分別加入0.5 mL樣本稀釋液復(fù)溶;取復(fù)溶樣本0.1 mL,加入0.3 mL樣本稀釋液(4倍稀釋),混勻;用鼠疫耶爾森菌抗體檢測(cè)試劑檢測(cè)抗體水平。每支樣本重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.7 穩(wěn)定性研究分為以下3類。①凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)。從冰箱中取出陽(yáng)性參考品及最低檢出限參考品,于室溫放置約4 h,再放回冰箱,如此重復(fù)1次及3次,用鼠疫耶爾森菌抗體檢測(cè)試劑進(jìn)行F1抗體檢測(cè)。②加速穩(wěn)定性試驗(yàn)。從-80 ℃冰箱中取出陽(yáng)性參考品及最低檢出限參考品,分別于-20 ℃、4 ℃、37 ℃各放置2套。陽(yáng)性參考品放置3 d和5 d,最低檢出限參考品放置14 d和28 d,分別用鼠疫耶爾森菌抗體檢測(cè)試劑盒(上轉(zhuǎn)發(fā)光法)及鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)進(jìn)行F1抗體檢測(cè)。③長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)。對(duì)弱陽(yáng)性參考品及最低檢出限參考品進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性觀察,用鼠疫耶爾森菌抗體檢測(cè)試劑進(jìn)行F1抗體檢測(cè)。

1.2.8 協(xié)作標(biāo)定按照國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)協(xié)作標(biāo)定技術(shù)的要求設(shè)計(jì)方案,制定生物制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)協(xié)作標(biāo)定作業(yè)指導(dǎo),并邀請(qǐng)北京熱景生物技術(shù)股份有限公司、軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所、北京金豪制藥股份有限公司、蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司共4家實(shí)驗(yàn)室,使用各自生產(chǎn)的鼠疫耶爾森菌抗體檢測(cè)試劑進(jìn)行參考品協(xié)作標(biāo)定工作[8]。采用上轉(zhuǎn)發(fā)光法、膠體金法、酶聯(lián)免疫法、間接血凝法的鼠疫耶爾森菌抗體檢測(cè)試劑分別有2、2、1、1個(gè),編號(hào)為1～6。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用IBM SPSS Statistics 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,其中上轉(zhuǎn)發(fā)光法測(cè)定結(jié)果以T/C值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,酶聯(lián)免疫法以樣品吸光度值與臨界值(cut off)的比值(S/CO值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別采用單因子方差分析和配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 參考品的組成

共6份陽(yáng)性參考品,編號(hào)為P1～P6;8份陰性參考品,編號(hào)為N1～N8;1份最低檢出限參考品,編號(hào)為L(zhǎng);1份重復(fù)性參考品,編號(hào)為R。

2.2 分裝后驗(yàn)證結(jié)果

使用鼠疫耶爾森菌抗體檢測(cè)試劑檢測(cè)分裝后的參考品,陽(yáng)性參考品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,陰性參考品檢測(cè)結(jié)果均為陰性,檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期一致。

2.3 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

均勻性檢驗(yàn)結(jié)果如表1所示,F臨界值為F0.05(9,20)=2.42,計(jì)算的F值為0.571,該值小于F臨界值,P=0.805,表明在顯著性水平為0.05時(shí),樣品中的抗體含量是均勻的。

表1 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果(T/C值)

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果凍融1次及3次后,6份陽(yáng)性參考品的F1抗體檢測(cè)結(jié)果均仍為陽(yáng)性,且F1抗體水平與未凍融對(duì)照相比無(wú)顯著性差異(均P>0.05)(見(jiàn)圖1);最低檢出限參考品凍融3次后的最低檢出水平與未凍融對(duì)照一致。

圖1 陽(yáng)性參考品凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 加速穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果6份陽(yáng)性參考品在不同溫度下加速3 d和5 d后,F1抗體檢測(cè)結(jié)果均仍為陽(yáng)性,各樣本的F1抗體水平與對(duì)照樣品相比無(wú)顯著性差異(均P>0.05)(見(jiàn)圖2)。最低檢出限參考品在不同溫度下加速14 d后,F1抗體水平未見(jiàn)明顯變化;在不同溫度下加速28 d后,隨著加速溫度的升高,F1抗體水平出現(xiàn)降低趨勢(shì)(見(jiàn)圖3)。

A: The results of accelerated stability test at -20 ℃. B: The results of accelerated stability test at 4 ℃. C: The results of accelerated stability test at 37 ℃.

A: The results of accelerated stability test for 14 d. B: The results of accelerated stability test for 28 d.

2.4.3 長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果最低檢出限參考品及弱陽(yáng)性參考品的長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果分別如表2和表3所示,觀察期內(nèi)F1抗體水平均未見(jiàn)明顯變化。

表2 最低檢出限參考品長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表3 弱陽(yáng)性參考品長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

采用6種鼠疫耶爾森菌抗體檢測(cè)試劑盒來(lái)檢測(cè)本參考品。對(duì)于陽(yáng)性參考品,所有檢測(cè)試劑的陽(yáng)性符合率均為100%;對(duì)于陰性參考品,所有檢測(cè)試劑的陰性符合率均為100%。最低檢出限參考品方面, 1種檢測(cè)試劑的最低檢出限為原倍血清,3種檢測(cè)試劑的最低檢出限為10倍稀釋血清,2種檢測(cè)試劑的最低檢出限為100倍稀釋血清。重復(fù)性參考品分別檢測(cè)10次,人工判讀的檢測(cè)試劑(膠體金法、間接血凝法)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,儀器判讀的檢測(cè)試劑(上轉(zhuǎn)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變異系數(shù)均小于15%。具體結(jié)果詳如表4所示。

表4 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

3 討論

我國(guó)鼠疫發(fā)病率低,近10年來(lái)每年發(fā)病人數(shù)均為個(gè)位數(shù),因此在研制鼠疫耶爾森菌抗體檢測(cè)試劑參考品時(shí)難以獲得鼠疫患者的血清[9]?，F(xiàn)用鼠疫耶爾森菌抗體檢測(cè)試劑中的間接血凝法和雙抗原夾心法對(duì)待檢血清的來(lái)源沒(méi)有嚴(yán)格的種屬限制[10-11],且常見(jiàn)的鼠疫抗體檢測(cè)試劑主要針對(duì)的是鼠疫耶爾森菌F1抗體[12]。因此,本套參考品在制備陽(yáng)性參考品時(shí),采用表達(dá)鼠疫耶爾森菌F1抗原的4株鼠疫耶爾森菌免疫家兔,制備兔免血清,并用正常人血漿10倍稀釋其中的EV株兔免血清制備了1份弱陽(yáng)性參考品。同時(shí)考慮到本套參考品將用于人用鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測(cè)試劑的評(píng)價(jià),所以選取了1份鼠疫疫苗人免血清作為陽(yáng)性參考品。采用上轉(zhuǎn)發(fā)光法和膠體金法鼠疫耶爾森菌抗體檢測(cè)試劑對(duì)候選的陽(yáng)性參考品分別進(jìn)行F1抗體驗(yàn)證,檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。采用酶聯(lián)免疫法對(duì)6份陽(yáng)性參考品進(jìn)行F1抗體效價(jià)測(cè)定,結(jié)果在1∶250～1∶4 000。

陰性參考品包括正常人血漿、微生物學(xué)分類接近或高致病性微生物的兔免血清。鑒于難以獲得高致病性微生物感染者的血清,本研究使用兔免血清作為相應(yīng)的陰性參考品。在制備陰性參考品兔免血清時(shí),免疫次數(shù)比陽(yáng)性參考品多2次。血清中針對(duì)免疫用菌體抗原的抗體檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。分別用酶聯(lián)免疫法、上轉(zhuǎn)發(fā)光法和膠體金法鼠疫耶爾森菌抗體檢測(cè)試劑進(jìn)行F1抗體驗(yàn)證,檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

本套參考品具有較好的均勻性和穩(wěn)定性,12個(gè)月的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果表明參考品的質(zhì)量未見(jiàn)明顯變化。協(xié)作標(biāo)定結(jié)果表明,本套參考品可用于對(duì)多種鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測(cè)試劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

綜上所述,本研究所建立的鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測(cè)試劑評(píng)價(jià)用參考品可用于鼠疫耶爾森菌F1抗體檢測(cè)試劑的質(zhì)量評(píng)價(jià),對(duì)提高該類產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。