崔佳勤,章海鑫,2,羅國芝,3,4,譚洪新,3,4

(1 上海海洋大學上海水產養(yǎng)殖工程技術研究中心,上海 201306;2 江西省水產科學研究所,江西 南昌 330039;3 上海市水產動物良種創(chuàng)制與綠色養(yǎng)殖協同創(chuàng)新中心,上海 201306;4 上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心,上海 201306)

土腥味物質包括多種化學物質,組成復雜,其中二甲基異莰醇(2-Methylisoborneol,2-MIB)和土臭素(Geosmin,GSM)是主要組成成分[1]。2-MIB和GSM在水中的人體嗅覺閾值分別是5～10 ng/L和1～10 ng/L[2],在魚肉中的嗅覺閾值分別為0.6 μg/kg和0.9 μg/kg[3-4],因此,即使較低濃度的土腥味物質也會對水產品品質造成巨大的影響。研究表明,2-MIB和GSM主要是由放線菌和以藍藻為首的浮游藻類分泌并傳播到水中的[5-8],魚蝦養(yǎng)殖過程中的殘飼、排泄物促進了養(yǎng)殖水體中藍藻和細菌的生長,需要控制魚蝦養(yǎng)殖過程中土腥味物質的濃度。

生物絮凝技術(Biofloc technology,BFT)具有凈化水質,促進養(yǎng)殖動物生長和增強機體免疫的作用[9-10]。由于放線菌是生物絮團結構的重要組成部分[10],且在零換水的BFT養(yǎng)殖模式下,更易導致土腥味物質的產生和積累。有研究表明BFT養(yǎng)殖斑點叉尾鮰試驗結束時水體中的GSM質量濃度高達396 ng/L[11]。因此,BFT養(yǎng)殖過程中的土腥味問題也需要引起高度重視。目前的研究主要集中在去除水體和魚體中已經積累的GSM和2-MIB[12-14]。而調控BFT養(yǎng)殖中的環(huán)境因子,可以對這兩種物質的產生源頭進行控制,有效改善水產品土腥味問題,碳氮比在生物絮團的形成和改善水質的過程中是比較重要的影響因素。

本研究通過改變碳源的添加量,設置不同的初始DOC/DIN(Dissolved Organic Carbon,DOC;Dissolved Inorganic Nitrogen,DIN)梯度,探究BFT水體中的C/N對GSM和2-MIB這兩種物質積累量的影響,對土腥味物質發(fā)生源頭進行適當的抑制和有效的防控,為提高BFT養(yǎng)殖的水產品品質提供參考。

1 材料與方法

1.1 生物絮團裝置

本試驗選用9個10 L聚乙烯透明桶作為試驗反應器,每個桶工作容積為8 L,用透明硅膠軟管(內徑5 mm、外徑7 mm)一端連接羅茨鼓風機(型號HG-750,森森集團股份有限公司),另一端接入石英曝氣石沉于桶底正中央曝氣,控制溶氧(Dissolved Oxygen,DO)>8 mg/L。分別以葡萄糖(C6H12O6,國藥集團化學試劑有限公司)作為有機碳源和魚用膨化飼料磨成粉作為氮源,飼料由南昌湘大駱駝飼料有限公司加工制作,含36.25%粗蛋白、8.12%粗脂肪、10.26%粗灰分及9.31%水分,并添加碳酸氫鈉(NaHCO3)控制堿度為200～230 mg/L。每個桶放入加熱棒(型號CN-008-50 W,中山市日寶電器有限公司)設置溫度(Temperature,T)為25℃。

1.2 試驗設計

試驗分為A、B和C共3個組,每組設置3個平行(n=3),每組投入30 g飼料,其中A組為對照組,不添加葡萄糖;B、C組添加葡萄糖調節(jié)C/N分別為10和20,試驗設置為7 d。該試驗周期參考Man等[13]研究使用BFT-SGRs去除養(yǎng)殖水中的GSM和2-MIB試驗與魏繼紅等[15]研究不同C/N對生物絮凝硝化作用強度的影響試驗。

2 試驗指標與檢測方法

2.1 水質理化指標

2.2 絮團營養(yǎng)指標

取試驗開始和結束時的絮團,粗灰分測定采用高溫灼燒法[17],粗蛋白測定采用杜馬斯燃燒定氮法[18],粗脂肪的測定采用索氏抽提法使用石油醚提取[19]。

2.3 BFT水體中GSM和2-MIB含量測定

GSM和2-MIB的標準曲線如圖1所示。

圖1 GSM和2-MIB的標準曲線Fig.1 GSM and 2-MIB standard curves

取試驗開始和結束時的水樣,檢測初始和結束時水體中的GSM和2-MIB含量,計算試驗期間GSM和2-MIB的積累量。用0.45 μm濾膜分別抽濾50 mL生物絮團,取濾液5 mL裝入頂空萃取瓶中,送往上海交通大學進行氣相色譜-質譜聯(GC-MS)分析測定GSM和2-MIB含量。具體操作參考閆莉等[20]。

將 GSM和2-MIB這2種標準品母液(色譜純,Supleco,USA)用超純水分別稀釋至質量濃度為20、10 、4、2、0.8、0.4、0.2、0.05、0.02 μg/L,進行上機檢測。分別以GSM和2-MIB質量濃度比為橫坐標,以其峰面積響應值為縱坐標,繪制這2種物質的標準曲線。GSM和2-MIB標準曲線的R2分別為0.999 8和1,線性良好(圖1)。

2.4 數據統(tǒng)計分析

試驗數據采用Excel 2022軟件進行結果統(tǒng)計,采用Origin 8.5軟件進行圖表繪制。試驗數值采用平均值±標準差(Mean±SD)形式表示,采用SPSS 22.0軟件進行ANOVA單因素方差分析,P<0.05表示差異性顯著。

3 結果與分析

3.1 試驗期間水質的變化

試驗期間溶氧為8.14±0.03 mg/L, pH為8.68±0.02,水溫為24.84±0.10℃,堿度為223±2.64 mg/L,TSS為1 076.92±16.72 mg/L,各組間均無顯著性差異(P>0.05,表1)。

表1 試驗期間各組水質指標的平均值Tab.1 Average values of water quality indexes in different group during the test period

注:A組(C/N為6)、B組(C/N為10)、C組(C/N為20),下同圖2 試驗期間各組水質指標動態(tài)變化圖Fig.2 Dynamic changes of water quality indexes in each group during the test period

3.2 試驗前后生物絮團營養(yǎng)成分的變化

相較于接種的初始絮團,試驗后各組C/N、絮團粗蛋白含量均出現了下降,A、B組絮團粗灰分和B、C組絮團粗脂肪的含量上升。比較試驗后各組,A、B和C組絮團粗蛋白、粗灰分含量均存在顯著差異(P<0.05),粗灰分含量為A組>B組>C組,粗蛋白含量為B組>C組>A組;A組與B、C組絮團C/N、粗脂肪含量分別呈顯著性差異(P<0.05),B、C組之間差異不顯著(P>0.05),粗脂肪含量為B組>C組>A組,絮團C/N為A組>B組>C組(表2)。

表2 試驗結束時絮團營養(yǎng)成分含量Tab.2 Nutrient content of bioflocs at the end of the test

3.3 試驗前后水體中土腥味物質含量的變化

試驗結束時,GSM和2-MIB在3個組中均被檢出,質量濃度范圍分別為33.32～87.30 ng/L和13.22～17.84 ng/L。A、B、C組GSM濃度較初始值顯著升高(P<0.05),GSM質量濃度在A組最高為87.31±2.83 ng/L,B組最低為33.32±1.37 ng/L;A、C組2-MIB濃度較初始值顯著升高(P<0.05),B組2-MIB濃度較初始值無顯著性差異,2-MIB質量濃度在A組最高為17.84±1.28 ng/L,B組最低13.22±0.91 ng/L。對比各組試驗開始與結束時的GSM和2-MIB含量,發(fā)現B組GSM和2-MIB的積累量最低,分別為22.41 ng/L和-0.19 ng/L,顯著低于A組(76.4 ng/L和4.43 ng/L)和C組(50.98 ng/L和3.52 ng/L,P<0.05)(圖3和圖4)。各組中GSM濃度均高于2-MIB濃度,可見在本研究中BFT水體中主要土腥味物質是GSM。

圖3 試驗開始前、后各組GSM的質量濃度Fig.3 Geosmin in each group before and after experiment

圖4 試驗開始前、后各組2-MIB的質量濃度Fig.4 2-MIB in each group before and after experiment

4 討論

4.1 不同C/N對水質的影響

4.2 不同C/N對生物絮團營養(yǎng)成分的影響

研究發(fā)現生物絮團干物質中粗蛋白含量一般為25 %～50 %,粗脂肪為0.5 %～15 %[30],吳盛凱等[31]發(fā)現在BFT養(yǎng)殖過程中,絮團的粗灰分含量會逐漸升高至30%左右。本試驗絮團營養(yǎng)成分含量均在以上水平范圍內。試驗結束時不添加葡萄糖的對照組絮團粗蛋白和粗脂肪含量顯著低于添加葡萄糖的兩個組。這與Rajkumar等[32]、譚竟宏等[33]研究得出的結果相同。有研究表明添加碳源能促使水體中的異養(yǎng)微生物大量繁殖,生長速率為自養(yǎng)細菌的10倍,這些異養(yǎng)細菌將水中氨氮轉化為自身的菌體蛋白,因此提高了絮團中的粗蛋白含量[34-36],雖然添加葡萄糖提高了絮團中的粗蛋白含量,但本試驗結果表明碳氮比為20∶1的絮團粗蛋白含量顯著低于碳氮比為10∶1的組,王廣軍等[37]也發(fā)現碳氮比越高,絮團的粗蛋白含量越低。與本試驗結果相似,徐金祥等[28]、楊章武等[38]在研究中也發(fā)現添加碳源能提高絮團中粗脂肪含量。與粗蛋白和粗脂肪的結果相反,試驗結束時添加葡萄糖的兩個組絮團粗灰分含量顯著低于不添加葡萄糖的對照組,這與徐金祥等[28]、譚竟宏等[33]、吳霞等[39]試驗結果相符。有研究指出因為水體中的碳氮比會影響絮團中的微生物群落結構,而絮團的營養(yǎng)組成又與其微生物群落組成相關,從而C/N導致了絮團粗蛋白、粗脂肪及粗灰分含量上的差異[30]。

4.3 不同C/N對土腥味物質積累量的影響

水中的2-MIB 和 GSM 嗅覺閾值是5～10 ng/L和1～10 ng/L,本試驗結束時各組的GSM和2-MIB濃度均超出嗅覺閾值,其中試驗后的GSM濃度更是顯著高于試驗前,由此說明BFT的水體環(huán)境易致使GSM和2-MIB(尤其是GSM)的積累。相比不額外添加葡萄糖的組,添加葡萄糖會抑制土臭素和二甲基異莰醇的生成,不同碳氮比下的土腥味物質積累存在顯著差異,C/N為10組試驗結束時BFT水體中GSM和2-MIB濃度顯著低于C/N為20組。有研究表明放線菌容易利用葡萄糖作為生長碳源,抑制次級代謝[40]。Sivonen等[41]研究表明,葡萄糖、果糖和甘露醇是芬蘭天然水域中分離出來的18個放線菌菌株生長中最廣泛使用的碳源。Schrader等[42]發(fā)現甘油作為碳源比葡萄糖更有利于鏈霉菌生成GSM。因此,試驗中添加葡萄糖抑制了GSM和2-MIB的生成,但碳源添加過多會引起微生物大量繁殖,分解GSM和2-MIB的放線菌的生物量也迅速增加,致使C/N為20組的BFT水體中的GSM和2-MIB含量高于C/N為10的組。汪世山等[43]、汪鷹[44]通過固定碳源改變氮源以及比例,固定氮源改變碳源以及比例和改變培養(yǎng)鏈霉菌的碳氮比等策略皆表明了C/N對鏈霉菌的生物量及其生成GSM和2-MIB有著不同的影響。本試驗研究結果表明,當添加葡萄糖控制碳氮比為10∶1時,試驗結束時GSM和2-MIB的積累量比不添加葡萄糖,以及添加葡萄糖控制碳氮比為20∶1時少,后續(xù)可以縮小碳氮比的范圍進一步研究抑制GSM和2-MIB生成的最佳碳氮比條件及最佳碳源。

5 結論

本試驗通過對不同碳氮比(C/N為6、10和20)水質指標的監(jiān)測、絮團營養(yǎng)成分的測定以及對水體中兩種主要土腥味物質的檢測,結果表明:在BFT中,向水體添加葡萄糖可以減少GSM和2-MIB的生成積累量,同時可降低水體中氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽和磷的含量,凈化水質;當碳氮比為10∶1時,水體中GSM和2-MIB的生成積累量最少,同時試驗后絮團的粗蛋白含量最高。因此在BFT中添加葡萄糖能影響水體中土腥味物質的積累,同時有改良水質和提高絮團粗蛋白含量的效果。