彭 強(qiáng), 王進(jìn)京, 王春德, 盧 霞, 劉相全, 劉桂龍, 徐 鑫, 許 賀, 寧軍號

基因在毛蚶免疫防御中的作用

彭 強(qiáng)1, 2, 3, 王進(jìn)京2, 王春德2, 盧 霞2, 劉相全3, 劉桂龍4, 徐 鑫4, 許 賀5, 6, 寧軍號2

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 2. 中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003; 3. 山東海洋資源與環(huán)境研究所, 山東 煙臺 264006; 4. 煙臺海之春水產(chǎn)種業(yè)有限公司, 山東 煙臺 264006; 5. 江蘇寶源生物科技有限公司, 江蘇 連云港 222144; 6. 江蘇海泰海洋科技有限公司, 江蘇 連云港 222144)

含C1q結(jié)構(gòu)域蛋白(C1qDCs)在無脊椎動物免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用, 但目前有關(guān)毛蚶()C1qDCs免疫功能的研究鮮有報(bào)道。本研究從毛蚶中鑒定出一個含有典型C1q結(jié)構(gòu)域的基因(命名為), 并分析了其對主要病原感染的響應(yīng)特征。的cDNA全長序列為711 bp, 編碼含有N端信號肽和199個氨基酸的蛋白, 系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示SsC1qDC與雙殼貝類的C1qDCs聚在一起。在毛蚶卵細(xì)胞到眼點(diǎn)幼蟲時期的表達(dá)量隨發(fā)育階段顯著增加, 且該基因在成體毛蚶各組織中均有表達(dá), 其中在肝胰腺和閉殼肌中表達(dá)水平較高。副溶血弧菌刺激可顯著誘導(dǎo)基因高表達(dá), 敲降基因表達(dá)后毛蚶死亡率和血細(xì)胞凋亡水平顯著升高, 且導(dǎo)致毛蚶血細(xì)胞總數(shù)和吞噬活力顯著下降。同時, 敲降基因的表達(dá)可顯著抑制母源免疫相關(guān)基因、、、和的表達(dá), 而、、和等基因的表達(dá)顯著上調(diào)。本研究結(jié)果表明,在毛蚶抗弧菌響應(yīng)中發(fā)揮重要作用, 對貝類免疫學(xué)和抗病新品系的選育有重要的指導(dǎo)意義。

; 毛蚶(); 表達(dá)圖譜; RNA干擾; 免疫防御

補(bǔ)體C1q是補(bǔ)體C1復(fù)合蛋白的一個重要組分, 能夠激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑, 該途徑是脊椎動物中連接獲得性免疫和先天免疫的重要樞紐[1, 2]。含C1q結(jié)構(gòu)域蛋白(C1q domain containing proteins, C1qDCs)是包含一個或多個球狀gC1q結(jié)構(gòu)域的蛋白超家族[1, 3], 廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中[4, 5]。在脊椎動物中, C1qDCs不僅可以激活補(bǔ)體經(jīng)典通路, 還可以作為模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs), 通過結(jié)合病原表面的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP), 快速啟動細(xì)胞吞噬等免疫過程, 有效遏制病原微生物的侵害[6]。例如, 鯉魚()的C1qDC蛋白具有細(xì)菌凝集活性及脂多糖和肽聚糖結(jié)合活性[7]。此外, 斑馬魚()C1qDC蛋白可以特異結(jié)合免疫球蛋白IgG和IgM, 并通過激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑抑制血清的溶血活性[8]。

研究發(fā)現(xiàn)文昌魚()C1q蛋白可以結(jié)合哺乳類的IgG, 但沒有直接證據(jù)表明無脊椎動物中存在補(bǔ)體的經(jīng)典激活途徑[9]。越來越多的研究表明, 無脊椎動物的C1qDCs參與了多種免疫應(yīng)答反應(yīng), 例如免疫識別、結(jié)合與凝集活性[10, 11], 抗菌活性[12, 13],促吞噬作用[14, 15]和細(xì)胞遷移[16-18]等。然而, C1qDCs在無脊椎動物特定免疫途徑中的主要作用鮮有報(bào)道, 需要進(jìn)一步研究以豐富無脊椎動物的免疫機(jī)制。

本研究以毛蚶為研究對象, 利用PCR和RACE技術(shù)克隆得到基因的cDNA序列。探究了基因在毛蚶不同組織、早期胚胎以及弧菌刺激后的表達(dá)特征, 并利用RNA干擾技術(shù)敲降毛蚶基因的表達(dá), 分析其在弧菌脅迫后毛蚶血細(xì)胞吞噬和凋亡及抗弧菌感染中的功能特征。本研究為進(jìn)一步闡明在毛蚶免疫防御中的潛在功能提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的毛蚶為合作公司的養(yǎng)殖群體, 均為殼形完整、健康無損傷的個體。實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)挑選30只毛蚶測量數(shù)據(jù)如下: 平均殼長為22.15±1.37 mm、平均殼高為24.17±1.08 mm、平均殼寬為19.56±0.44 mm、平均體質(zhì)量為9.63±0.71 g。在實(shí)驗(yàn)室條件(pH 8.2±0.1、鹽度 23±1、溫度28±0.5 ℃)下暫養(yǎng)7 d進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 每日早晚各投喂1次螺旋藻餌料, 投喂后2 h更換全部海水。實(shí)驗(yàn)所用的弧菌是副溶血弧菌()PL2菌株, 菌種由浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所清江基地實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 毛蚶總RNA提取及cDNA合成

采用Trizol提取試劑盒(Invitrogen, 美國)提取毛蚶各組織總RNA, 采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性, 利用Nanodrop 2000(Thermo Scientific, 美國)檢測RNA的純度和濃度。然后采用HiScript?III RT SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme, 中國)將毛蚶各組織的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, –20 ℃保存待用。

1.2.2 毛蚶基因cDNA序列克隆

以毛蚶的肝胰腺、血細(xì)胞和鰓等組織的cDNA為模板, 根據(jù)引物F、R和- F1,-F2(表1)擴(kuò)增基因的ORF和cDNA全長, 利用PrimeSTAR?Max DNA Polymerase試劑盒(TaKaRa, 日本)進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn), PCR反應(yīng)體系: 2.0 μL dNTP Mix、12.5 μL 10×PCR Buffer、0.5 μL正反向引物(10 μmol/L)、1.0 μL cDNA模板、0.2 μL Taq聚合酶和18.3 μL DEPC H2O(TaKaRa, 日本)。反應(yīng)程序: 94 ℃預(yù)變性 3 min, 35 個循環(huán)(94 ℃變性30 s, 54 ℃退火50 s, 72 ℃延伸60 s), 72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳切膠純化后, 將融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 篩選陽性克隆質(zhì)粒送北京擎科生物有限公司測序。

表1 本研究中所用的引物

Tab.1 Primer sequences used in this study

續(xù)表

1.2.3 生物信息學(xué)分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST模塊(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST)進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列分析; 利用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/gorf.htmL)在線預(yù)測基因的開放閱讀框和氨基酸序列; 使用 ExPASy(https://www.ncbi.nlm. nih.gov/orffinder/)進(jìn)行理論等電點(diǎn)與相對分子量的預(yù)測; 使用 DNAMAN 8.0軟件對不同物種的C1qDC蛋白進(jìn)行多序列比對; 利用MEGA-X軟件的鄰接法(neighbor-joining, NJ)對包括毛蚶在內(nèi)的15個C1qDC氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, bootstrap值設(shè)為1 000。

1.2.4 不同組織、胚胎發(fā)育時期和弧菌刺激后基因表達(dá)情況

解剖雌、雄毛蚶各5只, 分別取血細(xì)胞、性腺、閉殼肌、斧足、外套膜、肝胰腺和鰓組織等樣品, 其中毛蚶血細(xì)胞取樣具體操作如下: 先用移液槍吸取500 μL的抗凝劑(336 mmol/L NaCl, 27 mmol/L檸檬酸鈉, 115 mmol/L葡萄糖, 9 mmol/L EDTA-Na2, pH 7.0)加至無RNA酶的1.5 mL EP管中, 再用注射器或移液槍從毛蚶體內(nèi)吸取500 μL的血液, 注入提前加入抗凝劑的EP管中輕輕吹打均勻, 4 ℃、1 000 r/min離心5 min收集血細(xì)胞, 用PBS洗兩遍, 重懸于1 mmol/L的Trizol中。誘導(dǎo)毛蚶產(chǎn)卵后分別取卵細(xì)胞、卵裂期(2細(xì)胞到8細(xì)胞階段)、囊胚期、原腸期、D型幼蟲和眼點(diǎn)幼蟲等不同發(fā)育時期樣品, 每個發(fā)育時期取5個平行樣品。此外, 將120只健康無損的毛蚶隨機(jī)分成2組, 實(shí)驗(yàn)組向海水加入副溶血弧菌溶液至終濃度為3×107CFU/mL, 對照組毛蚶在常規(guī)充氣的海水中飼養(yǎng)。在弧菌攻毒0、3、6、12、24和48 h, 隨機(jī)取5只毛蚶解剖取血細(xì)胞。上述所有樣品均在液氮中速凍后置于–80℃冰箱保存、待用。

依據(jù)毛蚶基因cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1), 利用 qRT-PCR技術(shù)檢測基因在毛蚶不同組織、胚胎和幼蟲發(fā)育時期及弧菌刺激后的表達(dá)模式, 實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個不同樣本重復(fù), 內(nèi)參基因?yàn)?8S rRNA。利用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(Vazyme, 中國)進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn), 反應(yīng)體系: 2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL、ddH2O 3.6 μL、cDNA模板1 μL、正、反向引物各0.2 μL。反應(yīng)程序: 95 ℃, 30 s; 40個循環(huán)(95 ℃, 5 s; 60 ℃, 35 s)。反應(yīng)在ABI QuantStudioTM 5 Real-Time PCR Instrument(Thermo Scientific, 美國)儀器中進(jìn)行, 利用2–ΔΔCt法分析基因的相對表達(dá)水平[19]。

1.2.5 RNA干擾分析

根據(jù)基因的ORF序列設(shè)計(jì)其小干擾RNA序列為-siRNA(5′-CGACAAGGUAGUA AUGUAU-3′), 將該序列隨機(jī)打亂順序獲得- random-siRNA(5′-AGACUAAUGGAUACUAUGG-3′)序列, 利用T7啟動子體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Tiandz, 天恩澤, 中國)并按其說明書進(jìn)行小RNA合成與純化。

將120只健康無損的毛蚶隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組, 每組各60只, 利用微量注射器分別注射6 μL的-siRNAs和-random-siRNAs至毛蚶的體腔中。在注射后的0、12、24、48和72 h, 兩組分別隨機(jī)取5只毛蚶解剖取血細(xì)胞樣品, 液氮凍存后轉(zhuǎn)入–80℃冰箱保存。經(jīng)RNA提取和反轉(zhuǎn)錄成cDNA后, 通過qRT-PCR檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組毛蚶基因的表達(dá)量, 分析-siRNA的干擾效率。

1.2.6 敲降毛蚶基因后母源性免疫基因的表達(dá)分析

敲降基因的表達(dá)后, 通過qRT-PCR技術(shù)檢測母源免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況, 這些基因包括卵黃蛋白原(vitellogenin,)、細(xì)胞黏附分子免疫球蛋白(down syndrome cell adhesion molecule,)、補(bǔ)體分子(complement,)、硫酯蛋白(thioester- containing protein,)、溶菌酶(lysozyme,)、酚氧化酶原激活因子3(phenoloxidase-activating factor 3,)以及同源基因和。用于檢測母源性免疫基因表達(dá)的特異性引物見表1, 18S rRNA作為內(nèi)參基因。

1.2.7 敲降基因的毛蚶弧菌刺激后血細(xì)胞凋亡、吞噬活性、血細(xì)胞總數(shù)和存活率的變化

將120只健康無損的毛蚶隨機(jī)分為2組, 分別注射-siRNA和-random-siRNA后12 h, 分別向兩組毛蚶養(yǎng)殖水體加入終濃度為3×107CFU/mL的副溶血弧菌, 弧菌攻毒后的0、3、6、12、24、48和72 h取樣, 每個時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對照組各隨機(jī)解剖5只毛蚶取血淋巴樣品。用預(yù)裝500 μL抗凝劑的無菌注射器收集500 μL血淋巴, 并用300目篩絹過濾。4 ℃、1 000 r/min離心5 min后倒去上清液, 重懸于1 mL的PBS緩沖液, 相同條件再次離心倒掉上清液, 重懸于1mL的PBS緩沖液中, 用制備好的血細(xì)胞工作液檢測血細(xì)胞凋亡、吞噬活性、血細(xì)胞總數(shù)。

利用Annexin V-FITC凋亡試劑盒(碧云天, 中國)檢測血細(xì)胞凋亡水平, 操作如下: 取200 μL血細(xì)胞工作液避光條件下加入195 μL的FITC結(jié)合液、5 μL FITC和10 μL碘化丙染色液(PI), 輕輕混勻, 25℃避光孵育20 min后用流式細(xì)胞儀(CytoFLEX, 美國)檢測細(xì)胞凋亡率。設(shè)置僅添加FITC或PI的單一染料對照組和不添加染料的陰性對照組, 來確定散射圖十字門的位置(圖1)。毛蚶血細(xì)胞的凋亡率用FITC陽性和PI陰性細(xì)胞的數(shù)量占細(xì)胞總數(shù)的百分比來表示[20]。

圖1 細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖中十字門的位置

注: 未添加染料的陰性對照組(a)和僅添加FITC(b)或PI(c)的單一染料對照組, 來確定散點(diǎn)圖十字門的位置

血細(xì)胞吞噬率檢測方法參考文獻(xiàn)[21]并進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整: 將200 mL血細(xì)胞工作液與20 μL 3.0%熒光微球(YG 1.0 μm, Polysciences, 美國)混勻, 在25 ℃黑暗環(huán)境中孵育1 h。后用10 μL 37%福爾馬林溶液(上海吉至生化科技有限公司)固定, 并在1 000 r/min, 4 ℃條件下離心10 min, 重懸于200 mL PBS緩沖液中并通過流式細(xì)胞儀(FL-1通道)檢測, 血細(xì)胞的吞噬率用吞噬微球的血細(xì)胞數(shù)目占血細(xì)胞總數(shù)的百分比表示(圖2)。

使用 SYBR Green I 熒光染料(Biosharp, 中國)對血細(xì)胞染色, SYBR Green I可以通過和細(xì)胞核中的DNA結(jié)合, 產(chǎn)生綠色熒光。取180 μL血細(xì)胞工作液, 加入20 μL 10×的SYBR Green I 染料, 25 ℃避光孵育1 h, 孵育完成后用移液槍吸取50 μL反應(yīng)液, 利用流式細(xì)胞儀(FL-1通道)檢測綠色熒光的細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

180只健康的毛蚶被隨機(jī)分成-siRNA和-random-siRNA注射后加弧菌組以及-siRNA注射后加PBS 3組, 每組設(shè)置3個平行, 每個平行20只毛蚶。在siRNA注射后12 h,-siRNA和-random-siRNA注射組的毛蚶在28℃的含有副溶血弧菌(3×107CFU/ mL)的海水中養(yǎng)殖。-siRNA注射組中加入等量的 PBS緩沖液(Solarbio, 中國)作為空白對照。每12 h統(tǒng)計(jì)3組毛蚶的存活個數(shù)。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示, 單因素方差分析(One-Way ANOVA)比較不同數(shù)據(jù)組間的差異, 其中<0.05表示差異顯著,<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛蚶SsC1qDC基因的克隆和序列特點(diǎn)

利用PCR和RACE克隆技術(shù)得到毛蚶基因(基因序列號: OQ264768)的cDNA全長序列為711 bp(圖3), 其中5′-UTR 21 bp, 3′-UTR 80 bp, ORF 600 bp, 共編碼199個氨基酸。的C1q結(jié)構(gòu)域?yàn)榈?6～199個氨基酸, 預(yù)測相對分子量22.64 kDa, 理論等電點(diǎn)為8.60。

圖2 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測得到的毛蚶血細(xì)胞吞噬率的FITC直方圖

a. 不加微球的陰性對照; b. 加微球的實(shí)驗(yàn)組

圖3 毛蚶SsC1qDC核苷酸及預(yù)測的氨基酸序列

注: 起始密碼子(ATG)、信號肽、Clq結(jié)構(gòu)域和終止密碼子(TAG)分別用綠色、紅色和黃色以及灰色陰影標(biāo)出

2.2 序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

將毛蚶SsC1qDC保守的C1q結(jié)構(gòu)域序列與其他物種的C1q結(jié)構(gòu)域序列對比, 結(jié)果如圖4所示, 毛蚶SsC1qDC與雙殼類SsC1qDCs的同源性高于脊椎動物。毛蚶SsC1qDC與美洲牡蠣(41.23%)CvC1qDC、硬殼蛤(39.47%)MmC1qDC的相似性較高, 與人()和家鼠()SsC1qDCs的相似性較低, 分別是28.83%、26.61%。

利用15個不同動物門的C1qDCs結(jié)構(gòu)域序列構(gòu)建NJ 進(jìn)化樹, 系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖5所示, 進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)明顯分無脊椎動物和脊椎動物2大分支。毛蚶SsC1qDC與紫貽貝()、硬殼蛤()C1qDCs聚為一支, 然后與其他貝類的C1qDCs形成無脊椎動物分支; 來自哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物和魚類的C1qDCs聚為脊椎動物分支。

圖4 C1qDCs蛋白質(zhì)的多序列比對

注: C1qDCs的物種和登錄號如下: 人(NP_852100.3); 小鼠(NP_112150.1); 長牡蠣(XP_034333860.1); 美洲牡蠣(XP_022291269.1); 紅鮑(XP_046377716.2); 歐洲平牡蠣(CAG2203397.1); 亞馬遜花鳉(XP_007577129.1); 非洲爪蟾(XP_018122782.1); 硬殼蛤(XP_045158489.1); 貝氏隆頭魚(XP_020504487.1)

2.3 毛蚶SsC1qDC基因在不同組織和胚胎時期的表達(dá)特征

如圖6a所示,基因在毛蚶所有檢測組織中均有表達(dá), 在肝胰腺、閉殼肌和鰓中表達(dá)水平較高,在雄性毛蚶性腺、斧足、外套膜和鰓中的表達(dá)量顯著高于雌性毛蚶, 而在肝胰腺中的表達(dá)量呈相反趨勢(圖6a所示)。基因在胚胎發(fā)育階段的表達(dá)模式如圖6b所示, 與卵細(xì)胞期相比,的表達(dá)從卵裂期到眼點(diǎn)幼蟲階段均顯著上調(diào)(<0.05)。

2.4 毛蚶SsC1qDC基因在副溶血弧菌刺激后的表達(dá)模式

副溶血弧菌刺激后, 毛蚶血細(xì)胞中基因的表達(dá)量如圖7所示, 與對照組相比,的表達(dá)量在3、6、24和48 h顯著升高(<0.01), 呈現(xiàn)先升高再下降而后再升高的變化趨勢, 并在6 h達(dá)到最大值(約為對照組的4.0倍)。隨后的表達(dá)水平顯著下降, 在24 h達(dá)到表達(dá)量最低, 顯著低于對照組的表達(dá)量(<0.01)。在48 h,的表達(dá)量再次顯著上調(diào)(<0.01)。

注: 利用MEGA-X軟件, 采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 重復(fù)1 000次。C1qDCs的物種和登錄號如下: 人(NP_852100.3); 小鼠(NP_112150.1); 蝙蝠(XP_0244 25520.1); 非洲爪蟾(XP_018122782.1); 斑馬魚(XP_ 009296972.1); 蝦夷扇貝(XP_021374682.1); 灘棲螺(KAG5686619.1); 太平洋牡蠣(XP_034333860.1); 長牡蠣(XP_022291269.1); 紅鮑(XP_046377716.2); 歐洲平牡蠣(CAG2203397.1); 紫貽貝(CAG2203397.1); 硬殼蛤(XP_045158489.1)

圖7 弧菌刺激后SsC1qDC的表達(dá)情況(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, n=3)

2.5 毛蚶SsC1qDC基因siRNA的干擾效率

合成的-siRNA的干擾效率見圖8。與注射隨機(jī)打亂序列的siRNA對照組相比, 毛蚶注射-siRNA后12和24 h血細(xì)胞中基因干擾效果顯著(<0.01), 干擾效率分別為64.9%和59.9%。因此, 選擇注射-siRNA后12 h的血細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

2.6 敲降SsC1qDC基因后免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況

敲降基因的表達(dá)后, 母源性免疫基因的表達(dá)顯著下調(diào)(<0.01), 而、、和的表達(dá)顯著上調(diào)(<0.01), 其中和基因的表達(dá)量約是對照組的兩倍(圖9)。

圖8 注射siRNA對SsC1qDC基因的干擾效率(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, n=3)

圖9 敲降SsC1qDC后免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, n=3)

2.7 敲降SsC1qDC基因表達(dá)對弧菌刺激后毛蚶的血細(xì)胞凋亡、吞噬活性、血細(xì)胞總數(shù)及存活率的影響

如圖10a所示, 敲降基因的表達(dá), 副溶血弧菌刺激后實(shí)驗(yàn)組毛蚶血細(xì)胞的凋亡率在6 h顯著高于對照組(<0.05), 并維持較高的凋亡水平到72 h; 實(shí)驗(yàn)組毛蚶血細(xì)胞的吞噬率在12和24 h顯著低于對照組(<0.05), 與弧菌刺激前相比, 48和72 h的實(shí)驗(yàn)組和對照組毛蚶血細(xì)胞吞噬活力均明顯下降(圖10b); 實(shí)驗(yàn)組毛蚶血細(xì)胞總數(shù)在3 h后顯著低于對照組, 與弧菌刺激前相比, 6 h后實(shí)驗(yàn)組和對照組毛蚶血細(xì)胞總數(shù)均明顯下降(圖10c); 副溶血弧菌脅迫后實(shí)驗(yàn)組的毛蚶的死亡率在24 h顯著高于對照組, 且其死亡率在36 h超過60%, 在84 h全部死亡, 而對照組毛蚶在36 h死亡率不到20%, 在84 h仍有超過20%的毛蚶存活(圖10d)。

3 討論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)雙殼貝類基因具有多種免疫功能, 在對不同病原的免疫防御反應(yīng)中起重要作用[7, 9, 11, 14, 22]。本研究從毛蚶中克隆獲得一個新的基因(命名為), 多序列比對顯示該基因編碼的蛋白不保守, 這與水生動物中C1qDC蛋白序列高度可變性的研究結(jié)果一致[14, 23]。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示與紫貽貝、硬殼蛤的C1qDC蛋白聚為一支, 然后與其他軟體動物C1qDC聚成一大支, 表明SsC1qDC是軟體動物C1qDC家族中的新成員。

基因在毛蚶所有檢測的組織中均有表達(dá), 尤其在肝胰腺和鰓等免疫組織中明顯高表達(dá), 提示該基因在毛蚶先天免疫中的潛在作用。已有的研究表明,基因在雙殼貝類不同組織中普遍表達(dá)[23-26], 通常在血細(xì)胞中高表達(dá), 然而本研究發(fā)現(xiàn)在毛蚶血細(xì)胞中表達(dá)量較低, 表明基因在不同物種組織中存在表達(dá)差異。毛蚶SsC1qDC蛋白序列存在信號肽, 推測SsC1qDC是一種分泌型蛋白, 可通過開放式循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至機(jī)體的不同組織, 以發(fā)揮其免疫功能[17]。有研究發(fā)現(xiàn)成體三疣梭子蟹()的母源性免疫基因在卵巢中的表達(dá)通常顯著高于精巢[27, 28]。本研究中,僅在雌性毛蚶肝胰腺中的表達(dá)水平顯著高于雄性毛蚶中的表達(dá), 但在雄性鰓、性腺、足和外套膜等組織中的表達(dá)顯著高于雌性, 這一結(jié)果表明可能不是母源性免疫基因。因?yàn)槟冈吹膍RNAs通常在早期胚胎發(fā)育中因?yàn)橄亩@著下調(diào)表達(dá), 待合子基因組激活后通過轉(zhuǎn)錄而顯著增加其表達(dá)量[29-31],從受精卵到D形幼蟲階段的顯著上調(diào)表達(dá)也暗示不是母源基因。

副溶血弧菌刺激后, 毛蚶的表達(dá)量在短時間內(nèi)顯著升高, 并且在6 h達(dá)到最高值, 提示SsC1qDC是一種可誘導(dǎo)的快速免疫效應(yīng)分子, 這與馬氏珠母貝()感染溶藻弧菌()后的表達(dá)模式一致[32]。通常在清除入侵的病原或外來刺激物時, C1qDCs的mRNA水平往往呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢[23, 31-34]。在本研究中, 副溶血弧菌刺激后毛蚶基因表達(dá)呈先升高后降低而后再升高的變化趨勢,基因在6 h后表達(dá)降低, 可能是負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制、抑制因子的產(chǎn)生以及清除被激活的細(xì)胞等調(diào)控作用造成基因表達(dá)下降[35, 36]。由于刺激仍然存在, 免疫細(xì)胞可能會形成免疫記憶[37], 以便更好地應(yīng)對未來的刺激, 造成48 h后基因表達(dá)的再次升高, 暗示該基因在毛蚶血液系統(tǒng)中起到免疫功能調(diào)節(jié)的作用。此外, 敲降的表達(dá), 毛蚶在副溶血弧菌刺激后的死亡率顯著高于對照組, 這一結(jié)果支持上述參與毛蚶抗弧菌反應(yīng)的觀點(diǎn)。

圖10 敲降SsC1qDC基因表達(dá)對弧菌刺激后毛蚶的血細(xì)胞凋亡率(a)、吞噬率(b)、血細(xì)胞總數(shù)(c)和毛蚶存活率(d)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, n=3)

在脊椎動物中, 補(bǔ)體經(jīng)典途徑由補(bǔ)體C1q與抗體-抗原復(fù)合物的相互作用激活并觸發(fā)C3的蛋白水解, 進(jìn)而清除入侵的病原[3, 11]。本研究中, 敲降基因可以影響補(bǔ)體C3樣基因(如和)的表達(dá), 這與脊椎動物中補(bǔ)體經(jīng)典途徑的激活的調(diào)控過程類似, 提示補(bǔ)體的經(jīng)典激活途徑是動物由低等向高等進(jìn)化過程中逐漸完善而來的。通常雙殼類動物缺乏免疫球蛋白, 因此缺少經(jīng)典的補(bǔ)體途徑, 但櫛孔扇貝()的CfC1qDC蛋白具有與免疫球蛋白IgG的結(jié)合活性[14], 推測無脊椎動物C1qDC蛋白可能通過凝集素激活途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)[38]。

本研究中, 注射-siRNA后12 h對基因的干擾效果最佳, 12 h后干擾效果下降, 可能與-siRNA在毛蚶體內(nèi)的濃度降低有關(guān), 這是因?yàn)?siRNA的生物穩(wěn)定性較差, 可能被毛蚶體內(nèi)的核酸酶分解[39]。此外, 由于細(xì)胞更新和分裂, 注射的-siRNA會逐漸稀釋, 從而降低對基因的干擾效率[40]。因此注射- siRNA后的干擾效果只能在一定時間內(nèi)觀察到, 隨后干擾效果會逐漸降低。和是典型的母源性免疫基因, 在水生動物的早期發(fā)育和入侵病原快速清除中發(fā)揮重要作用[17, 28, 41, 42]。本研究中, 除補(bǔ)體外, 敲降基因表達(dá)后, 上述免疫基因的表達(dá)均顯著下調(diào), 表明基因可能參與調(diào)控毛蚶基礎(chǔ)免疫。這與在三疣梭子蟹中的研究結(jié)果相一致, 當(dāng)敲降基因表達(dá)后, 補(bǔ)體樣基因(和)的表達(dá)顯著上調(diào)[29]。

吞噬作用作為免疫細(xì)胞的第一道防線, 具有識別、吞噬和清除外源異物或自身凋亡細(xì)胞的作用[43]。先前的研究表明, C1qDCs可以作為調(diào)理素促進(jìn)后生動物的吞噬作用[12, 32, 44]。本研究中, 敲降毛蚶基因的表達(dá)后, 副溶血弧菌刺激后血細(xì)胞的吞噬率顯著下降, 提示可能參與調(diào)節(jié)毛蚶血細(xì)胞的吞噬作用。這與馬氏珠母貝中敲降-基因表達(dá)能明顯降低血細(xì)胞吞噬作用的結(jié)果一致[23]。同時, 已有文獻(xiàn)報(bào)道雙殼類的C1qDC蛋白可參與病原的識別, 從而直接增強(qiáng)其血細(xì)胞的吞噬作用[12, 17, 22]。

在軟體動物的免疫反應(yīng)中, 細(xì)胞凋亡通過應(yīng)激信號或吞噬作用清除受損、衰老和受感染的細(xì)胞, 并引發(fā)凋亡細(xì)胞死亡[45]。本研究中, 敲降基因表達(dá)可顯著提升毛蚶血細(xì)胞的凋亡水平, 從而導(dǎo)致血細(xì)胞總數(shù)和吞噬活力的顯著降低。此外, 當(dāng)外界脅迫超過動物的耐受極限后, 隨著脅迫的持續(xù), 脅迫損傷變得不可修復(fù), 最終導(dǎo)致動物死亡[46]。本研究發(fā)現(xiàn), 敲降表達(dá), 副溶血弧菌刺激后毛蚶的死亡率顯著高于對照組, 表明在毛蚶抗弧菌感染中具有關(guān)鍵作用。

在三疣梭子蟹中的研究中發(fā)現(xiàn), PtgC1qR可在蛋白和轉(zhuǎn)錄水平上抑制其酚氧化酶原激活系統(tǒng)[29]。在本研究中, 敲降基因顯著增強(qiáng)了的表達(dá), 提示基因可能通過酚氧化酶原激活系統(tǒng)參與毛蚶的體液免疫。有關(guān)毛蚶與下游調(diào)控基因及效應(yīng)分子之間的調(diào)控關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

綜上, 本研究克隆獲得了毛蚶基因的cDNA全長序列, 并分析了該基因在響應(yīng)主要病原感染后的功能特征。的表達(dá)量從毛蚶卵細(xì)胞到眼點(diǎn)幼蟲期隨發(fā)育階段顯著增加, 該基因在成體毛蚶各組織廣泛表達(dá)且可被副溶血弧菌誘導(dǎo)高表達(dá)。敲降基因表達(dá)后, 母源免疫相關(guān)基因的表達(dá)受到顯著影響。此外, 與對照組相比, 副溶血弧菌攻毒后基因干擾實(shí)驗(yàn)組的毛蚶死亡率和血細(xì)胞凋亡水平顯著升高, 因此導(dǎo)致其血細(xì)胞總數(shù)和吞噬活力顯著降低。結(jié)果表明,基因可能參與了毛蚶抗弧菌感染免疫防御反應(yīng)。

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A novel C1q domain-containing gene () fromparticipates in the immune defense against pathogen infection

PENG Qiang1, 2, 3, WANG Jin-jing2, WANG Chun-de2, LU Xia2, LIU Xiang-quan3, LIU Gui-long4, XU Xin4, XU He5, 6, NING Jun-hao2

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China; 3. Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China; 4. Yantai Spring-Sea AquaSeed Co., Ltd., Yantai 264006, China; 5. Jiangsu Baoyuan Biotechnology Co., Ltd., Lianyungang 222144, China; 6. Jiangsu Haitai MariTech Co., Ltd., Lianyungang 222144, China)

The C1q domain-containing proteins (C1qDCs) have been demonstrated to play crucial roles in the immune responses of invertebrates, with very few reports in the ark shells. In the present study, a C1qDC gene with a typical C1q domain (designated as) was identified from the ark shelland its possible immune responses against pathogen infection was also characterized. The full-length cDNA sequence ofwas 711 bp, encoding a peptide of 199 amino acids with an N-terminal signal peptide. SsC1qDC was clustered with the C1qDCs from bivalves in the phylogenetic tree.was widely expressed in the tissues, with the high expression level in hepatopancreas and adductor muscles. The expression ofwas increased significantly from eggs to eye-point larvae stage and induced remarkably byinfection. Moreover, compared to the controls, knockdown ofresulted in a remarkable increase of mortality and apoptotic levels of ark shells afterchallenge, and thus a significant reduction of total number and phagocytosis of hemocytes. Meanwhile, knockdown ofcould significantly inhibit the expression of maternally derived immune-related genes (,,,and), while the expression of,,andwas up-regulated remarkably. Taken together, these results suggested thatperforms crucial roles in immune defense against pathogen infection in ark shells, which is of great guiding significance to the immunology of shellfish and the breeding of new disease-resistant strains.

;; expression profiles; RNA interference; immune defense

May 18, 2023

[the National Natural Science Foundation of China, No. 31972791; The Earmarked Fund for Agriculture Seed Improvement Project of Shandong Province, No. 2020LZGC016; The Scientific and Technological Project of Yantai, Shandong Province, No. 2022XCZX083; The Earmarked Fund for Shandong Modern Agro-Industry Technology Research System, No. SDAIT-14]

S917

A

1000-3096(2023)9-0040-13

10.11759/hykx20230518001

2023-05-18;

2023-08-06

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31972791); 山東省農(nóng)業(yè)良種工程資助項(xiàng)目(2020LZGC016); 山東省煙臺市科技項(xiàng)目專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2022XCZX083); 山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目(SDAIT-14)

彭強(qiáng)(1995—), 男, 河北保定人, 碩士, 主要從事貝類遺傳育種研究, E-mail: pq16603173759@163.com; 寧軍號(1988—), 男, 通信作者, 助理研究員, 主要從事貝類遺傳育種研究, E-mail: jhning@yic.ac.cn

(本文編輯: 譚雪靜)