姚 飛,王 麗

(邯鄲邯鋼醫(yī)院,河北 邯鄲 056001)

糖尿病是嚴(yán)重威脅人類生命健康的三大慢性非傳染性疾病之一,我國(guó)糖尿病患病人數(shù)接近1.4億[1]。肝臟是糖代謝的主要場(chǎng)所,長(zhǎng)期高血糖所致肝纖維化是糖尿病常見并發(fā)癥之一,是導(dǎo)致肝功能受損甚至肝衰竭的重要因素[2]。由強(qiáng)致纖維化因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)及其下游Smads家族蛋白構(gòu)成的TGF-β1/Smads信號(hào)通路對(duì)組織纖維化過程發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用,既往研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控TGF-β1/Smads通路可有效抑制糖尿病大鼠肝、腎、心肌等組織纖維化[3-5]。因此,以TGF-β1/Smads通路為作用靶點(diǎn)探索防治糖尿病后肝纖維化的新型藥物,對(duì)延緩糖尿病肝臟并發(fā)癥進(jìn)展具有重要意義。中藥苦參是《中國(guó)藥典》收錄品種,性寒味極苦,歸心、肝、大腸經(jīng),具有清熱燥濕、抗菌消炎等功效。苦參素是苦參的主要活性成分,具有降脂、抗炎、抗纖維化等多種生物學(xué)活性[6-7],其能夠通過調(diào)控TGF-β1/Smads通路對(duì)放射性肺損傷小鼠肺纖維化和大鼠心肌纖維化起到抑制作用[8-9]?？鄥⑺刈⑸湟菏且钥鄥⑺貫橹饕煞种瞥傻闹兴幾⑸鋭?本研究探討了該注射液對(duì)糖尿病大鼠肝纖維化的影響,并基于TGF-β1/Smads通路探索其作用機(jī)制,以期為臨床防治糖尿病后肝纖維化提供依據(jù)及新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 55只SPF級(jí)健康雄性SD大鼠,6周齡,體重200～230 g,由賽業(yè)(固安)生物科技有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(冀)2021-003。在室溫23～25 ℃、相對(duì)濕度45%～65%、光照黑暗12 h/12 h的控制環(huán)境分籠飼養(yǎng),飲水進(jìn)食不限。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)操作均嚴(yán)格遵循3R原則。

1.2藥物與試劑 苦參素注射液(山東新華制藥股份有限公司,批號(hào):2201A05019,規(guī)格:2 mL：0.2 g);SB431542(TGF-β1/Smads通路抑制劑)、鏈脲佐菌素、RIPA裂解液、ECL顯色液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)分別為SF7890、ST1668、P0013B、P0018S);透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)放射免疫法檢測(cè)試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所,貨號(hào)分別為HY-10088、HY-10087、HY-2385、HY-2490);HE染色、天狼星紅染色試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)分別為G1120、G1472、PC0020);TGF-β1抗體、Ⅰ型膠原蛋白(Col-Ⅰ)抗體、Ⅲ型膠原蛋白(Col-Ⅲ)抗體、β-actin抗體和IgG二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)分別為21898-1-AP、14695-1-AP、22734-1-AP、81115-1-RR、30000-0-AP);Smad3抗體、p-Smad3抗體、Smad7抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)分別為bs-3484R、bs-5459R、bs-0566R、bs-4605R、bs-41146R)。

1.3主要儀器 GA-3型血糖儀(長(zhǎng)沙三諾生物傳感股份有限公司);Aplio 500型超聲診斷儀(日本東芝公司);KZ4GC-1200型放射免疫分析儀(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司);JJ-12J型脫水機(jī)、JB-P5型石蠟包埋機(jī)(武漢俊杰有限公司);RM2125RT型石蠟切片機(jī)(徠卡上海分公司);JY300HE型電泳儀(北京君意東方有限公司);VE586型轉(zhuǎn)移槽(上海天能公司);CS 6100型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)取10只大鼠作為正常組,給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)。剩余45只大鼠參照李芬等[10]報(bào)道,采用高脂高糖飲食喂養(yǎng)4周后腹腔注射60 mg/kg鏈脲佐菌素的方法構(gòu)建糖尿病模型,腹腔注射鏈脲佐菌素24 h和72 h后檢測(cè)空腹血糖(FPG)水平均≥16.7 mmol/L即可判斷糖尿病模型制備成功。共造模成功41只,去除FPG水平最低的1只大鼠后,將剩余40只成模大鼠隨機(jī)分為模型組、苦參素注射液組、SB431542組和苦參素注射液+SB431542組,每組10只?？鄥⑺刈⑸湟航M給予50 mg/kg(參照人臨床劑量,運(yùn)用大鼠與人劑量換算公式計(jì)算所得)腹腔注射,SB431542組給予0.1 mg/kg SB431542(給藥劑量參考文獻(xiàn)[11])腹腔注射,苦參素注射液+SB431542組給予50 mg/kg苦參素注射液和0.1 mg/kg SB431542腹腔注射,模型組腹腔注射等量生理鹽水,均1次/d,連續(xù)注射4周。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1FPG水平 末次注射完成后,禁食12 h,由尾靜脈取血并通過血糖儀檢測(cè)FPG水平。

1.5.2肝臟超聲相關(guān)指標(biāo) 采用30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,通過超聲診斷儀測(cè)量距門靜脈起始部0.5～0.75 cm處內(nèi)徑[門靜脈近段內(nèi)徑(PDPV)]和1.5～2.0 cm處內(nèi)徑[門靜脈遠(yuǎn)段內(nèi)徑(DDPV)];脈沖多普勒模式下,檢測(cè)門靜脈主干血流速度(VPV);在剪切波彈性成像模式下,測(cè)定肝臟楊氏模量值。

1.5.3肝臟質(zhì)量指數(shù)(LVI) 稱量大鼠體重后,頸椎脫臼處死,開胸取肝臟,拭干血液后稱量肝臟質(zhì)量,計(jì)算LVI(肝臟質(zhì)量/體重)。

1.5.4肝組織中肝纖4項(xiàng)指標(biāo)水平 取肝臟右葉相同部位部分肝組織,加入9倍量pH7.3磷酸鹽緩沖液后進(jìn)行研磨勻漿,制備質(zhì)量比10%的肝組織勻漿液,3 500 r/min離心(離心半徑10 cm)10 min取上清,嚴(yán)格遵照放射免疫法檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行處理后,通過放射免疫分析儀檢測(cè)HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平。

1.5.5肝組織病理學(xué)形態(tài) 取肝臟右葉相同部位部分肝組織,置于10%中性福爾馬林溶液中固定72 h,經(jīng)脫水、石蠟包埋、連續(xù)4 μm厚度切片、貼片、烤片、脫蠟處理后,部分切片行HE染色,然后在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)形態(tài)。

1.5.6肝組織纖維化情況 取制備好的部分脫蠟后切片,按照天狼星紅染色試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色,然后在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織纖維化情況。天狼星紅染色切片中紅色為膠原纖維著色,采用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析,計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)(紅色面積/總面積×100%)。

1.5.7肝組織中TGF-β1/Smads通路相關(guān)蛋白及纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè):取肝臟右葉相同部位肝組織100 mg,加入1 mL RIPA裂解液,研磨勻漿,冰上靜置30 min充分裂解,12 000 r/min離心(離心半徑10 cm)30 min取上清,BCA法試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度并配平,分別取30 μg總蛋白量樣本,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白、半干法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜、5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h,滴加一抗稀釋液TGF-β1(1：1 500)、Smad3(1：1 000)、p-Smad3(1：1 000)、Smad7(1：1 000)、Col-Ⅰ(1：1 500)、Col-Ⅲ(1：1 500)、MMP-2(1：1500)、MMP-9(1：1500)、β-actin(1：2 000)4 ℃孵育過夜,洗膜后滴加二抗稀釋液IgG(1：3 000)室溫孵育1.5 h,滴加ECL顯色,采用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析條帶灰度值,與β-actin為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠FPG水平比較 模型組大鼠FPG水平明顯高于正常組(P<0.05);各藥物組大鼠FPG水平均明顯低于模型組(P均<0.05),且苦參素注射液+SB431542組明顯低于苦參素注射液組和SB431542組(P均<0.05),苦參素注射液組和SB431542組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 正常組和糖尿病各組大鼠FPG水平比較

2.2各組大鼠PDPV、DDPV、VPV、楊氏模量比較與正常組比較,模型組大鼠PDPV、DDPV、楊氏模量均明顯增高(P均<0.05),VPV明顯減慢(P<0.05)。與模型組比較,各藥物組大鼠PDPV、DDPV、楊氏模量均明顯降低(P均<0.05),苦參素注射液組和苦參素注射液+SB431542組VPV均明顯增快(P均<0.05);與苦參素注射液組和SB431542組比較,苦參素注射液+SB431542組PDPV、DDPV、楊氏模量均更低(P均<0.05),VPV均更快(P均<0.05),苦參素注射液組各指標(biāo)與SB431542組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 正常組和糖尿病各組大鼠肝臟超聲門靜脈內(nèi)徑、血流速度、楊氏模量比較

2.3各組大鼠LVI比較 模型組大鼠LVI明顯高于正常組(P<0.05);各藥物組大鼠LVI均明顯低于模型組(P均<0.05),且苦參素注射液+SB431542組明顯低于苦參素注射液組和SB431542組(P均<0.05),苦參素注射液組和SB431542組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 正常組和糖尿病各組大鼠肝臟質(zhì)量指數(shù)比較

2.4各組大鼠肝組織中HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平比較 模型組大鼠肝組織中HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平均明顯高于正常組(P均<0.05);各藥物組大鼠肝組織中HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平均明顯低于模型組(P均<0.05),且苦參素注射液+SB431542組各指標(biāo)水平均明顯低于苦參素注射液組和SB431542組(P均<0.05),苦參素注射液組各指標(biāo)水平與SB431542組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。 見表2。

表2 正常組和糖尿病各組大鼠肝組織中HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平比較

2.5各組大鼠肝臟組織病理學(xué)形態(tài)比較 正常組大鼠肝組織著色均勻,肝索排列規(guī)整,肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整;模型組大鼠肝索排列紊亂,肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,肝細(xì)胞脂肪變性、腫脹、壞死,匯管區(qū)和門靜脈周圍結(jié)締組織增多,炎性細(xì)胞浸潤(rùn);與模型組比較,各藥物組大鼠肝組織病變不同程度改善,其中苦參素注射液+SB431542組改善更明顯。見圖3。

圖3 正常組和糖尿病各組大鼠肝臟組織病理學(xué)形態(tài)(HE染色,×400)

2.6各組大鼠肝臟組織纖維化情況比較 正常組大鼠肝組織匯管區(qū)和門靜脈周圍可見少量散在膠原纖維沉積(紅色著色),膠原容積分?jǐn)?shù)為(1.39±0.17)%;模型組大鼠肝組織匯管區(qū)、門靜脈周圍和肝小葉周圍膠原纖維明顯增多,假小葉和膠原纖維隔形成,膠原容積分?jǐn)?shù)為(31.86±5.33)%,明顯高于正常組(P<0.05);與模型組比較,苦參素注射液組、SB431542組和苦參素注射液+SB431542組大鼠肝組織膠原纖維明顯減少,膠原容積分?jǐn)?shù)分別為(12.58±1.71)%,(15.04±1.92)%,(7.82±1.04)%,均明顯低于模型組(P均<0.05),且苦參素注射液+SB431542組明顯低于苦參素注射液組和SB431542組(P均<0.05),苦參素注射液組與SB431542組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) 。見圖4。

圖4 正常組和糖尿病各組大鼠肝臟組織纖維化情況(天狼星紅染色,×400)

2.7各組大鼠肝組織中TGF-β1/Smads通路相關(guān)蛋白及纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 與正常組比較,模型組大鼠肝組織中TGF-β1、p-Smad3、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白相對(duì)表達(dá)量和p-Smad3/Smad3比值均明顯升高(P均<0.05),Smad7、MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P均<0.05)。與模型組比較,各藥物組大鼠肝組織中TGF-β1、p-Smad3、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白相對(duì)表達(dá)量和p-Smad3/Smad3比值均明顯降低(P均<0.05),Smad7、MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05);與苦參素注射液組和SB431542組比較,苦參素注射液+SB431542組大鼠肝組織中TGF-β1、p-Smad3、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白相對(duì)表達(dá)量和p-Smad3/Smad3比值均更低(P均<0.05),Smad7、MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均更高(P均<0.05);苦參素注射液組各指標(biāo)與SB431542組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖5及表3。

表3 正常組和糖尿病各組大鼠肝組織中TGF-β1/Smads通路相關(guān)蛋白及纖維化相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量及比值比較

圖5 正常組和糖尿病各組大鼠肝組織中纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討 論

肝纖維化是糖尿病患者常見的并發(fā)癥之一,是引發(fā)肝硬化、肝衰竭及糖尿病患者死亡的主要原因[12]。目前,臨床上對(duì)于糖尿病肝纖維化的治療主要采取降糖調(diào)脂、保肝、調(diào)節(jié)免疫等藥物綜合治療,但仍不能有效阻斷糖尿病肝纖維化進(jìn)行性加重,仍是亟待解決的醫(yī)學(xué)難題。

細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解平衡失調(diào)所致異常沉積,是導(dǎo)致結(jié)締組織增生及組織纖維化的共同病理通路[13]。肝臟超聲和肝纖4項(xiàng)是臨床診斷肝纖維化的常用方法,肝纖維化導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)性改變,因此通過肝臟超聲檢測(cè)門靜脈內(nèi)徑、血流、肝臟彈性(楊氏模量值越高,肝臟彈性越差)等指標(biāo)能夠反映肝纖維化情況[14]。肝纖4項(xiàng)中HA為ECM主要成分,LN是肝細(xì)胞生成ECM必需非膠原糖蛋白,肝纖維化將導(dǎo)致肝細(xì)胞間隙LN大量沉積,PCⅢ和CⅣ則是早期肝纖維化標(biāo)志性指標(biāo)[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,糖尿病大鼠FPG水平、LVI、PDPV、DDPV、楊氏模量及肝組織中HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平明顯升高,VPV明顯降低;肝索排列紊亂、肝小葉結(jié)構(gòu)破壞、肝細(xì)胞脂肪變性、匯管區(qū)和門靜脈周圍結(jié)締組織增多、炎性細(xì)胞浸潤(rùn),匯管區(qū)、門靜脈周圍和肝小葉周圍膠原纖維明顯增多,假小葉和膠原纖維隔形成,與茍芳等[16]報(bào)道一致;各藥物組大鼠上述指標(biāo)和肝組織病變及纖維化情況明顯改善,且苦參素注射液+SB431542組各指標(biāo)改善更明顯,說(shuō)明苦參素注射液對(duì)糖尿病大鼠肝纖維化具有抑制作用,且作用可能與調(diào)控TGF-β1/Smads通路有關(guān)。

TGF-β超家族參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及ECM生成等多種生物學(xué)過程,其中TGF-β1亞型在哺乳動(dòng)物細(xì)胞廣泛存在且具有較強(qiáng)的促ECM生成作用,被認(rèn)為是強(qiáng)促纖維化因子[17]。Aimaiti等[18]報(bào)道TGF-β1可刺激肝星狀細(xì)胞分化為具有分泌ECM功能的肌成纖維細(xì)胞,ECM分泌對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)至關(guān)重要,但病理性ECM過度沉積將導(dǎo)致進(jìn)行性肝纖維化。Smads家族參與TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)與ECM表達(dá)調(diào)控,TGF-β1首先與Ⅰ型受體(TβR-Ⅰ)和Ⅱ型受體(TβR-Ⅱ)結(jié)合使其活化,進(jìn)而誘導(dǎo)Smad3亞型磷酸化,p-Smad3核轉(zhuǎn)位后可誘導(dǎo)Col-Ⅰ、Col-Ⅲ轉(zhuǎn)錄與表達(dá),Col-Ⅰ和Col-Ⅲ是構(gòu)成ECM的主要成分,二者所占比例之和超過90%[19-20]。Smad7為TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑,通過與TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而阻斷Smad3磷酸化與核轉(zhuǎn)位[21]。MMP-2和MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員,具有降解膠原及分解ECM的生物學(xué)作用,Yuan等[22]報(bào)道p-Smad3可下調(diào)MMP-2、MMP-9表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各藥物組大鼠肝組織中TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白相對(duì)表達(dá)量和p-Smad3/Smad3比值均明顯低于模型組,Smad7、MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組,且苦參素注射液+SB431542組各指標(biāo)改善更明顯,說(shuō)明苦參素注射液對(duì)糖尿病大鼠TGF-β1/Smads通路具有抑制作用,這可能是苦參素注射液抑制糖尿病大鼠肝纖維化的重要分子機(jī)制。

綜上所述,苦參素注射液可明顯減輕糖尿病大鼠肝纖維化,其作用機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smads通路,減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為苦參素注射液用于防治糖尿病后肝纖維化提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù),但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。