劉 凡，王雨涵，董苗萍，靳翠麗，劉 青，周曉見(jiàn)

（揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

巴夫藻（Pavlovasp.）細(xì)胞微小，繁殖速度快，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，是公認(rèn)的重要營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品[1-2]。巴夫藻中富含巖藻黃素和二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic Acid，EPA）。巖藻黃素是最豐富的海洋類(lèi)胡蘿卜素，由于優(yōu)越的抗氧化性能，在制藥、營(yíng)養(yǎng)和化妝品行業(yè)具有廣泛應(yīng)用價(jià)值[1-2]。EPA 是一種長(zhǎng)鏈n-3 多不飽和脂肪酸，在預(yù)防心血管疾病、炎癥、自身免疫性疾病等方面發(fā)揮作用，已成為全球范圍內(nèi)稀缺的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)Pavlovasp.OPMS 30543 中巖藻黃素的含量為8 mg·g-1左右，遠(yuǎn)高于作為巖藻黃素主要商業(yè)來(lái)源的大型褐藻[5]。而EPA 攝取的主要來(lái)源是魚(yú)油，魚(yú)類(lèi)中EPA 是通過(guò)食用含有EPA 的微藻在體內(nèi)累積的，而巴夫藻因其能大量合成EPA 而被認(rèn)為具有替代魚(yú)油的潛力[6]。另外，由于Pavlova屬?zèng)]有細(xì)胞壁，可以直接作為天然食品食用，而無(wú)需將細(xì)胞內(nèi)的EPA 提取出來(lái)，該優(yōu)勢(shì)也有助于培養(yǎng)巴夫藻細(xì)胞作為整體食物的商業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)程[7]。

規(guī)?；⒃迮囵B(yǎng)的生長(zhǎng)和胞內(nèi)物質(zhì)生產(chǎn)受培養(yǎng)體系中的光照和營(yíng)養(yǎng)條件影響[8]。截至目前，光照條件對(duì)巴夫藻影響的研究主要集中在光強(qiáng)度和光質(zhì)方面，對(duì)于光周期的研究比較欠缺[9-11]。而近年來(lái)針對(duì)其他微藻的研究發(fā)現(xiàn)，光周期不僅可能影響微藻的物質(zhì)生產(chǎn)、色素組成，還會(huì)影響脂肪酸組成和生物柴油質(zhì)量[12-13]。維生素作為一種微藻依賴(lài)的微量有機(jī)生長(zhǎng)因子，影響微藻的生長(zhǎng)速率，細(xì)胞大小和葉綠素含量等[14-15]。本研究以巴夫藻（Pavlovasp.）為研究對(duì)象，設(shè)置不同的光周期和維生素濃度，以雙因素實(shí)驗(yàn)研究光周期和維生素對(duì)巴夫藻生長(zhǎng)和物質(zhì)產(chǎn)量的影響，并分析脂肪酸組成以及生物柴油質(zhì)量的差異，為提高巴夫藻培養(yǎng)效益提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種來(lái)源

巴夫藻由中國(guó)海洋大學(xué)教育部海水養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。培養(yǎng)基采用鹽度為30 的海水f/2 培養(yǎng)基[9]。

1.2 培養(yǎng)條件和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 種維生素濃度1V、4V、8V（1V 為f/2配方中的維生素濃度；4V 和8V 分別是該濃度的4倍和8 倍）；3 種光周期，以24 h 為1 個(gè)周期，“光∶暗”分別為8 h∶16 h、16 h∶8 h、24 h∶0 h；共9 種處理，簡(jiǎn)記為維生素濃度+光周期，如1V 24 h∶0 h，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。250 mL 三角瓶中裝有150 mL 培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻種接種，接種后初始660 nm光密度（記作D660，以下相同）在0.03 左右。照度為（65±2）μmol·m-2·s-1，溫度（24±1）℃，培養(yǎng)14 d，每天早晚各搖動(dòng)2次。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 生長(zhǎng)情況監(jiān)測(cè)和生物量測(cè)定 每2 d 取200 μL 藻液于96 孔板中，用酶標(biāo)儀318-MC 測(cè)其D660[16]。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定最終細(xì)胞密度[17]。采用干質(zhì)量法測(cè)定最終的生物量。取120 mL 混合均勻的藻液，以3 700 r·min-1離心10 min，去上清后加入10 mL 純水，震蕩混勻后再次離心去上清，將沉淀轉(zhuǎn)移至已烘干稱(chēng)好質(zhì)量的玻璃瓶中，用冷凍干燥機(jī)FreeZone 2.5 plus，-80 ℃真空凍干24 h后稱(chēng)質(zhì)量，得到藻粉干質(zhì)量[9]。

1.3.2 葉綠素a 含量測(cè)定 培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，取5 mL 藻液，離心（4 000 r·min-1、10 min）去上清后加5 mL 丙酮4 ℃避光8 h 提取后，次日超聲（700 W，超聲5 s，間隔3 s）10 min、離心，取上清分別于470 nm、644 nm和661 nm處測(cè)定光密度，根據(jù)以下方程計(jì)算色素含量（mg·L-1）[18]。

1.3.3 巖藻黃素含量測(cè)定 取凍干后的藻粉，按1∶40（1 g 藻粉溶于40 mL 的無(wú)水乙醇）的料液比加入無(wú)水乙醇，然后在60 ℃水浴鍋中避光浸提2 h，3 700 r·min-1離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液，重復(fù)上述操作至藻粉為灰白色，用分光光度計(jì)測(cè)定提取的上清液在445 nm 處的光密度，根據(jù)公式計(jì)算巖藻黃素的含量[4]。

w：巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg·g-1）；D445：巖藻黃素提取液在445 nm 處的光密度值；N：稀釋倍數(shù)；V：粗提取液體積（mL）表示巖藻黃素質(zhì)量濃度為1 g·L-1時(shí)，光徑為1 cm 時(shí)的光吸收值；m：藻粉質(zhì)量（g）。

1.3.4 蛋白質(zhì)和多糖含量測(cè)定 培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，取5 mL 藻液，3 700 r·min-1離心10 min，去上清，加入5 mL去離子水，用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)JY92-IID冰浴超聲破碎（200 W，超聲3 s，間隔2 s）8 min，離心留上清液，用于測(cè)定蛋白質(zhì)和多糖。蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[19]，多糖含量用苯酚-硫酸法測(cè)定[20]。

1.3.5 脂肪提取與脂肪酸組成測(cè)定 采用氯仿/甲醇抽提法測(cè)定脂肪含量：取20 mg左右凍干后的藻粉，加入0.8 mL 去離子水，1 mL 三氯甲烷，2 mL 甲醇，混合均勻后，冰浴超聲破碎8 min，再加入1 mL三氯甲烷和1 mL去離子水，3 700 r·min-1離心10 min，將氯仿層轉(zhuǎn)移至烘干稱(chēng)好質(zhì)量的玻璃瓶中，常溫氮?dú)獯蹈珊鬁y(cè)其質(zhì)量[21-22]。

稱(chēng)取2 mg 脂肪，加入1 mL 正己烷，超聲10 min，加入0.2 mL 的KOH 甲醇溶液（11 g KOH 溶于100 mL 甲醇），超聲處理10 min，加入0.125 g 無(wú)水硫酸鈉，靜置后取上層，用0.22 μm 的膜過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中用于GC-MS分析[22]。

GC-MS 分析：采用Thermo Scientific ITO900 GC-MS 系統(tǒng)，色譜柱為T(mén)R-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm），載氣為He2（99.999%），流速0.8 mL·min-1，樣品以不分流形式注入，進(jìn)樣口溫度230 ℃，進(jìn)樣量1 μL。程序升溫：120 ℃恒溫1 min，然后以3 ℃·min-1升至240 ℃，保持10 min。離子源溫度為220 ℃。溶劑延遲4 min，采用全掃描質(zhì)譜模式，范圍在50～800 amu，耗時(shí)0.68 s。然后對(duì)各峰型進(jìn)行脂肪酸甲酯的鑒定[22]。

1.3.6 生物柴油性能分析 由巴夫藻的脂肪酸組成，根據(jù)公式計(jì)算生物柴油的皂化值（SV）、碘值（IV）、十六烷值（CN）、不飽和度（DU）、長(zhǎng)鏈不飽和因子（LCSF）、冷濾點(diǎn)（CFPP）[23]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本次實(shí)驗(yàn)每處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，對(duì)獲得各數(shù)據(jù)使用IBM SPSS 23軟件分析，選用一般線性模型、單因素分析和全模型對(duì)光周期、維生素濃度和二者的交互效應(yīng)進(jìn)行分析。利用Duncan 法對(duì)方差分析結(jié)果顯著的因素進(jìn)行多重比較。各分析指標(biāo)以P＜0.05 作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，并以不同字母表示比較組內(nèi)差異的顯著性[24]。

2 結(jié)果

2.1 光周期和維生素對(duì)巴夫藻生長(zhǎng)的影響

在培養(yǎng)的14 d 內(nèi)，巴夫藻在3 種光周期和3 個(gè)維生素濃度組成的9 種處理下都能生長(zhǎng)（圖1(a)）。2 d后，1V 8 h∶16 h、4V 8 h∶16 h和8V 8 h∶16 h 三個(gè)處理的生長(zhǎng)速度低于其他處理，其D660一直低于其他組，但這三個(gè)組之間差別不大（P＞0.05）。其余各組中，24 h∶0 h 的3 個(gè)組培養(yǎng)8 d 后，D660比16 h∶8 h組略低。從培養(yǎng)結(jié)束收獲的細(xì)胞密度看，細(xì)胞密度受光周期顯著影響（P＜0.05），而維生素濃度及“光周期×維生素濃度”交互作用對(duì)細(xì)胞密度影響不大（P＞0.05）（圖1(b)、表1）。在3 個(gè)維生素濃度下，8 h∶16 h 光周期處理的細(xì)胞密度都顯著低于其他2個(gè)光周期，而16 h∶8 h 和24 h∶0 h 兩個(gè)光周期的細(xì)胞密度差別不大，其中1V 16 h∶8 h處理的細(xì)胞密度為52.19×106mL-1,顯著高于1V 8 h∶16 h 的45.98×106mL-1和1V 24 h∶0 h的49.58×106mL-1。因此，巴夫藻生長(zhǎng)主要受光周期影響，短周期8 h∶16 h 不利于巴夫藻生長(zhǎng)，長(zhǎng)周期16 h∶8 h 和24 h∶0 h 尤其是16 h∶8 h有利于巴夫藻生長(zhǎng)。

表1 光周期和維生素濃度對(duì)巴夫藻的影響雙因素方差分析Table 1 Two-factor ANOVA analysis of effects of photoperiod and vitamin concentration on Pavlova sp.

圖1 光周期和維生素對(duì)巴夫藻生長(zhǎng)和收獲時(shí)細(xì)胞密度的影響Fig.1 Effects of photoperiod and vitamin concentration on growth and cell density of Pavlova sp.

2.2 光周期和維生素對(duì)巴夫藻生產(chǎn)能力的影響

由表1 可知，光周期對(duì)多糖以外的所有物質(zhì)產(chǎn)量都有顯著影響（P＜0.05），而維生素濃度及“光周期×維生素濃度”交互作用對(duì)生物量干質(zhì)量和巖藻黃素產(chǎn)量有顯著影響（P＜0.05）。

圖2（a）表示巴夫藻培養(yǎng)14 d 后收獲的生物量干質(zhì)量情況。雙因素方差分析結(jié)果表明，光周期、維生素濃度及“光周期×維生素濃度”交互作用都對(duì)干質(zhì)量有顯著影響（表1）。在3 種維生素濃度下，24 h∶0 h的干質(zhì)量在3個(gè)光周期處理中都是最小的，其次是8 h∶16 h光周期，16 h∶8 h光周期的干質(zhì)量是3個(gè)光周期中最高的，在3個(gè)維生素濃度下分別達(dá)到501.50、500.90、497.57 mg·L-1，因此16 h∶8 h 是生物量干質(zhì)量生產(chǎn)的最佳光周期。在8 h∶16 h 光周期下，維生素濃度升高時(shí)干質(zhì)量降低，從1V 維生素濃度時(shí)的450.60 mg·L-1，至8V 維生素濃度時(shí)干質(zhì)量降到最低值419.37 mg·L-1。在16 h∶8 h 光周期下，干質(zhì)量不隨維生素濃度發(fā)生變化，當(dāng)光周期為24 h∶0 h 時(shí)，也是8V 維生素濃度的干質(zhì)量最低，只有361.80 mg·L-1。因此，1V 是最佳的維生素濃度，而1V 16 h∶8 h 的干質(zhì)量又比1V 24 h∶0 h 提高了38.6%，所以生物量干質(zhì)量生產(chǎn)的最佳條件是1V 16 h∶8 h。

如圖2（b）所示，葉綠素a 含量既受維生素濃度影響，又受光周期影響?！肮庵芷凇辆S生素濃度”交互作用對(duì)葉綠素a 含量影響不顯著（表1）。維生素濃度為1V 時(shí)，隨光照時(shí)間延長(zhǎng)，葉綠素a含量增高，最高1.18 mg·L-1出現(xiàn)在1V 24 h∶0 h。而在維生素濃度為4V 和8V 時(shí)，16 h∶8 h 光周期下的葉綠素a含量普遍高于8 h∶16 h 光周期下的含量，也高于24 h∶0 h 光周期下的葉綠素a 含量。光周期對(duì)葉綠素a含量的影響在維生素為8V時(shí)表現(xiàn)突出，16 h∶8 h光周期下葉綠素a 含量高，最高0.10 mg·L-1出現(xiàn)在8V 16 h∶8 h。

光周期、維生素濃度及“光周期×維生素濃度”交互作用對(duì)巖藻黃素生產(chǎn)影響顯著（表1）。如圖2（c）所示，在3種維生素濃度下，24 h∶0 h的巖藻黃素含量在3 個(gè)光周期中都是最小的，為2.7～3.0 mg·g-1，其次是16 h∶8 h 光周期，含量為3.8～4.2 mg·g-1，8 h∶16 h 光周期的巖藻黃素是3 個(gè)光周期中最高的，為5.5～6.2 mg·g-1，因此8 h∶16 h 是巖藻黃素積累的最佳光周期。巖藻黃素產(chǎn)量取決于生物量干質(zhì)量和巖藻黃素含量，由于8 h∶16 h 光周期下巖藻黃素含量最高，24 h∶0 h 光周期下巖藻黃素最低，巖藻黃素產(chǎn)量同樣也是這樣的規(guī)律（圖2(d)）。在24 h∶0 h 光周期下巖藻黃素產(chǎn)量受維生素濃度影響不顯著（P＞0.05），但在8 h∶16 h 和16 h∶8 h 兩個(gè)光周期下，維生素濃度為8V 時(shí)的巖藻黃素產(chǎn)量都比維生素濃度為1V 和4V 時(shí)高，因此8V 是巖藻黃素生產(chǎn)的最佳維生素濃度。8V 8 h∶16 h 的巖藻黃素產(chǎn)量達(dá)到2.60 mg·L-1，是所有處理中最高值，是1V 24 h∶0 h 的2.08倍。因此，巖藻黃素生產(chǎn)的最佳條件是8V 8 h∶16 h。

在脂肪生產(chǎn)方面，雙因素方差分析結(jié)果表明，光周期對(duì)脂肪占比和脂肪產(chǎn)量有顯著影響（P＜0.05），維生素濃度及“光周期×維生素濃度”交互作用對(duì)脂肪占比和脂肪產(chǎn)量影響不大（P＞0.05）（表1）。如圖2（e）所示，在3 種維生素濃度下，24 h∶0 h 的脂肪占比均優(yōu)于其他光周期，最高值為8V 24 h∶0 h，脂肪占比達(dá)到30.18%；16 h∶8 h 光周期的脂肪占比也比較高，而8 h∶16 h 光周期的脂肪占比最低。而脂肪產(chǎn)量的高低取決于生物量干質(zhì)量和脂肪占比的乘積。如圖2（f）所示，在3 種維生素濃度下，8 h∶16 h光周期的脂肪產(chǎn)量在3 個(gè)光周期中都是最低的，16 h∶8 h 和24 h∶0 h 兩個(gè)光周期下的脂肪產(chǎn)量差別不顯著，但在維生素濃度為8V 時(shí)，16 h∶8 h 的脂肪產(chǎn)量顯著高于24 h∶0 h，達(dá)到123.87 mg·L-1，是所有處理中的最高值。

雙因素方差分析結(jié)果表明，光周期顯著影響蛋白質(zhì)產(chǎn)量（P＜0.05），維生素濃度及“光周期×維生素濃度”交互作用對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)量影響不大（P＞0.05）（表1）。如圖2（g）所示，在維生素濃度1V 和4V時(shí)，16 h∶8 h 的蛋白質(zhì)產(chǎn)量均顯著高于其他兩個(gè)光周期（P＜0.05）。1V 16 h∶8 h 的蛋白質(zhì)產(chǎn)量達(dá)55.54 mg·L-1，是所有處理中的最高值，比1V 24 h∶0 h提高了30.8%。

巴夫藻多糖產(chǎn)量在17～27 mg·L-1之間，雙因素方差分析結(jié)果表明，光周期、維生素濃度及“光周期×維生素濃度”交互作用對(duì)多糖產(chǎn)量影響都不顯著（P＞0.05）（表1，圖2(h)）。

2.3 光周期和維生素對(duì)巴夫藻脂肪酸組成和生物柴油質(zhì)量的影響

巴夫藻主要含6種脂肪酸（表2），其中飽和脂肪酸有C14:0、C16:0和C18:0，不飽和脂肪酸有C16:1(n-7)、C18:1(n-9)和C20:5(n-3)（EPA）。含量最高的脂肪酸為C16:0，在總脂肪酸中的質(zhì)量占比為36%～41%之間；其次是C16:1(n-7)，占比在32%～35%之間；排在第三位的是占比在11%～13%之間的C18:1(n-9)；EPA 作為唯一的多不飽和脂肪酸，占比在5%～15%之間。C14:0 和C18:0 兩種飽和脂肪酸的占比之和不超過(guò)6%。雙因素方差分析結(jié)果表明，光周期對(duì)巴夫藻6 種脂肪酸占比都有顯著影響，維生素濃度對(duì)脂肪酸組成影響不大，“光周期×維生素濃度”交互作用只對(duì)脂肪酸C14:0占比有顯著影響（表3）。

表2 光周期和維生素濃度對(duì)巴夫藻脂肪酸組成的影響Table 2 Effects of photoperiod and vitamin concentration on fatty acid composition of Pavlova sp.%

表3 光周期和維生素濃度對(duì)巴夫藻脂肪酸組成的影響雙因素方差分析Table 3 Two-factor ANOVA analysis of photoperiod and vitamin concentration on fatty acid composition of Pavlova sp.

如表2所示，含量最高的飽和脂肪酸C16:0的含量受光周期顯著影響，在3種維生素濃度下，24 h∶0 h的C16:0平均占比為40.66%，顯著高于其他兩個(gè)光周期。C16:1(n-7)的含量也受光周期的顯著影響，在3種維生素濃度下，24 h∶0 h和16 h∶8 h光周期下的占比顯著高于8 h∶16 h。在8V維生素濃度下，16 h∶8 h的C18:1(n-9)占比顯著高于8 h∶16 h，但在3 個(gè)光周期下變動(dòng)范圍不足2%。在3 種維生素濃度下，EPA含量都符合8 h∶16 h＞16 h∶8 h＞24 h∶0 h的規(guī)律，且差異顯著，即在8 h∶16 h光周期下最適合EPA積累。1V 8 h∶16 h 的EPA 占比為15.46%，是1V 24 h∶0 h的EPA 占比的2.28 倍。C18:0 含量符合24 h∶0 h＞16 h∶8 h＞8 h∶16 h 的規(guī)律，且差異顯著。光周期對(duì)C14:0 占比有顯著影響（P＜0.05），維生素濃度對(duì)其占比無(wú)顯著影響（P＞0.05），“光周期×維生素濃度”交互作用對(duì)其占比有顯著影響（P＜0.05）。

雙因素方差分析結(jié)果表明，光周期顯著影響巴夫藻脂質(zhì)生產(chǎn)的生物柴油性能各指標(biāo)，維生素濃度及“光周期×維生素濃度”交互作用對(duì)生物柴油性能影響不大（表4）。

表4 光周期和維生素濃度對(duì)巴夫藻脂質(zhì)的生物柴油性能的影響雙因素方差分析Table 4 Two-factor ANOVA analysis of effects of photoperiod and vitamin concentration on the biodiesel performance of lipid derived from Pavlova sp.

巴夫藻脂質(zhì)的生物柴油各指標(biāo)見(jiàn)表5。生物柴油特性如十六烷值（CN）、運(yùn)動(dòng)黏度、氧化穩(wěn)定性等，取決于原料微藻生物柴油生產(chǎn)過(guò)程中使用的脂肪酸。不同光周期和維生素濃度條件下培養(yǎng)的巴夫藻生物柴油的CN 值有明顯區(qū)別，CN 值最低為44.55，出現(xiàn)在8 h∶16 h 光周期下，該光周期下的CN值顯著低于其他兩個(gè)光周期。而CN 值最高值為53.98，出現(xiàn)在24 h∶0 h 光周期，該光周期下的CN 值普遍高于其他兩個(gè)光周期。不飽和度（DU）和碘值（IV）通常用來(lái)評(píng)價(jià)生物柴油的氧化穩(wěn)定性，二者的趨勢(shì)往往是一致的，都是其值越低，生物柴油的氧化穩(wěn)定性越高[23]。DU 和IV 的值都符合24 h∶0 h ＜16 h∶8 h ＜8 h∶16 h的規(guī)律，最低值出現(xiàn)在24 h∶0 h光周期，其次是16 h∶8 h光周期，而DU和IV最高值出現(xiàn)在8 h∶16 h。冷濾點(diǎn)（CFPP）通常用于預(yù)測(cè)生物柴油在低溫下的流動(dòng)性能[23]。在9 種組合培養(yǎng)條件下的巴夫藻CFPP 都低于5 ℃，其中冷濾點(diǎn)最低值為-0.41 ℃，出現(xiàn)在8 h∶16 h 光周期下，該光周期下的CFPP 值顯著低于其他兩個(gè)光周期。16 h∶8 h光周期下CFPP 略高，最高值出現(xiàn)在24 h∶0 h 光周期。4V 24 h∶0 h 條件下生產(chǎn)的巴夫藻生物柴油CN值最高，DU 和IV 最低即氧化穩(wěn)定性最好，但冷濾點(diǎn)略高即低溫流動(dòng)性相對(duì)差一些。

表5 光周期和維生素濃度對(duì)巴夫藻脂質(zhì)的生物柴油性能的影響Table 5 Effects of photoperiod and vitamin concentration on the biodiesel performance of lipid derived from Pavlova sp.

3 討論

3.1 光周期和維生素對(duì)巴夫藻生長(zhǎng)和生物量積累的影響

微藻光合過(guò)程強(qiáng)烈依賴(lài)培養(yǎng)體系的光相關(guān)變量[13,22]。光合代謝由光期和暗期組成，光期產(chǎn)生的化學(xué)能用于暗期碳固定途徑[25,12-13]。研究者們普遍認(rèn)為光合過(guò)程需要光暗反應(yīng)匹配才能高效形成光合產(chǎn)物[25,13,22]。適當(dāng)?shù)墓?暗周期可提高光合系統(tǒng)的電子轉(zhuǎn)移速度，并且在規(guī)?；囵B(yǎng)中有助于調(diào)節(jié)微藻培養(yǎng)物的溫度、降低設(shè)備運(yùn)行的能源消耗[12-13,22]。本研究中，生產(chǎn)眾多優(yōu)質(zhì)物質(zhì)的巴夫藻，無(wú)論在生長(zhǎng)還是物質(zhì)生產(chǎn)能力方面都表現(xiàn)出明顯的光周期效應(yīng)。16 h∶8 h 處理組在生長(zhǎng)方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，培養(yǎng)14 d 結(jié)束時(shí)得到了最高的細(xì)胞密度、干質(zhì)量、脂肪產(chǎn)量和蛋白質(zhì)產(chǎn)量，而連續(xù)光照在生長(zhǎng)和物質(zhì)產(chǎn)量方面并沒(méi)有優(yōu)勢(shì)。實(shí)際上，海洋浮游植物對(duì)光周期的響應(yīng)具有很大的物種特異性。已有研究表明，赫氏圓石藻（Emiliania huxleyi）、細(xì)孔圓顆石藻（Cyclococcolithus leptoporus）、布朗葡萄藻（Botryococcus braunii）和斜生四鏈藻（Tetradesmus obliquus）在連續(xù)光照下生長(zhǎng)較快，而球等鞭金藻（Isochrysis galbana)、金色藻（Chrysochromulinasp.）和遠(yuǎn)洋顆石藻（Coccolithus pelagicus）在連續(xù)光照下生長(zhǎng)較差或完全不生長(zhǎng)[34-35]；兩株顆石藻(Coccolithus)在14∶10光周期下生長(zhǎng)較快，結(jié)合新綠藻（Neochloris conjuncta），陸生新綠藻（N.terrestris），德克薩斯新綠藻（N.texensis）在12 h∶12 h 光周期下生長(zhǎng)更好，還有的微藻的生長(zhǎng)速度受光周期的影響不顯著[27]。造成微藻對(duì)光周期響應(yīng)有差異的原因，可能與藻種的敏感性有關(guān)，與藻種自然分布的區(qū)域有關(guān)，還可能與微藻的細(xì)胞組成有關(guān)[26]。四列藻（Tetraselmis tetrathele）在光期為6～20 h 之間時(shí)藻細(xì)胞密度、葉綠素a和蛋白質(zhì)含量等指標(biāo)均達(dá)到較高水平，但在光期少于4 h 和超過(guò)20 h 時(shí)，則生長(zhǎng)受到明顯抑制[28]。因此，從種間特異性上看，巴夫藻應(yīng)屬于中長(zhǎng)光照種類(lèi)，光周期16 h∶8 h較適合巴夫藻生長(zhǎng)，并生產(chǎn)較大生物量干質(zhì)量。維生素供給在微藻規(guī)模培養(yǎng)中起著至關(guān)重要作用，然而，關(guān)于這些微量營(yíng)養(yǎng)素對(duì)微藻生長(zhǎng)、多樣性和生產(chǎn)力的影響的資料很少[14-15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，維生素濃度對(duì)于巴夫藻生物量干質(zhì)量有影響，當(dāng)維生素濃度為1V 時(shí)，能獲得最高的生物量干質(zhì)量，而且維生素與光周期有交互作用，在1V 和長(zhǎng)光照的16 h∶8 h光周期條件下，能使生物量干質(zhì)量達(dá)到最高。

3.2 光周期和維生素對(duì)巴夫藻巖藻黃素生產(chǎn)的影響

本研究使用的巴夫藻能產(chǎn)生大量的巖藻黃素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)6.21 mg·g-1，產(chǎn)量能達(dá)到2.60 mg·L-1。這與Kanamoto 等[5]篩選得到的最優(yōu)巴夫藻株P(guān)avlovasp.OPMS 30543 在f/2 培養(yǎng)基中獲得的巖藻黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.48 mg·g-1、產(chǎn)量0.73 mg·L-1相比，分別是其4.20 倍和3.56 倍。造成這兩株巴夫藻產(chǎn)量差距的原因，可能與培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)不同有關(guān)，分別是14 d 和7 d，有可能Pavlovasp.OPMS 30543 巖藻黃素的積累還不夠充分；還與光周期不同有關(guān)，分別是8 h∶16 h 和12 h∶12 h，本研究已證明短光照有利于巖藻黃素積累；還與維生素濃度相關(guān)，分別是8倍和1 倍濃度，而高濃度維生素有利于巖藻黃素積累；藻株本身的差異也至關(guān)重要。因此，本研究的巴夫藻是生產(chǎn)巖藻黃素的優(yōu)質(zhì)藻株。因?yàn)閹r藻黃素能夠捕獲光能并保護(hù)光合器官，光照條件被認(rèn)為是影響微藻合成巖藻黃素的最重要因素[25]。然而，光照條件對(duì)于巖藻黃素積累的影響研究主要集中在光強(qiáng)和光質(zhì)方面[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，光周期對(duì)巴夫藻的色素組成包括葉綠素a和巖藻黃素含量均有顯著影響。維生素濃度為1V 時(shí)，24 h∶0 h 時(shí)葉綠素a含量最高；但是當(dāng)維生素濃度升高時(shí)，16 h∶8 h 光周期下葉綠素a 含量最高。巖藻黃素和葉綠素a 共同組成光捕獲復(fù)合物，但二者的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，吸收的光譜不同，前者吸收藍(lán)光和綠光，后者吸收紅光和藍(lán)光[29]。巖藻黃素與葉綠素a 對(duì)光周期的反應(yīng)也不同，始終是光照時(shí)間最短的8 h∶16 h 光周期下含量最高。維生素濃度對(duì)于巴夫藻的巖藻黃素積累有影響，提高維生素濃度至8V 時(shí)，能提高巖藻黃素含量。而且維生素與光周期有交互作用，在8V 和短光照的8 h∶16 h 光周期條件下，能使巖藻黃素含量達(dá)到最高。因此，8V 8 h∶16 h 是巖藻黃素積累的最佳條件。

3.3 光周期和維生素對(duì)巴夫藻脂肪酸組成和生物柴油質(zhì)量的影響

光周期調(diào)控能提高巴夫藻的脂質(zhì)產(chǎn)量并對(duì)脂肪酸組成和生物柴油質(zhì)量產(chǎn)生影響。巴夫藻脂質(zhì)含量在光周期24 h∶0 h下最高，能達(dá)到30.18%；脂質(zhì)產(chǎn)量在8V 16 h∶8 h獲得最大值，達(dá)到123.87 mg·L-1。巴夫藻中含量最豐富的兩種脂肪酸C16:0 和C16:1(n-7)，在24 h∶0 h光周期下含量都是最高值。脂肪酸組成的變動(dòng)引起生物柴油質(zhì)量的變化，高含量的飽和脂肪酸（SFA）導(dǎo)致CN的增加，充足的單不飽和脂肪酸（MUFA）顯著改善低溫下的流動(dòng)性能[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，巴夫藻的SFA+MUFA 占總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%～90%，是優(yōu)質(zhì)的生物柴油燃料生產(chǎn)的原料[30-31]。生物柴油指標(biāo)中，CN 值越高，生物柴油的點(diǎn)火性能越好，發(fā)動(dòng)機(jī)性能越好[18,31]。歐洲標(biāo)準(zhǔn)EN 14214 和ASTM 美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)D6751 的生物柴油參考標(biāo)準(zhǔn)分別為CN ＞51 和CN ＞47[18]。反映生物柴油氧化穩(wěn)定性的DU 和IV，均基于單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的比例，DU 和IV 越低則氧化穩(wěn)定性越好[23,32]。本研究中，4V 24 h∶0 h 條件下生產(chǎn)的巴夫藻生物柴油，CN 值最高可達(dá)53.98，其CN 值大于51，優(yōu)于歐洲標(biāo)準(zhǔn)EN 14214 和ASTM 美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)D6751，說(shuō)明該條件下生產(chǎn)的巴夫藻可以作為生物柴油的直接原料，同時(shí)其DU 和IV 最低，即氧化穩(wěn)定性也是最優(yōu)的。另外，大量研究表明Pavlovasp.還可以產(chǎn)生大量的C20:5(n-3)（EPA）[3,6,33]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)巴夫藻脂肪酸主要由16:0、C16:1(n-7)組成，并含有大量的C20:5(n-3)，這與燕燕等[33]報(bào)道的綠色巴夫藻的脂肪酸組成相似。而且光周期會(huì)影響EPA 的積累，在8 h∶16 h 光周期下最適合積累EPA，在脂肪酸中占比最高能達(dá)到15.46%。與光周期相比，維生素濃度對(duì)于巴夫藻的脂肪生產(chǎn)影響不大，脂質(zhì)含量、脂肪酸組成及EPA 含量均不受維生素濃度影響。

綜上所述，巴夫藻作為巖藻黃素、EPA和優(yōu)質(zhì)生物柴油的生產(chǎn)者，在規(guī)?；囵B(yǎng)中根據(jù)產(chǎn)品應(yīng)用要求，通過(guò)合理調(diào)控光周期和維生素濃度，可進(jìn)一步提高其物質(zhì)生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì)。