袁禹惠，龔 埜，黃 巖，李松林,2

（1.上海海洋大學農業(yè)農村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學水產科學國家級試驗教學示范中心，上海 201306）

n-3 長鏈多不飽和脂肪酸（LC-PUFA）中的C22:6n-3（DHA）和C20:5n-3（EPA）是海水魚的必需脂肪酸[1]，在維持細胞膜結構和功能的完整性方面起著重要作用[2]。DHA大量存在于脊椎動物神經組織的磷脂中，對于神經系統(tǒng)及感覺器官的正常發(fā)育至關重要[3-4]；EPA 可作為環(huán)氧合酶(COX)-2 和5-脂氧合酶(5-LOX)的底物，轉化為炎癥性較低的類二十烷酸[5-6]。然而，因脂肪酸酯化形成磷脂的?；负娃D酰酶不具備底物的特異性，DHA 和EPA 在參與磷脂合成過程中存在一定的競爭性[2]。因此，飼料n-3 LC-PUFA 總量及適宜的DHA 與EPA 質量比（下稱“DHA/EPA”）對于海水魚正常生長發(fā)育均至關重要。已證實飼料DHA/EPA 在尖吻鱸（Lates calcarifer）[7]、大黃魚（Larmichthys crocea）[8]等海水魚中的重要性。目前，在海水仔稚魚研究中，主要通過生物餌料營養(yǎng)強化的方式確定其適宜DHA/EPA[9-11]，但該營養(yǎng)強化方式難以形成營養(yǎng)素濃度梯度，且生物餌料通常營養(yǎng)不均衡。因此，探究海水仔稚魚適宜DHA/EPA應以微顆粒飼料為載體。

斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）是我國東南沿海重要的養(yǎng)殖魚類，有關其營養(yǎng)學研究主要集中在幼魚階段[12-14]。已有n-3 LC-PUFA 對斜帶石斑魚稚魚生長發(fā)育影響的研究[15]，但未見關于適宜DHA、EPA 比例的報道。本研究通過調整微顆粒飼料中DHA/EPA，探究DHA/EPA 變化對斜帶石斑魚稚魚生長性能、脂肪酸組成及消化酶活力的影響，為開發(fā)高效的斜帶石斑魚微顆粒飼料提供支撐。

1 材料方法

1.1 實驗飼料

以白魚粉、蝦粉、磷蝦粉和水解魚粉為主要蛋白源，以DHA 純化油、EPA 純化油、花生四烯酸（20:4n-6，ARA）純化油、棕櫚酸甘油酯及大豆卵磷脂為主要脂肪源，通過調整DHA、EPA 純化油含量，配制5 種等氮（粗蛋白質量分數58%）等脂（粗脂肪質量分數16%）的微顆粒飼料，其中DHA/EPA分別為0.82、1.28、1.67、2.00 和2.33。飼料配方詳見表1。

表1 實驗飼料配方及營養(yǎng)組成（干基）Table 1 Formulation and chemical composition of experimental diets(dry matter basis) %

將所有原料粉碎，過孔徑150 μm 篩網，隨后按照配方比例，通過逐級放大的方式進行充分混勻，與充分混合后的脂肪源（DHA 純化油、EPA 純化油、ARA 純化油、棕櫚酸甘油酯及大豆卵磷脂）混勻，加水混合，利用單螺桿擠壓制粒機造粒，于50 ℃鼓風干燥箱中干燥，破碎，過篩，分為2個規(guī)格：規(guī)格250～380 μm 飼料用于投喂孵化后29～45 日齡的斜帶石斑魚稚魚，規(guī)格380～550 μm 飼料用于45 日齡后稚魚養(yǎng)殖。飼料于-20 ℃保存?zhèn)溆?，脂肪酸組成由氣相色譜儀測定（表2）。

表2 實驗飼料脂肪酸占總脂肪酸質量分數Table 2 Mass fraction of fatty acid to total fatty acid of the experimental diets

1.2 養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖實驗在上海海洋大學&廣東恒興飼料實業(yè)股份有限公司聯(lián)合實驗室控溫循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中開展，實驗用斜帶石斑魚稚魚（22 日齡）購自湛江市商業(yè)育苗廠。使用初孵鹵蟲投喂2 d 后，搭配微顆粒配合飼料進行轉餌，培養(yǎng)至稚魚后，投喂配合飼料比例90%以上。30日齡時，稚魚禁食24 h，按照每桶300尾的密度平均分置到15個600 L養(yǎng)殖桶中。同時，隨機取100尾用于計算初始體質量（70.2±0.2）mg，隨機取30 尾魚用于測量初始體長（1.21±0.03）cm，重復測定3次。設置5個實驗組，每組3個重復。養(yǎng)殖期4周，每天07:00、10:00、13:00、16:00和18:00 5次表觀飽食投喂。養(yǎng)殖實驗期間自然光照。養(yǎng)殖用水經海綿和珊瑚沙過濾、紫外線燈消毒后的系統(tǒng)內循環(huán)水，每日換水量5%。實驗過程中連續(xù)曝氣，溶解氧質量濃度≥6 mg/L，pH為7.2±0.2，水溫（28±1）℃，鹽度為30±1，氨氮質量濃度＜0.1 mg/L。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖實驗結束后，稚魚禁食24 h 后，統(tǒng)計成活率（SR，%）、終末體質量（FBM，g），計算特定生長率（SGR，%/d）：SR=終末魚數/初始魚數；SGR=（ln終末體質量-ln初始體質量）/飼養(yǎng)時間。

每桶隨機取魚30尾，測定全魚基本營養(yǎng)成分及脂肪酸組成；取魚10 尾，剖取胃及腸道測定消化酶活力，剖取肌肉用于脂肪酸分析。所有樣品用液氮速凍后置于-80°C冰箱保存。

1.4 生化分析

據AOAC[16]方法測定實驗飼料及全魚的基本營養(yǎng)成分。待測樣品水分含量通過105 ℃烘箱烘干至恒重測定，粗蛋白質含量用凱氏定氮法測定，粗脂肪含量利用索氏抽提法測定。全魚及肌肉樣品冷凍干燥后進行脂肪酸甲酯化處理，參照Metcalfe等[17]方法，利用氣相色譜儀測定脂肪酸相對含量。

1.5 消化酶活力測定

用組織粉碎機將所取組織樣品（胃和腸道）按質量（g）體積（mL）比1∶9 在預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）中充分研磨，以3 000 r/min 離心10 min（4 ℃），取上清液用于消化酶活力測定。以牛血紅蛋白為底物，采用福林酚法測定胃蛋白酶活力[18]，每mg 組織蛋白每分鐘分解牛血紅蛋白產生1 μg酪氨酸相當于1個活力單位U（37 ℃）。以苯甲酰精氨酰對硝基苯胺（BAPNA）為底物，參照Holm等[19]方法測定胰蛋白酶活力，每mg組織蛋白每分鐘分解BAPNA 產生1 μg 硝基苯胺相當于1 個活力單位U（37 ℃）。以可溶性淀粉為底物參照Métais等[20]方法測定淀粉酶活力，每mg組織蛋白在37 ℃、30 min 能完全水解淀粉1 mg 稱為一個活力單位U。采用聚已烯醇橄欖油法測定脂肪酶活力[21]，每mg組織蛋白在37 ℃、每min水解脂肪產生1 μg分子脂肪酸為一個活力單位U。利用考馬斯亮藍法測定組織可溶性蛋白含量[22]，用于比活力計算。

1.6 數據處理

實驗結果以平均值±標準誤（Mean ± SEM）表示。利用SPSS19.0 軟件，將數據進行單因素方差分析，當處理之間差異顯著（P＜0.05）時，采用Duncan's檢驗進行多重比較。

2 結果

2.1 飼料DHA/EPA 對斜帶石斑魚稚魚生長性能的影響

表3 可見：隨著飼料DHA/EPA 的升高，各組間稚魚成活率無顯著變化（P＞0.05），終末體質量及特定生長率先升后降（P＜0.05）。其中，1.67組中石斑魚稚魚終末體質量及特定生長率顯著高于其余各組（P＜0.05））。

表3 飼料DHA/EPA對斜帶石斑魚稚魚生長性能的影響Table 2 Effects of dietary DHA/EPA on growth performance of larval Epinephelus coioides

2.2 飼料DHA/EPA對斜帶石斑魚稚魚體成分的影響

表4 可見：隨著飼料中DHA/EPA 的升高，石斑魚稚魚全魚粗蛋白含量先升后降，1.67 組稚魚粗蛋白含量顯著高于其他各組（P＜0.05），但該組稚魚全魚水分含量顯著低于其他各組（P＜0.05）；稚魚全魚粗脂肪的含量隨著飼料中DHA/EPA 的升高而升高，2.33組顯著高于其他組（P＜0.05）（表4）

表4 飼料DHA/EPA對斜帶石斑魚稚魚體成分質量分數（濕基）的影響Table 4 Mass fraction of nutrients to whole body(wet basis)of larval Epinephelus coioides fed on different DHA/EPA diets %

2.3 飼料DHA/EPA 對斜帶石斑魚稚魚全魚及肌肉脂肪酸組成的影響

各處理間全魚及肌肉脂肪酸數據詳見表5 及表6。全魚及肌肉中EPA含量隨著飼料DHA/EPA的升高顯著降低，而DHA 含量卻顯著升高（P＜0.05）。同時，飼料DHA/EPA 的升高顯著提高了石斑魚稚魚肌肉以及全魚中m(DHA)/m(EPA)（P＜0.05），未顯著影響全魚及肌肉組織中n-3 LC-PUFA 的含量（P＞0.05）。

表5 不同飼料DHA/EPA斜帶石斑魚稚魚全魚脂肪酸占總脂肪酸質量分數Table 5 Mass fraction of fatty acid to total fatty acid in whole body of larval Epinephelus coioides fed on different DHA/EPA diets

表6 不同飼料DHA/EPA斜帶石斑魚稚魚肌肉脂肪酸占總脂肪酸質量分數Table 6 Mass fraction of fatty acids to total fatty acid in muscle of larval Epinephelus coioides fed on different DHA/EPA diets

2.4 飼料DHA/EPA 對斜帶石斑魚稚魚消化酶活力的影響

表7 可見：隨著飼料DHA/EPA 的升高，石斑魚稚魚胃蛋白酶、腸胰蛋白酶、腸脂肪酶活力呈先升后降的變化趨勢，1.67組胃蛋白酶、腸胰蛋白酶升至最高（P＜0.05），1.28、1.67、2.00 組腸道脂肪酶活力顯著高于其他組（P＜0.05）；而隨飼料DHA/EPA 的升高，石斑魚稚魚腸道淀粉酶活力呈降低趨勢，2.33組降至最低（P＜0.05）。

表7 不同飼料DHA/EPA斜帶石斑魚消化酶活力Table 7 Digestive enzyme activity of larval Epinephelus coioides fed on different DHA/EPA diets U/mg

3 討論

n-3 LC-PUFA 對于海水魚正常生長發(fā)育具有重要的作用。仔稚魚因其生長快速，對營養(yǎng)物質需求更高，且對營養(yǎng)素感知更為敏感[23]。在真鯛（Pagrus major）[24]及金頭鯛（Sparus aurata）[10]等海水仔稚魚的研究中發(fā)現，DHA 的促生長作用優(yōu)于EPA。然而，對于牙鲆（Paralichthys olivaceus）[25]和大菱鲆（Scophthalmus maximus）[26]而言，DHA/EPA變化對其生長無顯著影響。飼料DHA/EPA 的升高卻顯著降低了金頭鯛仔稚魚的生長[27]。本研究中，盡管飼料DHA/EPA 對于斜帶石斑魚稚魚存活率無顯著影響，但1.67 組稚魚生長性能顯著高于其他各組，表明斜帶石斑魚稚魚對飼料中DHA/EPA 有特定需求。

本研究中，各處理組石斑魚稚魚脂肪酸組成與飼料脂肪酸組成類似。然而，脂肪酸數據分析發(fā)現，全魚和肌肉中DHA的相對含量明顯高于飼料中DHA 含量，表明DHA 優(yōu)先被保留。類似結果已在金頭鯛[28]、歐洲鱸（Dicentrarchus labrax）[29-30]及虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[31]等研究中證實。然而，全魚和肌肉EPA 相對含量卻明顯低于飼料，表明EPA較DHA 更易被利用或分解[32]。EPA 相較于DHA 優(yōu)先被利用很可能是本研究中飼料DHA/EPA 升高導致全魚脂肪含量增加的重要原因之一。與DHA 變化趨勢類似，肌肉中ARA（20:4n-6）的相對含量明顯高于飼料。盡管LC-PUFA 在維持細胞膜的正常發(fā)育及其完整性中起重要作用[1]，DHA 以及ARA 在肌肉組織中優(yōu)先保留的特性意味著其作為必需脂肪酸在維持細胞正常功能中的作用。

消化系統(tǒng)在仔稚魚階段開始發(fā)育，仔稚魚對營養(yǎng)物質吸收能力與消化酶活力有關[33]，消化酶活力也可以作為衡量仔稚魚消化系統(tǒng)發(fā)育的重要指標之一。本研究發(fā)現，飼料中DHA/EPA 的變化顯著影響了消化酶活力。在仔稚魚發(fā)育過程中，胃蛋白酶表達晚于其他消化酶[34]，且胃蛋白酶的分泌在一定程度上反映出仔稚魚向幼魚轉變的過程[35]。因此，本研究中的胃蛋白酶變化趨勢意味著飼料中適宜的DHA/EPA 并可促進斜帶石斑魚稚魚消化系統(tǒng)發(fā)育。一般而言，飼料蛋白質含量及氨基酸組成會影響胰蛋白酶活力[36]，而本研究飼料的上述指標卻不存在差異。因此，本研究胰蛋白酶活力變化是由飼料DHA/EPA 變化所致，表明適宜的DHA/EPA 看促進胰腺發(fā)育。脂肪酶可水解甘油三脂為甘油二酯、單酰甘油及游離脂肪酸，其在中性脂消化中起重要作用[37-38]。本研究中，脂肪酶活力變化同樣體現了飼料DHA/EPA 變化對消化系統(tǒng)發(fā)育的影響。一般而言，淀粉酶活力降低是肉食性魚類仔稚魚階段消化系統(tǒng)發(fā)育成熟的重要指標之一[39-40]，本研究中，淀粉酶活力隨飼料DHA/EPA的升高而降低。綜上，本研究中石斑魚稚魚消化酶活力的變化證實，適宜飼料DHA/EPA可有效促進其消化系統(tǒng)的發(fā)育。

4 結論

飼料適宜的DHA/EPA 可顯著提高斜帶石斑魚稚魚的生長性能，影響機體組成及脂肪酸組成，促進消化系統(tǒng)的發(fā)育。斜帶石斑魚稚魚微顆粒飼料DHA/EPA 應保持在1.67，這為其高效微顆粒飼料的開發(fā)提供理論支撐。

感謝廣東恒興飼料實業(yè)股份有限公司謝瑞濤博士在養(yǎng)殖實驗以及取樣過程中的幫助。