張振遠(yuǎn)，滕環(huán)瑜，潘 影，王召軍，張洪映，閆筱筱，崔 紅

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市鄭東新區(qū)平安大道218號(hào) 450046

植物葉表微生物包括細(xì)菌、真菌、線蟲和病毒等［1-2］，其種類和密度受外界環(huán)境，如溫度、濕度和紫外線輻射強(qiáng)度的影響［3-4］，同時(shí)也與植物葉片自身的形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分和防御機(jī)制密切相關(guān)［5-6］。煙草葉面微生物在煙株生長發(fā)育［7］、逆境應(yīng)答［8］、病蟲害防御［9］以及煙葉品質(zhì)形成［10-11］等方面發(fā)揮著重要作用。因而，對(duì)煙草葉面微生物群落結(jié)構(gòu)的深入研究具有重要意義。煙草葉片腺毛濃密、分泌物豐富，建立和優(yōu)化煙草葉面微生物收集體系是進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)。植物葉面微生物收集效果與洗脫液的種類和濃度有關(guān)，洗脫液的選擇因植物種類不同而異。常用的洗脫劑為無菌水或磷酸緩沖液，但由于葉面腺毛及其分泌物的存在增加了葉片的疏水性和黏性［12-13］，部分微生物與葉面組織整合形成生物膜［14］，導(dǎo)致對(duì)煙草葉面微生物的洗脫難度增加。吐溫-80（Tween-80）作為非離子表面活性劑，具有增溶、濕潤、乳化、減少細(xì)菌附著、抑制生物膜形成以及與真菌孢子具有相容性等特點(diǎn)［15-17］。Lukasik等［18］比較了PBS、甘氨酸、吐溫-80 溶液及含有吐溫-80 的PBS 緩沖液對(duì)草莓和番茄種子表面微生物的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)0.1%吐溫-80 的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗脫的微生物數(shù)量最多。與其他植物相比，煙草表面腺毛豐富，分泌旺盛，物質(zhì)含量豐富，分泌物主要化學(xué)成分為類西柏烷類二萜化合物、賴百當(dāng)二萜和蔗糖酯等成分［19］，占鮮煙葉的0.5%～10%［20］。所以，如果忽視煙草葉面腺毛分泌物的黏性、腺毛本身的疏水性、微生物與葉面組織整合形成生物膜等因素，使用無菌水或磷酸緩沖液作為洗脫劑，將會(huì)影響微生物的收集效果，從而影響后續(xù)研究的結(jié)果。為此，以高分泌型普通煙草T.I.1068 為材料，以不同濃度的吐溫-80作為洗脫液進(jìn)行葉面微生物的收集，并通過平板培養(yǎng)和擴(kuò)增子測(cè)序分析，研究了吐溫-80對(duì)煙草的葉面微生物洗脫效果的影響，旨在為煙草葉面微生物群落結(jié)構(gòu)分析和調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

普通煙草高分泌型煙草種質(zhì)資源T.I.1068［21］。T.I.1068 種子來源于美國北卡州立大學(xué)牛津煙草試驗(yàn)站，于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院溫室進(jìn)行漂浮育苗，待煙苗生長至10片真葉期時(shí)，選取葉長約10 cm、葉寬約5 cm的煙葉用于試驗(yàn)。

1.2 微生物的收集

試驗(yàn)以無菌水為對(duì)照，添加表面活性劑吐溫-80，配置不同體積比的吐溫-80作為洗脫劑，并于120 ℃高溫高壓滅菌。設(shè)置吐溫-80處理濃度（體積分?jǐn)?shù)）為0（無菌水對(duì)照，CK）、2%、8%、10%、15%、20%和30% 。取完整煙葉3 片，稱量，葉基部封蠟。每1.0 g煙葉加入100 mL無菌洗脫劑于無菌三角瓶中，室溫?fù)u床，200 r/min 振蕩20 min，獲得微生物洗脫液，用于微生物培養(yǎng)及DNA提取。每處理3次重復(fù)。

1.3 葉面微生物的培養(yǎng)計(jì)數(shù)

采用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法［22］對(duì)每克煙葉表面微生物數(shù)量進(jìn)行估算，培養(yǎng)皿直徑為90 mm。細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)：在無菌操作臺(tái)中吸取1 mL洗脫液，稀釋20倍，吸取1 mL 稀釋液均勻涂布于LB 培養(yǎng)基，無菌操作臺(tái)中吹干表面，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h 后對(duì)培養(yǎng)皿上細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。真菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)：在無菌操作臺(tái)中吸取1 mL洗脫液，稀釋10倍，吸取1 mL稀釋液均勻涂布于PDA 培養(yǎng)基（附加0.2 g/L 氯霉素），表面吹干，并于28 ℃條件下培養(yǎng)24 h后觀察計(jì)數(shù)。每個(gè)濃度處理分別設(shè)置3次重復(fù)。計(jì)算公式：

1.4 微生物總DNA的洗脫及檢測(cè)

SDS-CTAB 法提取［23］：用0.2 μm 孔徑濾膜收集全部洗脫液中的微生物，將濾膜樣品于2 mL 無菌離心管研磨，加200 μL 磷酸鹽提取緩沖液，再加入160 μL 20%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）十二烷基磺酸鈉（SDS）渦旋振蕩2 min混勻，68 ℃下水浴2 h，每隔15 min顛倒混勻10次。以13 000 ×g的轉(zhuǎn)速在4 ℃下離心（KH30R-Ⅱ，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至2 mL 離心管。加入20 μL 5 mol/L KAc 和66.8 μL PEG8 000，在-20 ℃下放置15 min。以13 000 ×g在4 ℃條件下離心15 min，用500 μL 2×CTAB 重懸沉淀，68 ℃水浴1 h。加入480 μL 氯仿和20 μL 異戊醇，輕柔混勻，靜置5 min；以13 000 ×g在4 ℃下離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一2 mL 離心管中，加入350 μL 的異丙醇，混勻后室溫下放置15 min，以13 000 ×g在4 ℃下離心15 min，得到沉淀DNA。將沉淀DNA用70 %（體積分?jǐn)?shù)）乙醇洗滌2 次，風(fēng)干，并溶于50 μL TE 緩沖溶液，于4 ℃下保存?zhèn)溆?。將所提取的微生物總DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并采用微量紫外分光光度計(jì)（NanoDrop one，賽默飛世爾科技公司）檢測(cè)DNA濃度。

1.5 微生物多樣性分析

對(duì)細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)和真菌ITS rDNA ITS1區(qū)進(jìn)行測(cè)序。所用引物、擴(kuò)增區(qū)域及引物序列，見表1。

表1 擴(kuò)增區(qū)域、擴(kuò)增引物和引物序列Tab.1 Amplification region，primer and primer sequence

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2017 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表繪制。對(duì)高通量測(cè)序有效數(shù)據(jù)在97%水平上進(jìn)行OTU 聚類，并利用Greengene 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋。利用平臺(tái)（https：//magic.novogene.com）進(jìn)行門水平的群落結(jié)構(gòu)、等級(jí)稀釋曲線、PCA主成分分析和科水平的Metastats2物種差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度吐溫-80洗脫對(duì)煙草葉面微生物活性的影響

采用平板培養(yǎng)方法對(duì)不同方法洗脫的微生物進(jìn)行培養(yǎng)和觀察。分別取稀釋10 倍和20 倍的洗脫液1 mL 均勻涂布于PDA 和LB 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h 和12 h后進(jìn)行菌落密度估算，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，煙草葉面可培養(yǎng)微生物以細(xì)菌為主，但無論是細(xì)菌還是真菌，與無菌水（CK）洗脫相比，吐溫-80 洗脫的可培養(yǎng)微生物菌落密度均顯著提高。對(duì)細(xì)菌而言，隨著吐溫-80 濃度的逐漸升高，可培養(yǎng)微生物菌落密度逐漸提高，15%吐溫-80處理的菌落密度最高，是CK 的2 倍左右，隨后急劇下降，30%吐溫-80 則低于CK。對(duì)真菌而言，隨著吐溫-80 濃度的逐漸升高，可培養(yǎng)微生物菌落密度逐漸提高，10%吐溫-80的洗脫率最高，是CK的3倍左右，隨后菌落密度降低，30%吐溫-80的洗脫率與CK持平。

圖1 吐溫-80對(duì)煙草葉面微生物活性的影響Fig.1 Effects of Tween-80 on cultivable microorganisms

2.2 不同濃度吐溫-80 洗脫對(duì)煙草葉面微生物總DNA濃度的影響

瓊脂糖凝膠電泳以及DNA濃度檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。凝膠電泳結(jié)果顯示，不同處理微生物總DNA條帶成彌散狀，隨著吐溫-80濃度的增加，DNA濃度呈增加趨勢(shì)（圖2B）。隨著吐溫-80 濃度的增加，DNA 條帶亮度和濃度也逐漸增加。0～15%吐溫-80處理所收集的DNA 濃度呈線性增長，20%～30%吐溫-80處理所收集的DNA濃度基本不變（圖2A），說明對(duì)微生物的洗脫率達(dá)到最高。

圖2 吐溫-80對(duì)微生物DNA提取濃度的影響Fig.2 Effects of Tween-80 on the concentration of microbial DNA extraction

2.3 吐溫-80洗脫對(duì)煙草葉面微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響

從微生物總DNA 濃度檢測(cè)結(jié)果（圖2A）可以看出，30%吐溫-80 洗脫所獲得的微生物量最高，但平板培養(yǎng)結(jié)果顯示此時(shí)的微生物菌落密度為最低。說明過高濃度的吐溫-80 處理對(duì)微生物培養(yǎng)有一定抑制作用，不利于功能微生物的篩選和利用。因此，選用20%吐溫-80 和無菌水處理收集的微生物樣本，通過16SrDNA和ITSrDNA擴(kuò)增子測(cè)序分析吐溫-80洗脫對(duì)葉面微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響。

2.3.1 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析

通過16SrDNA 擴(kuò)增子測(cè)序，利用重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)短序列拼接、質(zhì)控、去嵌合體，共得到255 867條有效序列。在97% 相似度水平對(duì)樣品序列進(jìn)行OTU 聚類，共獲得OTU 數(shù)目1 022個(gè)，CK（0 濃度）有932 個(gè)，20%吐溫-80 有979 個(gè)，二者共有889個(gè)（圖3A）。通過豐度等級(jí)曲線對(duì)CK和20%吐溫-80 處理的物種豐富度和物種均勻度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)20%吐溫-80 處理所洗脫的OTU 數(shù)目最多，且等級(jí)曲線的形狀相對(duì)平滑，表明20%吐溫-80處理所收集的細(xì)菌樣本的物種豐富度和均勻度較高（圖3B）?；贠TU 水平采用PCA 分析了CK 和20%吐溫-80處理的煙草葉面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，如圖3C所示。第1 主成分PC1 和第2 主成分PC2對(duì)樣品的方差貢獻(xiàn)率分別為35%與19%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)54%，且20%吐溫-80與CK在PC軸上分布存在差異，表明CK 和20%吐溫-80 洗脫煙葉表面獲得細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)存在差異。20%吐溫-80 處理收集的微生物在門水平進(jìn)行優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落分析結(jié)果如圖3D所示，20%吐溫-80 與CK 洗脫所收集的細(xì)菌在門水平的群落組成一致，均由變形菌門（proteobacteria）、厚壁菌門（firmicutes）、放線菌門（actinobacteria）和擬桿菌門（bacteroidota）等組成，且細(xì)菌門水平的物種相對(duì)豐度差異較大。20%吐溫-80 在科水平進(jìn)行Metastats2 物種差異分析，20%吐溫-80 處理對(duì)黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）、黃桿菌科（Xanthobacteraceae）、鞘脂菌科（Sphingomonadaceae）、紅菌科（Rhodobacteraceae）、根瘤菌科（Rhizobiaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、草酸桿菌科（Oxalobacteraceae）、莫拉菌科（Moraxellaceae）和叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）共9個(gè)細(xì)菌科具有較高的洗脫率（圖3E）。

圖3 吐溫-80對(duì)細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effects of Tween-80 on bacterial diversity and community structure

2.3.2 真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析

通過ITSrDNA 擴(kuò)增子測(cè)序，利用重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)短序列拼接、質(zhì)控、去嵌合體，共得到396 415條有效序列。在97% 相似度水平對(duì)樣品序列進(jìn)行OTU 聚類，共獲得OTU 數(shù)目279 個(gè)，CK 有268 個(gè)，20%吐溫-80 有256 個(gè)，二者共有244個(gè)（圖4A）。通過豐度等級(jí)曲線（Rank abundance curve）對(duì)CK和20%吐溫-80處理的物種豐富度和物種均勻度進(jìn)行分析。結(jié)果（圖4B）表明，20%吐溫-80所洗脫的OTU 數(shù)目較少，但曲線的形狀相對(duì)平滑，表明20%吐溫-80 所收集的真菌樣本的物種豐富度有所降低，但物種均勻度升高?；贠TU水平采用PCA 分析了20%吐溫-80 與CK 煙草葉面真菌群落結(jié)構(gòu)變化，如圖4C所示。第1 主成分PC1 和第2主成分PC2 對(duì)樣品的方差貢獻(xiàn)率分別為35%與23%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)58%，且20%吐溫-80 與CK 在PC軸上的分布存在差異，表明CK和20%吐溫-80洗脫煙葉表面獲得的真菌群體結(jié)構(gòu)存在差異。20%吐溫-80在門水平進(jìn)行優(yōu)勢(shì)真菌群落分析結(jié)果如圖3D所示，20%吐溫-80 與CK 的門水平群落結(jié)構(gòu)均由子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）等組成，且20%吐溫-80 與CK 間真菌門水平的物種相對(duì)豐度變化明顯。對(duì)20%吐溫-80 進(jìn)行科水平Metastats2 差異分析發(fā)現(xiàn)，20%吐溫-80 對(duì)于法夫酵母科（Phaffomycetaceae）和白粉菌科（Erysiphaceae）的洗脫效果較好（圖4E）。

圖4 吐溫-80對(duì)真菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effects of Tween-80 on fungal diversity and community structure

3 討論

本研究中對(duì)吐溫-80 處理收集煙草葉面微生物的效果及影響進(jìn)行探索發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，提高吐溫-80的濃度有助于提高微生物的洗脫率，這與Lukasik 等［18］研究結(jié)果一致，但Lukasik 洗脫種子表面微生物時(shí)選用的最佳吐溫-80 濃度僅為0.1%，與本研究中所選20%吐溫-80處理相差較大，推測(cè)可能是種子相比煙葉表面黏性弱，對(duì)微生物的黏著能力較低所致。不同品種的煙草分泌能力也不盡相同，對(duì)微生物的黏著性可能存在差異。本研究中尚未解決不同腺毛密度的煙草品種葉面微生物適合的吐溫-80濃度，需要在后期的試驗(yàn)中完善。

吐溫-80是非離子表面活性劑，不具有殺菌的能力，但是選用的吐溫-80產(chǎn)品一般純度較低存在較多的雜質(zhì)，且吐溫-80經(jīng)過自身氧化和高溫滅菌后會(huì)產(chǎn)生殺菌物質(zhì)，如過氧化物、甲醛和甲酸等［24］，因此推測(cè)可能會(huì)出現(xiàn)對(duì)微生物的殺滅作用，造成20%吐溫-80所洗脫的菌落密度低于對(duì)照。測(cè)序結(jié)果表明，細(xì)菌相比真菌具有更多的OTU，這與葉面微生物類群中細(xì)菌通常有著較高的生物量和物種多樣性一致，所洗脫的煙草葉面微生物的優(yōu)勢(shì)菌門，與前人研究結(jié)果一致［9，25-26］。

20%吐溫-80洗脫的真菌物種豐富度有所降低，推測(cè)可能是吐溫-80 對(duì)真菌樣本中高豐度的白粉菌洗脫效果較好，造成低豐度物種比例降低，從而使低豐度物種檢出率下降。因此，在后續(xù)研究中將增加真菌樣本的個(gè)數(shù)或測(cè)序通量來提高真菌低豐度物種的檢出率，以明確吐溫-80對(duì)真菌的洗脫效果。針對(duì)煙草葉面環(huán)境的特殊性，吐溫-80洗脫劑可有效收集煙草葉面微生物，在微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析中，可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適濃度的吐溫-80作為煙草葉面微生物的洗脫劑。

4 結(jié)論

吐溫-80 對(duì)煙草葉面微生物的洗脫和收集具有促進(jìn)作用，從而影響微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)，改變優(yōu)勢(shì)菌群的組成。過高濃度的吐溫-80 處理會(huì)影響微生物的活性，造成可培養(yǎng)微生物菌落密度降低，15%吐溫-80 處理有利于葉面細(xì)菌的收集和培養(yǎng)，10%吐溫-80 處理有利于葉面真菌的收集和培養(yǎng)，20%吐溫-80處理收集的微生物總DNA含量最高。