杜文珍，李元敬，吳佳玲，陳思羽，姜亮，劉剛，謝寧

研究報告

絲狀真菌AA11家族裂解多糖單加氧酶基因的鑒定和功能研究

杜文珍1，李元敬2，吳佳玲1，陳思羽1，姜亮1，劉剛1，謝寧1

1. 深圳大學生命與海洋科學學院，深圳市微生物基因工程重點實驗室，深圳 518060 2.華南師范大學材料與新能源學院，汕尾 516622

輔助活性蛋白家族(auxiliary activity family，AA family)中的裂解多糖單加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase, LPMO)能催化纖維素、幾丁質(zhì)和淀粉等多種難降解碳水化合物的氧化解聚。盡管目前對LPMO的酶學研究較多，但對基因失活的研究卻鮮有報道。本研究利用同源重組方法定點敲除絲狀真菌中AA11家族的5個基因()、()、()、()和()，分別構(gòu)建了單突變體ΔPaLPMO11A (ΔA)、ΔPaLPMO11B (ΔB)、ΔPaLPMO11C (ΔC)、ΔPaLPMO11D (ΔD)和ΔPaLPMO11E (ΔE)，然后通過遺傳雜交構(gòu)建所有多基因突變體。通過在不同碳源培養(yǎng)基上的表型分析、DAB和NBT染色以及纖維素酶活測定分析-野生型菌株與突變型菌株在生長速率、有性生殖、氧化應激和纖維素降解能力等方面的差異，揭示基因在菌株的生長發(fā)育和木質(zhì)纖維素降解過程中的作用。實驗結(jié)果表明，在不同纖維素碳源上，ΔBΔCΔE、ΔAΔBΔCΔE、ΔAΔCΔDΔE和ΔAΔBΔCΔDΔE突變型菌株的有性生殖能力降低，其余突變型菌株的孢子萌發(fā)效率、生長速率和生殖能力幾乎沒有差異。PaLPMO11家族5個基因的同時缺失，會導致菌株利用各種碳源的能力明顯降低、生長速率降低、孢子萌發(fā)率降低、子實體數(shù)減少、部分子實體發(fā)育異常、壽命縮短和降解纖維素的能力顯著下降，但仍有野生型45%以上的總纖維素酶活力。上述結(jié)果表明，基因可能參與的生長發(fā)育、有性生殖、衰老和纖維素降解過程。本研究為系統(tǒng)闡述絲狀真菌中木質(zhì)纖維素降解的調(diào)控機制提供參考。

絲狀真菌；；；基因敲除；木質(zhì)纖維素降解

人類使用的大多數(shù)燃料和化學品資源都來源于煤炭、石油和天然氣等不可再生的化石能源。隨著全球經(jīng)濟的快速發(fā)展和工業(yè)化規(guī)模的不斷擴大，化石能源的過度消耗，引發(fā)了不可再生化石能源儲量枯竭、環(huán)境污染和全球變暖等一系列問題，給全球環(huán)境保護和可持續(xù)發(fā)展帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)。此外，不可再生化石燃料資源預計在未來40～50年內(nèi)耗盡[1]，因此，勘探和開發(fā)可持續(xù)、生態(tài)友好和儲量大的可再生生物質(zhì)資源已成為近年來的熱點問題，有望克服因消耗化石燃料帶來的環(huán)境污染和能源短缺等問題。--木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生資源之一，它的年產(chǎn)量約為2×1011噸[2]，是獲得生物乙醇和替代化石燃料的理想可再生候選者之一。然而，迄今為止，大部分木質(zhì)纖維素資源尚未得到有效地利用，木質(zhì)纖維素資源的利用率甚至未能達到其總量的5%[3]。木質(zhì)纖維素主要由木質(zhì)素、纖維素和半纖維素組成，其中纖維素含量占比通常最高[4]。纖維素是生物圈中含量最豐富的有機多糖，是獲取潔凈能源如基于乙醇的生物燃料和高附加值化學品的主要原料[5]。因而，提高纖維素的有效利用率是提高木質(zhì)纖維素資源利用率的重點。在自然界中，許多生物都能有效地降解利用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，其中能分泌碳水化合物活性酶的絲狀真菌被認為是關(guān)鍵的初級降解者[6]。

裂解多糖單加氧酶(lytic polysaccharide monoo-xy-genase，LPMO)是銅依賴的氧化還原酶，該酶通過氧化裂解頑固多糖鏈表面，使多糖易于處理以便進一步酶促作用并最終降解[7]。LPMO廣泛存在于真菌、細菌、病毒和昆蟲中，能催化纖維素、幾丁質(zhì)和淀粉等多種難降解頑固碳水化合物的氧化解聚。其在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(carbohydrate-active enzymes database，CAZy) (http://www.cazy.org/)中被劃分到 AA9～AA11和AA13～AA16這7個不同的輔助活性家族(auxiliary activity family，AA family)中[8]。不同家族LPMO的氨基酸序列差異較大，但所有LPMO整體拓撲結(jié)構(gòu)相似，催化結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白樣的反向平行β-三明治核心結(jié)構(gòu)，活性位點位于該較為平坦的核心區(qū)域上，由兩個高度保守的組氨酸與金屬銅離子螯合形成的T型“組氨酸支架(histidine brace)”構(gòu)成，其中一個組氨酸是氨基末端殘基，另一個為側(cè)鏈組氨酸[9,10]。Hemsworth等[11]發(fā)現(xiàn)來自米曲霉()AA11家族的LPMO(AoAA11)對晶體幾丁質(zhì)具有活性，表明AoAA11具有與AA9和AA10的LPMO相似的三維結(jié)構(gòu)，包括核心的反向平行β-三明治結(jié)構(gòu)和具有保守“組氨酸支架”的銅活性位點。Wang等[12]從富士鐮刀菌()中獲得截斷形式的LPMO11新型酶，稱為FfAA11。該酶對α-幾丁質(zhì)和β-幾丁質(zhì)以及龍蝦殼均表現(xiàn)出氧化活性。近年來，Rieder等[13]發(fā)現(xiàn)煙曲霉()中的AA11B不具有假定的幾丁質(zhì)活性，而對N-乙酰葡糖胺的可溶性低聚物具有催化活性。St?pamo等[14]發(fā)現(xiàn)AfAA11A雖然缺少碳水化合物結(jié)合模塊，但對α-和β-幾丁質(zhì)仍具有相當大的催化能力。結(jié)合以上研究可知，盡管LPMO11被假定具有幾丁質(zhì)酶活性，但AA11家族的部分成員對幾丁質(zhì)卻沒有催化活性。因此，LPMO11可能在真菌生理學中發(fā)揮著除幾丁質(zhì)酶催化活性外的其他作用[14]。

迄今為止，雖然已經(jīng)有大量關(guān)于LPMO酶學的研究，但對于真菌中基因失活的研究卻鮮有報道。此外，尚未有利用缺失基因的突變體進行復雜多糖如纖維素、淀粉或幾丁質(zhì)的降解研究，因此其功能尚未得到充分的研究。通過比對41種常見真菌的基因組發(fā)現(xiàn)，是含有最多降解木質(zhì)纖維素蛋白酶類基因的子囊真菌[15]，又因其生命周期短，易于培養(yǎng)和進行分子遺傳操作，因此它是用來研究木質(zhì)纖維素降解的良好模式生物[16]。盡管LPMOs在真菌界中廣泛存在，但屬于AA11家族的LPMO尚未得到充分研究。中5個基因功能仍有待進一步被揭示與研究，本研究以期為闡明LPMO11在真菌生理學中發(fā)揮的不同作用提供一定的參考價值。

本研究以為實驗菌株，利用同源重組方法分別構(gòu)建5個基因和缺失單突變型菌株，通過遺傳雜交獲得所有多基因突變體。通過突變型菌株與野生型菌株在生長速率、有性生殖、氧化應激和纖維素降解等方面的差異性分析，揭示AA11家族的基因在中的明確作用與功能，為系統(tǒng)闡述絲狀真菌中木質(zhì)纖維素降解的調(diào)控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

(1) 菌株和質(zhì)粒：野生型菌株(WT)Δmus51::phleoR菌株(用腐草霉素抗性基因代替基因編碼序列所得到的菌株。基因具有修復真菌DNA突變的功能，敲除可顯著提高同源重組效率[17])、Δmus51:: HygroR菌株、Δmus51:: NourR菌株和Δmus51:: GeneR菌株。質(zhì)粒pBC-Geneticin、pBC-Hygromycin、pBC- Phleomycin和pBC-Nourseothricin分別用于突變體構(gòu)建。

(2) 培養(yǎng)基：菌株培養(yǎng)條件以及M2基礎培養(yǎng)基等常用培養(yǎng)基的配置方法可在Genome Project (http://podospora.i2bc.paris-saclay.fr/ methods.php)檢索得到。木質(zhì)纖維素培養(yǎng)基：在M2培養(yǎng)基的基礎上，分別用木質(zhì)素(lignin powder)、木屑(wood shaving)和微晶纖維素(avicel)等量取代糊精作為碳源，制備3種不同成分的木質(zhì)纖維素培養(yǎng)基。

(3) 主要試劑和儀器：抗生素遺傳霉素(geneticin)和腐草霉素(phleomycin)購自南京都萊生物技術(shù)有限公司；諾爾斯菌素(nourseothricin)購自上海吉至生化科技有限公司；潮霉素(hygromycin)、羥甲基纖維素鈉(CMC-Na)和其他常用試劑均購自上海生工生物工程股份有限公司；Go Taq?DNA Polymerase、Ex Taq?DNA Polymerase、PrimeSTAR?Max DNA Polymerase均購自TaKaRa；2×Phanta?Max Master Mix(Dye Plus)和Plasmid Mini Kit均由南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產(chǎn)；Gel Extraction Kit和Cycle-Pure kit購自OMEGA；溶壁酶購自Sigma；M5 Fungal Genomic DNA Kit購于北京聚合美生物科技有限公司；二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒和氯化硝基四氮唑藍(nitro blue tetrazolium，NBT)試劑購自Solarbio，4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)和4-硝基苯基-β-D-纖維二糖(pNPC)均由Aladdin生產(chǎn)。

1.2 PaLPMO11生物信息學分析

從基因組數(shù)據(jù)庫和CAZy數(shù)據(jù)庫中獲得5個假定的基因、、、和，分別命名為和，對應的氨基酸序列為PaLPMO11A (XP_001906381.1)、PaLPMO11B (XP_001912736.1)、PaLPMO11C (XP_001911580------.1)、PaLPMO11D (XP_001911666.1)和PaLPMO11E (XP_001909751.1)。在CAZy數(shù)據(jù)庫和NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中檢索得到7條來自真菌子囊菌和輪蟲的LPMO11蛋白序列。分別為：(BAE61530.1)、(XP 748042.1)、(CCT67099.1)、(EAA31701.1)、(XP 750980.1)、(EAA35129.1)和(UJR20201.1)。通過分子進化遺傳學分析軟件MEGA 11.0對12個蛋白質(zhì)序列進行分析建樹，使用muscle算法對編譯后的序列進行比對，并手動調(diào)整，采用MEGA 11.0中的鄰近法(neighbor-joining method)構(gòu)建基于這些序列的系統(tǒng)進化樹，利用自展法(bootstrap)設置1000次重復檢驗。使用I-TASSER在線網(wǎng)站(https://zhanglab. ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)和UCSF Chimera等軟件對5個目的基因的蛋白三級結(jié)構(gòu)和保守氨基酸位點進行預測。

1.3 構(gòu)建PaLPMO11家族突變體

運用Split-marker[18]方法在WT菌株中分別敲除和五個目的基因。構(gòu)建AA11家族5個單突變型菌株技術(shù)原理如圖1所示。常規(guī)PCR分別擴增出目的基因上下游的同源臂片段(約1000 bp)以及相對應的抗性標記基因片段。其中選用nourseothricin標記，選用hygromycin B標記，和選用geneticin標記，選用phleomycin標記。融合PCR對常規(guī)PCR純化后得到的目的基因上下游的同源臂片段和抗性標記基因片段進行融合連接，構(gòu)建敲除表達盒(引物序列如表1所示)。將融合片段轉(zhuǎn)化至ΔPaMus51菌株的原生質(zhì)體后，分別使用含有nourseothricin、hygromycin、geneticin或phleomycin抗性的抗性平板篩選抗性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子與WT菌株雜交，篩選出具有目的基因抗性而不具有原生質(zhì)體抗性的小孢子，即獲得可穩(wěn)定遺傳的突變型菌株。PCR和基因測序驗證5個單突變型菌株是否構(gòu)建成功。使用相應的不同交配型菌株進行遺傳雜交，雜交后篩選同時具有相應抗性的小孢子，以此構(gòu)建AA11家族的10個雙重突變型菌株、10個三重突變型菌株、5個四重突變型菌株和五重突變型菌株，PCR驗證具有相同抗性雙重突變型菌株ΔAΔD和五重突變體菌株是否構(gòu)建成功。

1.4 表型分析

(1) M2培養(yǎng)基培養(yǎng)：將不同交配型的WT和31個AA11家族突變型菌株接種在M2固體培養(yǎng)基上，并于光照條件下27℃恒溫培養(yǎng)1周。在培養(yǎng)過程中觀察并記錄各個菌株的生長速率、菌落大小、菌落形態(tài)、色素沉著、子實體的形成以及子囊孢子的產(chǎn)生、噴發(fā)和萌發(fā)情況，進行顯微觀察并記錄子實體的數(shù)量。每個實驗重復3次。

圖1 構(gòu)建PaLPMO11家族突變體的流程圖

(2) 木質(zhì)纖維素培養(yǎng)基培養(yǎng)：將不同交配型的WT和突變型菌株混勻破碎，分別接種于添加了木質(zhì)素、木屑和微晶纖維素的M0培養(yǎng)基上，于27℃光照條件下培養(yǎng)兩周。在培養(yǎng)過程中觀察并記錄各個菌株的生長速率、菌落大小、菌落形態(tài)、色素沉著、子實體的形成以及子囊孢子的產(chǎn)生、噴發(fā)和萌發(fā)情況。每個實驗重復3次。

1.5 菌絲ROS水平分析

將WT、ΔE和ΔAΔBΔCΔDΔE不同交配型菌株混勻破碎后分別接種在M2培養(yǎng)基上，于27℃黑暗培養(yǎng)3天，分別使用DAB染色試劑盒和NBT染色試劑對菌絲進行染色，檢測菌絲組織中過氧化物和超氧化物的積累[19]。在過氧化物酶的存在下，過氧化氫與DAB反應會生成棕褐色沉淀；NBT在超氧化物酶催化下，與超氧離子反應生成藍紫色沉淀。菌絲染色強度與過氧化物和超氧化物的積累成正比關(guān)系[20]。置于水平搖床避光孵育3 h，菌絲體出現(xiàn)顏色變化時除去染色液，使用PBS洗滌3次，終止顯色反應。觀察比對各菌株菌絲染色程度。每個實驗重復3次。

1.6 纖維素酶活測定

將不同交配型的WT、ΔE和ΔAΔBΔCΔDΔE菌株分別接種到纖維素誘導培養(yǎng)基上生長，以促進纖維素作用酶的分泌。27℃、150 r/min、光照條件下培養(yǎng)3天、5天、7天、9天，取上清液離心后即得粗酶液。參照國標QB2583-2003及Dashtban[21]和Thankappan[22]的方法對濾紙酶活(filter paper activity，F(xiàn)PA)、內(nèi)切葡萄糖苷酶活(endoglucosidase activity，EG activity)、外切葡聚糖酶活(cellobiohydrolase activity，CBH activity)和β-葡萄糖苷酶活(β-D-glucosidase activity，BG activity)進行測定，具體操作方法如下。每組樣品均設置3組重復。

表1 本研究使用的引物

1.6.1 FPA和EG activity測定

FPA和EG酶活單位(U)定義為：在實驗反應條件下，每分鐘釋放1 μmol葡萄糖所需的酶量。纖維素酶可以降解纖維素底物，生成還原性單糖。還原性單糖與3,5-二硝基水楊酸(DNS)沸水浴后發(fā)生顯色反應，生成棕紅色氨基化合物。在一定范圍內(nèi)，反應顏色深淺與酶解反應單位時間內(nèi)釋放的還原性單糖濃度呈正比，在540 nm波長處可以檢測到其吸光度。根據(jù)葡萄糖標準曲線計算酶解反應釋放的還原性單糖含量，從而計算酶活。FPA實驗以濾紙為反應底物，EG activity實驗以CMC-Na為反應底物。將粗酶液與底物混合，50℃水浴1 h，進行反應。加入DNS后輕輕混合，沸水浴5 min后立即置于冰上冷卻，取200 μL反應液于96孔板中，540 nm處測定吸光度。每個樣品均設置空白對照組。

1.6.2 CBH activity和BG activity測定

CBH和BG酶活單位(U)定義為：在實驗反應條件下，每分鐘釋放1 μmol硝基苯酚(pNP)所需的酶量。無色底物pNPG 和pNPC在β-葡萄糖苷酶和外切葡聚糖酶的催化下，水解成有色物質(zhì)pNP，在405 nm波長處有最大吸收峰。根據(jù)pNP標準曲線計算酶解反應釋放的pNP含量，從而計算酶活。將粗酶液與底物混合，50℃水浴30 min，進行反應。水浴后立即置于冰上冷卻，向各離心管中加入2% Na2CO3終止反應。取200 μL反應液于96孔板中，405 nm處測定吸光度。每個樣品均設置空白對照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 PaLPMO11家族蛋白的生物信息學分析

2.1.1 PaLPMO11的系統(tǒng)發(fā)育分析

真菌米曲霉(4MAI_A)和煙曲霉(7P3U_A)編碼的LPMO11蛋白相似度為39.63%，由此推測AA11家族LPMO氨基酸----序列差異雖然較大，但構(gòu)成組氨酸支架的兩個組氨酸和AA11家族獨有的軸位點酪氨酸側(cè)鏈均嚴格保守，該酪氨酸側(cè)鏈不直接參與金屬銅離子的配位，而是與其附近的丙氨酸相互作用[11]。5個基因編碼的蛋白PaLPMO11A、PaLPMO11B、PaLPMO11C、PaLPMO11D和PaLPMO11E與AoAA11蛋白以及AfAA11蛋白均有較高的一致性(均在27.9%以上)。與AoAA11蛋白相似度分別為37.04%、27.93%、35.94%、45.07%和40.64%；與AfAA11蛋白相似度分別為37.43%、49.02%、48.6%、38.39%和49.05%。因此，推測5個編碼的蛋白可能是與AoAA11和AfAA11蛋白類似的裂解多糖單加氧酶。使用MEGA 11.0對12個LPMO11蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2A)。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，PaLPMO11D和AoAA11、AfAA11B和FfAA11親緣關(guān)系近；AfAA11A和PaLPMO11C處于同一分支上，表明親緣關(guān)系最近；其次是與PaLPMO11E關(guān)系較近；而PaLPMO11A和PaLPMO11B位于該進化樹的最外側(cè)。由圖2B可知，5個PaLPMO11蛋白在催化位點核心保守區(qū)域顯示出較高相似度，預測兩個高度保守的組氨酸會與金屬銅離子螯合成T形的組氨酸支架，從而構(gòu)成催化活性位點[23]。而PaLPMO11B在多序列比對結(jié)果中顯示缺少軸位點酪氨酸側(cè)鏈，因此在預測蛋白三級結(jié)構(gòu)中，無法預測出其催化活性位點的保守氨基酸所處位置(圖3)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果和多序列比對結(jié)果顯示，推測5個PaLPMO11蛋白可能分屬于AA11家族的不同亞家族。--

2.1.2 PaLPMO11蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型預測

和基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)與活性位點保守氨基酸預測如圖3所示。5個PaLPMO11蛋白預測具有與AoAA11蛋白相似的整體拓撲結(jié)構(gòu)，均具有典型的反向平行β-三明治核心結(jié)構(gòu)。將除PaLPMO11B外的4個PaLPMO11預測蛋白的催化活性位點的保守氨基酸與AoAA11蛋白的活性位點的保守氨基酸進行比較，所有原子的均方根偏差(root mean square deviation，RMSD)在0.77～0.97 ?范圍內(nèi)顯示出較高水平的結(jié)構(gòu)重疊。根據(jù)系統(tǒng)進化分析、多序列比對和蛋白三級結(jié)構(gòu)模型預測結(jié)果推測，的5個LPMO11蛋白可能是與AoAA11類似的蛋白，可以通過氧化還原反應裂解糖苷鍵，從而降解某種頑固多糖[11]。---

A: PaLPMO11蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。AA11蛋白氨基酸序列來源于CAZy數(shù)據(jù)庫和NCBI網(wǎng)站，基因庫序列號顯示在系統(tǒng)發(fā)育樹中。B: LPMO11s和PaLPMO11s的部分氨基酸序列比對。三角形表示參與銅離子配位的兩個絕對保守的組氨酸殘基，以及AA11家族特有的軸向酪氨酸殘基。

2.2 ΔPaLPMO11突變體的構(gòu)建

2.2.1五個基因敲除表達盒的構(gòu)建

按1.3構(gòu)建PaLPMO11家族突變體所述方法構(gòu)建突變體。利用4種不同的抗性標記geneticin、nourseothricin、hygromycin和phleomycin代替5個基因序列，敲除這5個基因，并對5個單突變體進行抗性驗證和PCR驗證。以WT基因組DNA為模板，PCR擴增得到5個基因上游片段PaLPMO11-5′和下游片段PaLPMO11-3′約1000 bp片段。以質(zhì)粒pBC- Hygromycin、pBC-Nourseothricin、pBC-Geneticin或pBC-Phleomycin DNA為模板，擴增獲得HygroR基因片段(3657 bp)、NourR基因片段(1773 bp)、GeneR基因片段(2342 bp)或PhleR基因片段(3100 bp)。將各個基因的上下游片段和抗性標記基因片段進行融合PCR擴增，分別構(gòu)建的敲除表達盒-5′-HygroR和HygroR--3′；的敲除表達盒-5′-NourR和NourR--3′；的敲除表達盒-5′-GeneRand GeneR--3′；的敲除表達盒-5′-PhleR和PhleR--3′以及的敲除表達盒-5′-GeneR和GeneR--3′。5個基因敲除表達盒的構(gòu)建結(jié)果見附圖1和附圖2。通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，將敲除表達盒轉(zhuǎn)化到ΔPaMus51菌株的原生質(zhì)體中，篩選具有相應抗性的轉(zhuǎn)化子，利用兩對驗證引物(verify__1F和5T、verify__2F和3T)對篩選出來的轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證(驗證引物序列見表1)并純化，擴增得到的同源重組片段與目的序列大小一致，序列比對結(jié)果與目標序列一致。以上結(jié)果均表明，目的基因片段與抗性基因片段在目的敲除基因位點發(fā)生同源重組置換，證實抗性標記基因成功整合在目的基因座中，成功構(gòu)建PaLPMO11家族5個基因缺失菌株。

A: 目標蛋白三級結(jié)構(gòu)預測。B：PaLPMO11蛋白與AoAA11蛋白的整體疊加。AoAA11蛋白用黃色標注，PaLPMO11蛋白用藍色標注。C：PaLPMO11蛋白(藍色)與AoAA11蛋白(黃色)的活性位點的重疊。

2.2.2 ΔPaLPMO11突變體的PCR驗證

單突變體構(gòu)建成功后，通過遺傳雜交構(gòu)建10個雙突變型菌株ΔAΔB(ΔPaLPMO11AΔΔPaLPMO11B)、ΔAΔC、ΔAΔD、ΔAΔE、ΔBΔC、ΔBΔD、ΔBΔE、ΔCΔD、ΔCΔE和ΔDΔE，10個三重突變型菌株ΔAΔBΔC、ΔAΔBΔD、ΔAΔBΔE、ΔAΔCΔD、ΔAΔCΔE、ΔAΔDΔE、ΔBΔCΔD、ΔBΔCΔE、ΔBΔDΔE和ΔCΔDΔE，5個四重突變型菌株ΔAΔBΔCΔD、ΔAΔBΔCΔE、ΔAΔBΔDΔE、ΔAΔCΔDΔE和ΔBΔCΔDΔE以及缺失所有PaLPMO11家族基因的五重突變體菌株ΔAΔBΔCΔDΔE。具有相同抗性雙重突變型菌株ΔAΔD和五重突變體菌株ΔAΔBΔCΔDΔE均通過PCR驗證。ΔPaLPMO11突變體的PCR驗證結(jié)果見附圖3。

2.3 PaLPMO11家族基因的缺失影響P. anserina利用碳源的能力

2.3.1 菌株在M2培養(yǎng)基上的生長發(fā)育

M2培養(yǎng)基是以糊精作為唯一碳源、能滿足生長和發(fā)育的基礎培養(yǎng)基。將WT和突變型菌株接種到M2培養(yǎng)基上，27℃培養(yǎng)1周。除ΔAΔBΔCΔDΔE外的突變型菌株均不受影響，沒有發(fā)現(xiàn)WT和其他突變型菌株在菌落大小、形態(tài)和色素沉著、子實體形成以及子囊孢子產(chǎn)生、噴發(fā)和萌發(fā)方面存在明顯差異(數(shù)據(jù)未顯示)。而ΔAΔBΔCΔDΔE出現(xiàn)色素沉著的時間和子實體生成時間與其他菌株出現(xiàn)差異，且菌落大小、菌絲密度、子實體形成數(shù)量及子囊孢子噴發(fā)數(shù)量都遠低于WT (圖4)。與WT相比，ΔAΔBΔCΔDΔE的生長有最顯著的延遲，且提前進入衰老狀態(tài)。培養(yǎng)第7天起，ΔAΔBΔCΔDΔE開始停止生長并伴隨明顯的色素沉著。結(jié)果表明，PaLPMO11家族單個基因在的生長發(fā)育過程中似乎沒有發(fā)揮關(guān)鍵作用，但5個基因同時敲除，會引起菌株生長發(fā)育和有性生殖明顯延緩并導致菌株提前衰老。

2.3.2 菌株在木質(zhì)素培養(yǎng)基上的生長發(fā)育

能夠高效利用木質(zhì)纖維素作為碳源，通過分泌胞外酶使其能夠有效地滲透和降解植物生物質(zhì)[24]。為了確定PaLPMO11家族基因在木質(zhì)纖維素利用中的作用，將WT與31個突變型菌株進行表型分析比較。用木質(zhì)素、木屑和微晶纖維素等量代替糊精作為唯一的碳源，評估突變體利用木質(zhì)纖維素的能力。

在以純木質(zhì)素作為唯一碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，WT菌絲呈紡絲狀生長，在培養(yǎng)基上只形成菌絲體，而不生成子實體[25]。除ΔAΔBΔCΔDΔE外，其余菌株生長速度很快，菌絲體在培養(yǎng)6天后幾乎覆蓋了整個培養(yǎng)基。在木質(zhì)素平板上，ΔAΔBΔCΔDΔE的生長直徑與菌絲密度明顯減少(圖5)，在培養(yǎng)5天時，生長直徑比WT減少了19%；在培養(yǎng)7天時，直徑減少了近31%。結(jié)果表明，ΔAΔBΔCΔDΔE利用木質(zhì)素的能力降低。除ΔAΔBΔCΔDΔE外，其他突變型菌株的生長與WT幾乎沒有差異。這表明，5個基因之間可能在降解木質(zhì)素以獲取營養(yǎng)物質(zhì)的過程中具有補償效應，在PaLPMO11家族基因一個或多個基因缺失的情況下，菌株的生長狀態(tài)并沒有顯著改變，而PaLPMO11家族的基因全部缺失時，菌株的生長和菌絲量都會相應地下降減少。

2.3.3 菌株在木屑培養(yǎng)基上的生長發(fā)育

在以木屑為唯一碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，除ΔAΔBΔCΔDΔE外，WT和其他突變型菌株的子實體在培養(yǎng)6天后開始發(fā)育，數(shù)量眾多，并在2天后噴發(fā)具有活性的子囊孢子。且除ΔAΔBΔCΔDΔE以外，其他突變型菌株的子實體萌發(fā)時間、生長速率和菌絲密度與WT并無明顯差異。而5個基因的同時缺失會導致菌株生長速率延緩，子囊孢子的形成時間延遲，子實體的產(chǎn)生顯著減少，這與M2基礎培養(yǎng)基上的觀察結(jié)果一致。

圖4 WT與ΔAΔBΔCΔDΔE菌株在M2培養(yǎng)基上的生長發(fā)育情況

將不同交配型菌株混合破碎，取5 μL菌懸液滴在M2培養(yǎng)基中央，27℃光照培養(yǎng)3天(d)后，拍照并記錄菌株生長直徑。野生型與其他突變株間生長直徑并無顯著差異。檢驗：*<0.05，**<0.01，***<0.001。

圖5 WT與ΔAΔBΔCΔDΔE菌株在木質(zhì)素培養(yǎng)基上的生長發(fā)育情況

將不同交配型菌株混合破碎，取5 μL菌懸液滴在木質(zhì)素培養(yǎng)基中央，27℃光照培養(yǎng)3天(d)后，拍照并記錄菌株生長直徑。圖中數(shù)字表示突變型菌株與野生型菌株相比，生長直徑減少的百分比。野生型與其他突變株間生長直徑并無顯著差異。檢驗：*<0.05，**<0.01，***<0.001。

圖6 WT與ΔAΔBΔCΔDΔE菌株在木屑培養(yǎng)基上的生長發(fā)育情況

將不同交配型菌株混合破碎，取5 μL菌懸液滴在木屑培養(yǎng)基中央，27℃光照培養(yǎng)9天(d)后，拍照并觀察培養(yǎng)基上及培養(yǎng)皿蓋上的子實體密度。子實體為可見的黑色小點。野生型與其他突變株間子實體數(shù)量并無明顯差異。

絲狀真菌的子實體是區(qū)分營養(yǎng)生殖和有性生殖的重要生殖器官[26]；在真菌生命周期中，子實體的形成是最為復雜的發(fā)育過程之一，需要消耗大量的能量和營養(yǎng)物質(zhì)[27,28]。觀察噴發(fā)到培養(yǎng)基蓋子上的子囊孢子密度(圖7A)，發(fā)現(xiàn)敲除基因的突變型菌株噴發(fā)的孢子數(shù)明顯少于WT和其他突變體，ΔAΔBΔCΔDΔE的產(chǎn)孢數(shù)是最少的(圖片未完全展示)。為了量化菌株產(chǎn)孢數(shù)，對WT和敲除基因的16個突變型菌株進行子實體數(shù)量統(tǒng)計與顯微鏡觀察(圖7B)。每個菌株均設置了3組重復。由圖7D可知，ΔBΔCΔE子實體數(shù)量為5739，ΔAΔBΔCΔE子實體數(shù)量為5296，ΔAΔCΔDΔE子實體數(shù)量為4812，ΔAΔBΔCΔDΔE子實體數(shù)量為379，與WT的子實體數(shù)量7216相比，分別減少了20%、27%、33%和95%，均存在顯著差異。統(tǒng)計上述菌株子囊孢子的萌發(fā)率，WT菌株子囊孢子萌發(fā)率為95.5%，ΔBΔCΔE子囊孢子萌發(fā)率為92%，ΔAΔBΔCΔE子囊孢子萌發(fā)率為81.5%，ΔAΔCΔDΔE子囊孢子萌發(fā)率為70%，ΔAΔBΔCΔDΔE子囊孢子萌發(fā)率為51.5% (圖7E)。子實體是真菌體內(nèi)的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，孢子在子實體內(nèi)形成并于成熟后噴發(fā)，是真菌進行繁殖的主要途徑[29]。ΔAΔBΔCΔDΔE菌株進入有性生殖階段后，會生成部分異常的子實體，部分子實體無內(nèi)容物，不含有活性的子囊孢子(圖7C)，因而無法正常排出子囊孢子，導致噴發(fā)到培養(yǎng)基蓋子上的子囊孢子密度遠小于其他菌株。實驗結(jié)果顯示，基因缺失的突變體的子囊孢子萌發(fā)率和子實體數(shù)量均呈現(xiàn)下降趨勢，說明基因可能與子囊孢子萌發(fā)和子實體形成有關(guān)；除ΔAΔBΔCΔDΔE外，WT和其余突變體的生長速率和菌絲密度無明顯差異。

圖7 WT和部分PaLPMO11E基因缺失突變型菌株的子囊孢子密度圖、顯微觀察、子實體數(shù)量統(tǒng)計與子囊孢子萌發(fā)率統(tǒng)計

A：野生型和部分基因缺失突變型菌株的子囊孢子密度圖。菌株于木屑培養(yǎng)基上培養(yǎng)8天后會將孢子噴發(fā)至培養(yǎng)皿蓋子上，對接有子囊孢子的培養(yǎng)皿蓋拍照。B：野生型和突變型菌株于倒置顯微鏡下的觀察結(jié)果。不同交配型菌株于M2培養(yǎng)基27℃光照培養(yǎng)5天后，置于倒置顯微鏡下觀察子實體形態(tài)與數(shù)量。標尺：500 μm。C：WT及ΔΔBΔCΔDΔE子實體放大圖。在M2培養(yǎng)基27℃光照培養(yǎng)5天后，挑取子實體置于載玻片上，用蓋玻片蓋上碾壓，置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。標尺：100 μm。D：子實體數(shù)量統(tǒng)計。不同交配型菌株在M2培養(yǎng)基上27℃光照7天后，在顯微鏡下對野生型和突變型菌株的子實體數(shù)量進行計數(shù)統(tǒng)計。E：子囊孢子萌發(fā)率統(tǒng)計。將不同交配型菌株在M2培養(yǎng)基上進行雜交，培養(yǎng)7天后開始噴發(fā)子囊孢子，用接種孢子培養(yǎng)基接住噴發(fā)出來的子囊孢子。每個菌株挑取200個子囊孢子于萌發(fā)孢子培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)1天后，統(tǒng)計子囊孢子的萌發(fā)率。檢驗: *<0.05，**<0.01，***<0.001。

這表明基因可能參與了有性生殖過程，而PaLPMO11家族5個基因的同時缺失，會導致菌株營養(yǎng)生長和有性生殖過程進一步受損，不僅表現(xiàn)為菌落的生長直徑明顯降低和子實體數(shù)量大幅減少，還表現(xiàn)為生成異常子實體，導致菌株的低育性。由此推測上述突變型菌株可能無法從木屑中正常獲取足夠的碳源，利用營養(yǎng)物質(zhì)的能力受損，導致菌株營養(yǎng)生長期間能量儲備不足，無法正常供應有性生殖過程的能量需求，從而造成菌株有性生殖過程部分受損，其中ΔAΔBΔCΔDΔE的表型最為明顯。

2.3.4 菌株在微晶纖維素平板上的生長發(fā)育

在以微晶纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)時，野生型菌株生成的子實體以接種點為中心呈環(huán)狀分布[20]，通過計算培養(yǎng)皿上的成熟子實體數(shù)量來衡量菌株的生育力。由圖8A可知，敲除基因的突變型菌株形成更大更彌散的子實體環(huán)，子實體分布呈現(xiàn)發(fā)散狀，且子實體數(shù)量少于WT，這一點與菌株在木屑平板上生長得到的結(jié)果一致。這一表型在ΔAΔBΔCΔDΔE菌株上尤為明顯，ΔAΔBΔCΔDΔE的子實體數(shù)量與WT相比下降了19倍。在其他突變型菌株中沒有觀察到這種表型，它們所生成的子實體環(huán)與WT無太大差異，均在培養(yǎng)皿中央生成成熟的子實體環(huán)。實驗結(jié)果表明，基因可能在的有性生殖過程中發(fā)揮了作用，基因缺失菌株會形成一個更大更彌散的子實體環(huán)，子實體密度減少(圖8B)。由實驗結(jié)果推測，基因缺失菌株可能無法充分利用微晶纖維素碳源以維持自身生長發(fā)育所需，導致有性生殖過程在一定程度上受到影響，因而生成的子實體數(shù)量減少。PaLPMO11家族基因的同時敲除，會對的生長發(fā)育和有性繁殖造成更大程度的影響，導致菌株生長發(fā)育明顯延緩，生成空心子實體，子實體數(shù)量與子囊孢子萌發(fā)率顯著下降。而PaLPMO11家族基因間可能發(fā)揮相互代償?shù)淖饔?，一個基因或多個基因缺失時，PaLPMO11家族的其他基因可能發(fā)揮類似的功能，以代償其他基因的缺失，從而保證菌株可以維持正常的生理過程。

2.4 過量生成的過氧化氫可能加速了菌株的衰老

活性氧(ROS)是細胞有氧代謝過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，主要由超氧陰離子自由基和過氧化氫組成[30]。生物體內(nèi)存在一系列抗氧化系統(tǒng)使ROS的產(chǎn)生和消除處于平衡狀態(tài)，當ROS在生物體內(nèi)過量產(chǎn)生時，會開始攻擊細胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，導致細胞損傷和凋亡[30,31]。對WT、ΔE和ΔAΔBΔCΔDΔE菌株菌絲的ROS水平進行分析，染色結(jié)果如圖9所示。NBT染色觀察發(fā)現(xiàn)，WT和ΔE菌絲的藍紫色顯色最深，且WT和ΔE之間菌絲染色并無明顯差異，而ΔAΔBΔCΔDΔE藍紫色染色最淺，說明ΔAΔBΔCΔDΔE超氧化物的分泌量明顯減少。DAB染色觀察發(fā)現(xiàn)，除培養(yǎng)第1天外，DAB染色結(jié)果與NBT染色結(jié)果一致，WT和ΔE染色程度無差異，均呈現(xiàn)明顯的棕褐色，ΔAΔBΔCΔDΔE菌絲染色程度最淺。培養(yǎng)1天時，ΔAΔBΔCΔDΔE菌絲密度低于WT，但其DAB染色程度卻深于WT，結(jié)果表明ΔAΔBΔCΔDΔE菌株可能在培養(yǎng)第1天時分泌了大量的過氧化氫。由上述結(jié)果推測，單突變型菌株體內(nèi)可能存在其他相似功能的基因能彌補其缺失，因而其染色結(jié)果與WT無明顯差異。再結(jié)合在M2和木質(zhì)素平板上的表型分析結(jié)果，ΔAΔBΔCΔDΔE菌株均出現(xiàn)提前衰老的現(xiàn)象。由此推測，ΔAΔBΔCΔDΔE衰老的潛在機制可能是由于菌株生長前期體內(nèi)積累了過量過氧化氫，而過量的過氧化氫可能會導致菌株進入過度氧化應激狀態(tài)，導致分子氧化損傷增加，從而促進了突變菌株的衰老過程，導致突變型菌株提前進入衰老狀態(tài)。

2.5 PaLPMO11基因參與纖維素降解過程

纖維素可以用于乙醇生產(chǎn)等工業(yè)生物煉制應用，而纖維素的降解利用卻受到如物化特性、結(jié)構(gòu)特點以及組成成分等因素的阻礙[32,33]。因此，提高木質(zhì)纖維素的降解效率、減少工業(yè)生產(chǎn)成本對于木質(zhì)纖維素的工業(yè)應用具有重要意義。濾紙酶活是包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三種纖維素降解酶在內(nèi)的總纖維素酶活[34]。單突變體ΔE的四種纖維素酶活力與WT差異不大，而ΔAΔBΔCΔDΔE的酶活降低最為顯著。培養(yǎng)7天時，ΔAΔBΔCΔDΔE的FPA酶活是WT酶活的53%，EG酶活是WT酶活的61%，CBH酶活是WT酶活的61%，BG酶活是WT酶活的32%；菌株培養(yǎng)9天時，ΔAΔBΔCΔDΔE的FPA活性、EG活性、CBH活性和BG活性分別是WT酶活的45%、58%、36%和35% (圖10)。實驗結(jié)果表明，單個基因的缺失，對總纖維素酶活影響不明顯，而5個基因的同時缺失，總纖維素酶活顯著下降，但卻仍有野生型45%以上的活力，說明基因之間可能存在功能冗余，且5個基因功能可能與纖維素降解有關(guān)。

圖8 WT與突變型菌株在微晶纖維素培養(yǎng)基上的生長發(fā)育情況與對比圖

子實體為可見的黑色小點。將不同交配型菌株混合破碎，取5 μL菌懸液滴在微晶纖維素培養(yǎng)基中央，培養(yǎng)8天后拍照。除基因缺失突變型菌株外，未發(fā)現(xiàn)野生型與其他突變株間子實體數(shù)量與分布存在顯著差異。A：野生型和基因缺失突變型菌株于微晶纖維素培養(yǎng)基培養(yǎng)的結(jié)果圖。B：野生型和突變型菌株放大對比圖。

3 討論

目前僅有來自米曲霉、富士鐮刀-菌和煙曲霉的LPMO11蛋白被純化和表征[11～13]。所有已知真菌的LPMO均具有保守的中央反向平行β-折疊核心結(jié)構(gòu)，而暴露在平坦核心結(jié)構(gòu)表面的金屬銅離子會與兩個高度保守的組氨酸提供的3個氮原子配位，形成T形的組氨酸支架，從而構(gòu)成催化活性位點[10,35]。全基因組序列中存在5個可能編碼LPMO11蛋白序列的基因，分別為和。進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，5個PaLPMO11蛋白均含有構(gòu)成催化活性位點的兩個高度保守的組氨酸殘基和β-三明治折疊核心結(jié)構(gòu)，而PaLPMO11B缺乏AA11家族獨有的軸位點酪氨酸側(cè)鏈。因此推測5個PaLPMO11蛋白可能屬于AA11家族的不同亞家族，可以通過氧化還原反應裂解糖苷鍵，從而降解某種難降解多糖。

圖9 DAB和NBT染色分析野生型菌株與突變型菌株菌絲ROS水平

將不同交配型菌株混合破碎，取5 μL菌懸液滴在M2培養(yǎng)基中央。黑暗培養(yǎng)1、2、3天(d)后，用DAB和NBT對菌株菌絲進行染色。

將100 μL菌懸液接種于50 mL 微晶纖維素液體培養(yǎng)基中，150 r/min恒溫搖床培養(yǎng)3、5、7、9天(d)，提取粗酶液，測定不同菌株的纖維素酶活。檢驗：*<0.05，**<0.01，***<0.001。

多項研究表明，是一種壽命有限的絲狀真菌，其衰老的表型為：菌株生長速率和生殖能力的下降、氣生菌絲形成的減少以及生長停滯會伴隨著明顯的色素沉著[36,37]。本研究也發(fā)現(xiàn)ΔAΔBΔCΔDΔE在M2和木質(zhì)素培養(yǎng)基上均表現(xiàn)出異常的菌落形態(tài)和顯著的生長減少，與WT的蓬松菌落表面不同，ΔAΔBΔCΔDΔE菌株的環(huán)狀菌落僅形成稀疏的氣生菌絲；生殖能力顯著下降，僅在內(nèi)圈生成少數(shù)子實體；培養(yǎng)5天后，ΔAΔBΔCΔDΔE加速了外圈色素的過度積累(圖4，圖5)。子實體是真菌體內(nèi)的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，孢子在子實體內(nèi)形成并于成熟后噴發(fā)，是真菌繁殖的主要途徑，該過程需要消耗大量的能量和營養(yǎng)物質(zhì)[26,29]。如圖6、圖7和圖8所示，基因可能與子實體分布、形成和子囊孢子萌發(fā)有關(guān)。同時敲除PaLPMO11家族的5個基因，會導致菌株子實體數(shù)量明顯減少和生成部分異常子實體，進而造成有性生殖部分受損。ΔAΔBΔCΔDΔE菌株子實體數(shù)相較于WT減少95%，子囊孢子萌發(fā)率僅為51.5%，說明PaLPMO11家族基因可能是控制菌株有性生殖的關(guān)鍵基因。適量的過氧化氫可以作為一種信號分子，發(fā)揮一定的生理作用，但高濃度的過氧化氫可能會引發(fā)氧化應激，導致程序性細胞死亡[38]。根據(jù)前人的研究報道，用400 μmol/L的過氧化氫會誘導H9C2細胞發(fā)生氧化應激，導致細胞活力下降[39]；在中，WT菌株體內(nèi)過氧化氫釋放量會隨著培養(yǎng)時間的延長而不斷增加，菌株培養(yǎng)后期釋放的過氧化氫量約是培養(yǎng)前期的3倍，證實了衰老與氧化應激的增加有關(guān)[40]；在水稻中，基因的突變會導致過氧化氫的積累，從而導致葉片過早衰老[41]。在M2培養(yǎng)基上培養(yǎng)的第1天，ΔAΔBΔCΔDΔE菌株產(chǎn)生了大量過氧化氫(圖9)，再結(jié)合前面表型分析所得結(jié)果推測，過量的過氧化氫可能引發(fā)了ΔAΔBΔCΔDΔE菌株過度氧化應激狀態(tài)，增強了自由基對細胞的氧化損傷，從而促進了突變菌株的衰老過程。綜上，中5個基因的完全缺失會導致菌株出現(xiàn)嚴重的生長缺陷、形態(tài)變化和壽命縮短等情況。因而，PaLPMO11家族基因在絲狀真菌的生長發(fā)育和有性生殖過程中可能是必不可少的。根據(jù)實驗結(jié)果推測PaLPMO11家族基因功能冗余，5個基因間可能相互協(xié)調(diào)調(diào)控碳源利用與菌株的生長發(fā)育、有性生殖和衰老，一個或多個基因缺失時，其他基因可能在一定程度上能替代或補充其功能，使能夠應對AA11家族單個或多個基因的缺失。在41種常見的真菌基因組中，是含有最多降解木質(zhì)纖維素蛋白酶類基因的絲狀真菌[15]，具有強大的木質(zhì)纖維降解能力，能夠?qū)⒛举|(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化成如生物乙醇等不同的高附加值產(chǎn)品[42]。將作為真菌降解木質(zhì)纖維素的模式生物進行研究，發(fā)現(xiàn)一些新的木質(zhì)纖維素降解相關(guān)基因和酶，闡明這些酶和基因在真菌中的作用機制，有望為深入了解真菌降解復雜多糖、提高生物能源生產(chǎn)效率等領域的研究提供參考[16,43]。如圖10所示，單突變體的濾紙酶活、內(nèi)切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活和β-葡萄糖苷酶活與WT沒有顯著差異，而5個基因的同時缺失，會導致菌株總纖維素酶活顯著下降，但卻仍有野生型45%以上的酶活力。在中，基因缺失突變體降解纖維素的效率比WT提高了近兩倍[44]；和漆酶基因亞家族1的突變體降解纖維素的能力明顯下降[25,45]；證實了它們均參與了纖維素降解過程。在本研究中，出乎意料的是，PaLPMO11家族基因家族貢獻了接近一半的纖維素酶活力。根據(jù)結(jié)果推測，基因之間可能存在功能冗余，且PaLPMO11家族的5個基因功能可能與纖維素降解有關(guān)，PaLPMO11家族的裂解多糖單加氧酶的完全失活可能會改變的纖維素降解機制。

綜上所述，中AA11家族的裂解多糖單加氧酶基因參與菌株的生長發(fā)育、有性生殖、衰老和纖維素降解過程。本研究結(jié)果為系統(tǒng)闡述絲狀真菌中木質(zhì)纖維素降解的調(diào)控機制提供參考。

附加材料見文章電子版www.chinagene.cn。

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Identification and functional study of AA11 family polysaccharide monooxygenase genes in filamentous fungus

Wenzhen Du1, Yuanjing Li2, Jialing Wu1, Siyu Chen1, Liang Jiang1, Gang Liu1, Ning Xie1

The lytic polysaccharide monooxygenase (LPMO) in the auxiliary active protein family (AA family) catalyzes the oxidative depolymerization of various refractory carbohydrates including cellulose, chitin and starch. While accumulating studies investigate the enzymology of LPMO, the research on the inactivation ofgenes has been rarely explored. In this study, fivegenes()()()()()of the AA11 family in the filamentous funguswere knocked out by homologous recombination. Single mutants ΔPaLPMO11A (ΔA), ΔPaLPMO11B (ΔB), ΔPaLPMO11C (ΔC), ΔPaLPMO11D (ΔD) and ΔPaLPMO11E (ΔE) were constructed, and then all polygenic mutants were constructed via genetic crosses. The differences in the growth rate and sexual reproduction between wild type and mutant strains were observed on different carbon source media. The alteration of oxidative stress and cellulose degradation ability were found on DAB and NBT staining and cellulase activity determination. These results implicated thatgenes play a key role in the growth, development, and lignocellulose degradation of. The results showed that the spore germination efficiency, growth rate and reproductive capacity of mutant strains including ΔBΔCΔE, ΔAΔBΔCΔE, ΔAΔCΔDΔE and ΔAΔBΔCΔDΔE was significantly decreased on different cellulose carbon sources and the remaining strains have no difference. The reduced utilization of various carbon sources, the growth rate, the spore germination rate, the number of fruiting bodies, the normal fruiting bodies, the shortened life span and the ability to degrade cellulose were found in strains which all five genes in the PaLPMO11 family were deleted. However, the strain still had 45% cellulase activity compared to wild type. These results suggest thatgenes may be involved in the growth and development, sexual reproduction, senescence and cellulose degradation of. This study provides information for systematically elucidating the regulatory mechanism of lignocellulose degradation in filamentous fungus.

filamentous fungi;;; gene knockout; lignocellulose degradation

2023-08-21;

2023-10-28;

2023-11-10

國家重點研發(fā)計劃項目(編號：2021YFA0910800)，廣東省自然科學基金項目(編號：2021A1515012166，2021A1515012118)和國家自然科學基金項目(編號：31601014，22078199)資助[Supported by the National Key R&D Program of China (No. 2021YFA0910800), the Basic and Applied Basic Research Fund of Guangdong Province (Nos. 2021A1515012166, 2021A1515012118), and the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31601014, 22078199)]

杜文珍，碩士研究生，專業(yè)方向：微生物遺傳學。E-mail: 2100251038@email.szu.edu.cn

謝寧，博士，副教授，博士生導師，研究方向：微生物遺傳學。E-mail: ning.xie@szu.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-223

(責任編委: 劉鋼)