張馨予，周韞曦，范娟，卞藝萍，魏艷萍，周麗蘋，李生茂（川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川南充 637000）

益智是姜科植物益智AlpiniaoxyphyllaMiq.的干燥成熟果實，經(jīng)炮制去殼后以益智仁入藥，性溫，味辛，具有溫脾止瀉攝涎、暖腎固精縮尿的功效，主治腎虛遺尿，小便頻數(shù)，遺精白濁，脾寒泄瀉，腹中冷痛，口多唾涎[1]。研究[2-4]顯示，益智含有二苯基庚烷類、倍半萜類、黃酮類、揮發(fā)油類、苷類和甾體等化學(xué)成分，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力及神經(jīng)保護(hù)等藥理作用。中醫(yī)認(rèn)為，益智仁生品有較大燥性，歸脾經(jīng)，溫脾止瀉、收攝涎唾的作用較強(qiáng)[5]。鹽炙可緩和其燥性，主入腎經(jīng)，溫腎固精縮尿的作用增強(qiáng)[6]?，F(xiàn)代研究[[7-13]顯示，益智仁鹽炙后揮發(fā)油的含量和組成，以及白楊素、圓柚酮、益智酮甲、益智酮乙、益智醇等含量會發(fā)生明顯變化，并產(chǎn)生5-羥甲基糠醛等成分。但采用指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別法分析比較益智仁鹽炙前后整體化學(xué)成分差異及其潛在質(zhì)量差異標(biāo)志物的研究報道較少。

中藥化學(xué)指紋圖譜可比較全面地反映中藥及其制劑中內(nèi)在化學(xué)成分的種類和數(shù)量，進(jìn)而對其質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評價[14]。其中，高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜具有分離效率高、分析速度快、選擇性高、靈敏度高及穩(wěn)定性好等特點，已成為構(gòu)建指紋圖譜的最常用方法之一[15]。故本實驗采用HPLC 法分別建立了益智仁鹽炙前后的指紋圖譜，并結(jié)合主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLSDA）法比較益智仁鹽炙前后化學(xué)成分的差異，并篩選出益智仁鹽炙前后的潛在差異標(biāo)志物，為益智仁的鹽炙機(jī)理及質(zhì)量控制研究提供一定的參考。

1 儀器和試藥

1.1 儀器Agilent1220 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Ohaus Discovery十萬分之一電子天平（美國奧豪斯公司）；KQ-300DE臺式數(shù)控超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司）；TGL-18 臺式高速冷凍離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）。

1.2 試藥5-羥甲基糠醛（批號：wkq22051703）、原兒茶酸（批號：wkq22011301）、原兒茶醛（批號：wkq22041904）、表兒茶素（批號：wkq22081611）、白楊素（批號：wkq22060108）、楊芽黃素（批號：wkq22021608）和圓柚酮（批號：wkq22051807），四川省維克奇生物科技有限公司，純度均不小于98%；山奈素，四川省成都市曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-18040502，純度≥98%；乙腈、甲醇，均為色譜純，美國諾爾施公司，批號：2020041301、2020040701；甲醇、冰乙酸，均為分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號：2022011802、2018071701；實驗用水為娃哈哈純凈水。

1.3 藥材益智飲片經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李毅主任中藥師鑒定為姜科植物益智（AlpiniaoxyphyllaMiq.）的干燥成熟果實，經(jīng)人工剝殼，得到其種子團(tuán)（益智仁）。12 批益智仁飲片（S1～S12，購自成都市荷花池藥材批發(fā)市場，其中S1～S3 產(chǎn)自廣東省；S4～S6 產(chǎn)自廣西??；S7～S11 產(chǎn)自海南省；S12 產(chǎn)自云南?。凑?020 年版《中華人民共和國藥典》通則“0213 鹽炙法”制成鹽益智仁（YS1～YS12）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Agilent C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相：0.05% 乙酸水（A）-乙腈溶液（B），梯度洗脫：13%→17%B（0～5 min），17%→20%B（5～10 min），20%→30%B（10～12 min），30%→38%B（12～18 min），38%→55%B（18～25 min），55%→60%B（25～28 min），60%→62%B（28～30 min），62%→65%B（30～34 min），65%→70%B（34～36 min），70%→80%B（36～40 min）；80%B（40～45 min）；進(jìn)樣量為15 μL；流速為0.4 mL·min-1；柱溫為25 ℃；檢測波長為250 nm。

2.2 供試品溶液配置精密稱取益智仁藥材粉末（過3 號篩），約0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量；超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取40 min，放冷；再稱定質(zhì)量，并用60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液。

2.3 對照品溶液配置精密稱取對照品5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、原兒茶醛、表兒茶素、白楊素、山奈素、楊芽黃素和圓柚酮適量，精密加入60%甲醇配制成濃度分別為0.059 8、0.0272 4、0.0473 4、0.304 8、0.080 2、0.043 4、0.095 3和0.219 1 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1精密度考察 精密稱取益智仁藥材（YS6）粉末（過3 號篩），約0.5 g，按“2.2”項下提取方法制備樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計算各主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結(jié)果表明，以圓柚酮為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD 均小于0.6%，相對峰面積的RSD 均小于4.6%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2穩(wěn)定性試驗 精密稱取益智仁藥材（YS6）粉末（過3 號篩），約0.5 g，按“2.2”項下提取方法制備樣品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算各主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結(jié)果表明，以圓柚酮為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD 均小于0.8%，各共有峰相對峰面積的RSD 均小于4.7%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3重復(fù)性試驗 精密稱取益智仁藥材（YS6）粉末（過3號篩）6份，每份約0.5 g，按“2.2”項下提取方法制備樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算各主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結(jié)果表明，以圓柚酮為參照峰，各共有峰相對保留時間的RSD 均小于0.7%，各共有峰相對峰面積的RSD 均小于4.9%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5 益智仁生品及鹽炙品HPLC 指紋圖譜的建立及相似度評價

2.5.1益智仁生品及鹽炙品HPLC 指紋圖譜建立 取益智仁生品及鹽炙品，按“2.2”項下方法制備樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄12批益智仁鹽炙前后樣品的HPLC 色譜圖。將12 批益智仁生品和鹽炙品的HPLC色譜圖數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 年A 版）》軟件進(jìn)行分析評價。分別以S1 和YS1 為參照圖譜，選擇中位數(shù)法，設(shè)置時間窗為0.1，經(jīng)多點校正自動匹配后生成共有模式對照指紋圖譜。生品和鹽炙品指紋圖譜分別確定了30和32個色譜峰，經(jīng)與對照品比對，指認(rèn)出8個成分，分別為X2 峰（5-羥甲基糠醛）、1 號峰（原兒茶酸）、2 號峰（原兒茶醛）、4 號峰（表兒茶素）、21 號峰（白楊素）、22 號峰（山奈素）、25 號峰（楊芽黃素）和26 號峰（圓柚酮）。鹽炙品相較于生品多兩個共有色譜峰，分別是峰X1 和峰X2。12 批益智仁生品及其鹽炙品HPLC指紋圖譜及混合對照品HPLC色譜圖見圖1～圖3。

圖1 益智仁生品高效液相色譜（HPLC）圖Figure 1 HPLC Chromatograms of the raw Alpiniae oxyphyllae Fructus（AOF）samples

圖2 益智仁鹽炙品高效液相色譜（HPLC）圖Figure 2 HPLC chromatograms of the salt-processed AOF

圖3 混合對照品溶液高效液相色譜（HPLC）圖Figure 3 HPLC chromatograms of mixed reference substances

2.5.2相似度評價 計算12 批益智仁生品和12 批鹽炙品與各自對照圖譜的相似度。結(jié)果見表1。12批益智仁生品和12 批益智仁鹽炙品的指紋圖譜相似度均良好，均在0.9以上。26號共有峰（圓柚酮）分離度及峰形較好，且峰面積較大，故將26 號峰作為參照峰（S）。以26 號峰為參照峰（S）計算各主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，結(jié)果12 批益智仁生品和鹽炙品的HPLC指紋圖譜中各共有峰相對保留時間的RSD 均小于0.1%，各共有峰相對峰面積的RSD 分別為3.37%～43.23%及3.99%～42.53%，共有峰峰面積之和占總峰面積的70.07%～75.83%及71.98%～77.14%。

表1 12 批益智仁生品和12 批鹽炙品指紋圖譜相似度比較Table 1 Fingerprint similarity results of 12 batches of raw and salt-processed AOF

2.6 HPLC 指紋圖譜的化學(xué)模式識別

2.6.1主成分分析（PCA） 采用SPSS 23.0軟件對12批益智仁生品及12批鹽炙品的HPLC指紋圖譜共有峰峰面積進(jìn)行主成分因子分析，得到主成分特征值、貢獻(xiàn)率、累計貢獻(xiàn)率和主成分碎石圖。見表2 和圖4。結(jié)果表明當(dāng)主成分為5 時，累計貢獻(xiàn)率達(dá)到90.15%，特征值均大于1，提示益智仁鹽炙前后的指紋圖譜中共有峰的大部分信息可以被這5個新變量替代。將12 批益智仁生品及12 批鹽炙品的HPLC 指紋圖譜共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA-P14.1 軟件進(jìn)行PCA分析，采用中心化模式，得到PCA 得分圖。結(jié)果見圖5。益智仁生品和鹽炙品大致被分別聚為一類。表明益智仁鹽炙前后化學(xué)成分有一定的差異。

表2 益智仁生品和鹽炙品主成分因子的特征值、貢獻(xiàn)率及累計方差貢獻(xiàn)率Table 2Eigenvalues， variance contribution rates and cumulative variance contribution rates of principal components factor of raw and salt-processed AOF

圖4 益智仁生品和鹽炙品主成分分析的碎石圖Figure 4 The score plot of principal component analysis（PCA）of raw and salt-processed AOF.

圖5 益智仁生品和鹽炙品PCA 得分圖Figure 5 PCA score plot of raw and salt-processed AOF

2.6.2正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA） 將12 批益智仁生品及12 批鹽炙品的HPLC 指紋圖譜共有峰峰面積導(dǎo)入到SIMCA-P14.1 軟件，采用OPLSDA 模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，監(jiān)督模型對X矩陣的解釋率R2X（cum）、對Y矩陣的解釋率R2Y（cum）和模型的預(yù)測能力Q2（cum）分別為0.893、0.950和0.835，均大于0.5，說明建立的模型準(zhǔn)確穩(wěn)定，可用于區(qū)分益智仁生品及其鹽炙品。由圖6可知，益智仁生品和鹽炙品被分別聚為一類。采用變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）法篩選出具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異標(biāo)志物，VIP值越大，對區(qū)分組的貢獻(xiàn)越大[15]。結(jié)果見圖7。以VIP＞1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出12 個影響益智仁生品與鹽炙品分組的成分，其影響程度依次為峰X1＞峰26（圓柚酮）＞峰16＞峰3＞峰X2（5-羥甲基糠醛）＞峰25（楊芽黃素）＞峰15＞峰12＞峰8＞峰10＞峰17＞峰20。表明這些成分對區(qū)分益智仁鹽炙前后樣品具有較大的貢獻(xiàn)，可作為潛在標(biāo)記物來評價益智仁鹽炙前后的質(zhì)量差異。將以上模型進(jìn)行200 次置換檢驗，結(jié)果見圖8。由圖8可知，R2和Q2截距值分別為0.613和-1.06，所有R2和Q2的左邊的點都低于最右邊的點，說明建立的OPLS-DA 模型未出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，具有較好的預(yù)測能力。

圖6 益智仁生品和鹽炙品OPLS-DA 得分圖Figure 6 OPLS-DA score plot of raw and salt-processed AOF

圖7 益智仁生品和鹽炙品VIP 值圖Figure 7 VIP value plot of raw and salt-processed AOF

圖8 益智仁生品和鹽炙品OPLS-DA 模型置換檢驗圖Figure 8 Permutation test chart of OPLS-DA model of raw and salt-processed AOF.

3 討論

3.1 樣品前處理與色譜條件選擇本實驗考察了不同提取方式（冷浸、超聲提?。⒉煌崛∪軇ㄋ?、不同濃度的甲醇和乙醇）以及不同提取時間（20、40 和60 min）對益智仁樣品提取效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)60%甲醇超聲提取時色譜峰最多，峰形較好；超聲提取40 min，即可基本提取完全。故本試驗選擇以60%甲醇超聲提取40 min 作為樣品溶液制備方法。同時還考察了不同流動相系統(tǒng)（甲醇∶水、乙腈∶水、乙腈∶不同濃度乙酸水）、梯度洗脫條件、流速（0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 和0.9 mL·min-1），柱溫（20、25、30、35 ℃）和檢測波長（240、250、260 和270 nm）等影響HPLC分離效果的因素。最終確定本研究的色譜條件。該色譜條件下色譜峰數(shù)量多，主要色譜峰峰形較好、分離度高。

3.2 益智仁鹽炙前后的HPLC 指紋圖譜分析本實驗建立了益智仁生品及鹽炙品各12 批樣品指紋圖譜，兩者相似度都在0.9以上，表明各批次的益智仁生品及鹽炙品都具有較好的一致性。益智仁生品及鹽炙品各共有峰相對峰面積的RSD 分別為3.37%～43.23%及3.99%～42.53%，共有峰峰面積之和占總峰面積的70.07%～75.83%及71.98%～77.14%，提示益智仁生品與鹽炙品各批次間雖然化學(xué)成分組成相似，但所含的化學(xué)成分相對含量差異較大。除此之外，經(jīng)對照品比對，指認(rèn)出1、2、4、21、22、25 和26 號峰分別是原兒茶酸、原兒茶醛、表兒茶素、白楊素、山奈素、楊芽黃素和圓柚酮，并發(fā)現(xiàn)益智仁鹽炙后新增兩個色譜峰，經(jīng)對照品比對，其中一個是5-羥甲基糠醛，這與李文兵的研究結(jié)果[13]相似，另一個色譜峰所代表的化學(xué)成分有待于進(jìn)一步研究。PCA 及OPLS-DA 結(jié)果顯示，益智仁生品及鹽炙品被分別聚為一類，表明益智仁鹽炙前后化學(xué)成分存在一定的差異。VIP 共篩選出12 個差異性標(biāo)志物，分別是X1、26（圓柚酮）、16、3、X2（5-羥甲基糠醛）、25（楊芽黃素）、15、12、8、10、17、20 號峰，提示這些成分可能是益智仁鹽炙前后主要的差異成分，可作為益智仁鹽炙潛在差異性標(biāo)志物。但本實驗僅確定了其中的26、X2和25號色譜峰所代表的成分，其余9個差異性成分有待進(jìn)一步確認(rèn)。

3.3 潛在差異性標(biāo)志物分析中醫(yī)認(rèn)為益智仁生品入脾，鹽炙入腎，生熟有別?，F(xiàn)代藥理研究[6，16]顯示，益智仁鹽炙后腸道燥性效應(yīng)降低，縮尿作用增加。本研究通過OPLS-DA 分析共篩選出圓柚酮、5-羥甲基糠醛和楊芽黃素等12 個潛在差異標(biāo)志物。圓柚酮可以明顯降低水負(fù)荷多尿大鼠模型尿量，延長模型大鼠首次排尿時間，可能是對益智仁縮尿功效有較大貢獻(xiàn)的成分[17]。秦貞苗等[18]測定了大鼠灌胃縮泉方制劑后尿、糞中的益智活性成分及代謝物，并在大鼠尿液中檢測到圓柚酮、益智酮甲和楊芽黃素，推測這3種成分可能是益智仁中發(fā)揮膀胱調(diào)節(jié)功能的活性成分，進(jìn)一步為圓柚酮和楊芽黃素作為益智仁鹽炙前后差異性標(biāo)志物的提供了證據(jù)。5-羥甲基糠醛是由葡萄糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下脫水產(chǎn)生的糠醛化合物，存在于多種單味中藥材中，也是許多中藥材炮制過程中的產(chǎn)物[19]。研究[20-21]表明，5-羥甲基糠醛具有抗氧化、抗過敏、降低血糖和神經(jīng)保護(hù)等藥理作用，同時也有腎毒性、致敏性，對眼、皮膚及呼吸道黏膜有一定的刺激性。本研究結(jié)果顯示，益智仁生品中僅有S1、S3和S5中測得5-羥甲基糠醛，而鹽炙品中均測出5-羥甲基糠醛，且含量較高，這可能是益智仁在鹽炙過程中溫度升高使多糖類成分發(fā)生美拉德反應(yīng)所產(chǎn)生或使其原有含量增加所致。有研究[22]報道，5-羥甲基糠醛含量變化與炮制程度具有一定關(guān)聯(lián)性，可作為判斷炮制終點的指標(biāo)用于區(qū)分生品和炮制品。但目前關(guān)于5-羥甲基糠醛與益智仁鹽炙前后功效相關(guān)的研究尚未有報道，還需做進(jìn)一步的藥效學(xué)研究。

本研究建立了益智仁鹽炙前后HPLC 指紋圖譜，所建立的方法有效、準(zhǔn)確。同時結(jié)合PCA及OPLS-DA判別分析，初步篩選出益智仁鹽炙前后變化的差異標(biāo)志物。該方法可對益智仁生品及鹽炙品質(zhì)量進(jìn)行綜合評價，并為益智仁鹽炙機(jī)制研究的提供參考。