王冠楠，王宏進(jìn)，苑楠楠，針濤，王佳雪，孫立新（. 沈陽藥科大學(xué)，遼寧本溪 7004；2. 遼寧省食品檢驗(yàn)檢測(cè)院，遼寧沈陽 068）

消炎退熱顆粒收錄于2020 年版《中國藥典》一部，是由大青葉、蒲公英、紫花地丁、甘草制成的復(fù)方制劑[1]，主要用于感冒發(fā)熱、上呼吸道感染、咽喉腫痛及各種瘡癤腫痛[2]。方中君藥大青葉有清熱解毒、涼血消斑的功效，是消炎退熱顆粒發(fā)揮療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)；臣藥蒲公英能夠解毒消腫、利尿通淋，可增強(qiáng)大青葉清熱解毒的功效；佐藥紫花地丁清熱解毒、涼血消腫，可以協(xié)調(diào)君臣二藥；使藥甘草具有清熱解毒、調(diào)和諸藥的作用。研究[3-7]發(fā)現(xiàn)，消炎退熱顆粒具有顯著的清熱解毒作用，但其作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于公共數(shù)據(jù)庫，以“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”為核心，能夠?qū)Α俺煞?靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行多層次分析，廣泛應(yīng)用于中藥活性化合物的作用機(jī)制研究[8-12]；分子對(duì)接技術(shù)是通過計(jì)算機(jī)模擬化合物與靶蛋白的相互作用，預(yù)測(cè)兩者間的親和力和結(jié)合方式，常被應(yīng)用于設(shè)計(jì)和篩選活性化合物，是藥物開發(fā)過程中重要的手段[13-14]。

目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)的中藥藥效物質(zhì)研究大多數(shù)是基于口服生物利用度和藥物相似性等預(yù)測(cè)性參數(shù)進(jìn)行篩選，而藥物發(fā)揮藥效的前提是進(jìn)入血液循環(huán)。因此，以口服后吸收入血成分作為藥效物質(zhì)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究更加準(zhǔn)確。本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果顯示，以UPLC-Q-Exactive MS 技術(shù)分析口服消炎退熱顆粒后的血清樣品，共鑒定出88 個(gè)入血成分，其中75 個(gè)原型成分，包括萜類化合物5 個(gè)、黃酮類化合物5 個(gè)、有機(jī)酸類化合物32 個(gè)、苯丙素類化合物14個(gè)和其他類型化合物19個(gè)；代謝產(chǎn)物13個(gè)，主要為甘草苷、甘草素、秦皮乙素及咖啡酸的代謝產(chǎn)物。在此基礎(chǔ)上，本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選消炎退熱顆粒的有效成分和核心靶點(diǎn)，并利用分子對(duì)接的方法進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)建立UPLC-MS/MS（超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）方法分析其主要活性成分含量，以期為消炎退熱顆粒的藥理學(xué)研究及質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器Acquity 超高效液相色譜儀、Micromass Quattro Micro API 質(zhì)譜儀和Masslynx V4.1色譜工作站（美國Waters公司）；JF1004萬分之一電子天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）；BT25S 十萬分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；XK96-A快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）；BKQ-100型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；L530型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 藥品及試劑綠原酸（批號(hào)：B20782）、咖啡酸（批號(hào)：B20660）、異甘草素（批號(hào)：B21525）、甘草素（批號(hào)：B20416）、甘草苷（批號(hào)：B20414）、甘草酸（批號(hào)：B20417）、秦皮乙素（批號(hào)：B20991）、靛玉紅（批號(hào)：B20298），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%，上海源葉生物科技有限公司。甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；甲酸、甲酸銨（色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；純化水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。16 批消炎退熱顆粒，來自A、B 兩藥企。A 廠樣品批號(hào)：ZGA1801、ZBA2002、ZEA2001、ZEA2003、ZBA2001、ZCA1901、ZHA1901（編號(hào)：A1～A7），B 廠樣品批號(hào)：19012、190806、200310、200313、190807、200224、200304、190407、190904（編號(hào)：B1～B9）。

1.3 主要軟件及數(shù)據(jù)庫CTD 數(shù)據(jù)庫（https：//ctdbase.org/）；Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/）；String 網(wǎng)站（https：//string-db.org/）；Cytoscape 3.9.1 軟件；SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch /）；微生信網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）；RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）；David 6.8 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）；Maestro 11.8軟件（美國Schrodinger公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接研究

2.1.1消炎退熱顆粒入血成分的靶點(diǎn)收集 通過UPLC-Q-Exactive MS 技術(shù)測(cè)定口服消炎退熱顆粒后的血清樣品，共鑒定出88個(gè)入血成分，見表1。通過Pubchem 數(shù)據(jù)庫查詢所鑒定化合物的SMILES，上傳到SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫，設(shè)置屬性為“Homo sapiens”，獲得化合物的相應(yīng)靶點(diǎn)。

表1 消炎退熱顆粒的入血化學(xué)成分Table 1 Ingredients absorked in the blood of Xiaoyan Tuire Granules

2.1.2藥物成分和疾病靶點(diǎn)的篩選 利用SwissTarget-Prediction 數(shù)據(jù)庫檢索到消炎退熱顆粒的成分靶點(diǎn)共813 個(gè)。采用“fever”和“inflammation”為關(guān)鍵詞，檢索CTD 數(shù)據(jù)庫，獲得發(fā)熱和炎癥疾病相關(guān)靶點(diǎn)47 410個(gè)。去除重復(fù)靶點(diǎn)，以inference score≥150.07為篩選條件，最終得到疾病靶點(diǎn)2 746 個(gè)。應(yīng)用Venny 2.1 取入血成分靶點(diǎn)和疾病相關(guān)靶點(diǎn)的交集，獲得405個(gè)共同靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 消炎退熱顆粒的成分-疾病交集靶點(diǎn)Figure 1 Intersection targets of components of Xiaoyan Tuire Granules-disease

2.1.3成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)。見圖2。應(yīng)用軟件中“Network Analyzer”功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，以網(wǎng)絡(luò)中連接度值（Degree值）為指標(biāo)篩選出消炎退熱顆粒入血成分中潛在的活性成分。該網(wǎng)絡(luò)包含483 個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 563 條邊。以Degree 值大于2 倍中位數(shù)篩選出甘草素、甘草次酸、阿魏酸、秦皮乙素、異甘草素、東莨菪素、靛玉紅、咖啡酸、綠原酸、甘草酸、甘草苷、紫檀素、大馬酮、7-乙酰氧基-2-甲基異黃酮、苯乙基內(nèi)酰脲、谷氨酰酪氨酸等16個(gè)重要成分。

圖2 消炎退熱顆粒的成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 The network of components of Xiaoyan Tuire Granules-disease targets

2.1.4蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的篩選 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 11.5 數(shù)據(jù)庫，選擇Multiple proteins、Homo sapiens，設(shè)置相互作用閾值（medium confidence＞0.9）及隱藏游離節(jié)點(diǎn)后進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，并通過CytoHubba 插件中的Degree 算法進(jìn)行分析，獲得評(píng)分前10 位的靶點(diǎn)。見圖4。結(jié)果顯示，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）和白細(xì)胞介素6（IL-6）等靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)。

圖3 消炎退熱顆粒的成分-疾病交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI network of intersection targets for components of Xiaoyan Tuire Granules-disease

圖4 消炎退熱顆粒的核心靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)（前10 位）Figure 4 PPI network of core targets of Xiaoyan Tuire Granules（top 10）

2.1.5GO功能與KEGG通路富集分析 將篩選的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo sapiens”，進(jìn)行基因本體生物學(xué)過程（gene-ontology biology process，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。以P＜0.01為篩選條件，選取有代表性的GO富集和KEGG通路。其中，GO富集共篩選出83 個(gè)條目，生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）條目分別為76、3、4 條。導(dǎo)入微生信網(wǎng)站作圖，其中展示生物過程前10條目（見圖5）。細(xì)胞凋亡信號(hào)通路（apoptotic signaling pathway）、絲裂原活化蛋白激酶級(jí)聯(lián)途徑（MAPK cascade）等對(duì)BP 影響較大；大分子復(fù)合物（macromolecular complex）、膜筏（membrane raft）和細(xì)胞外間隙（extracellular space）等對(duì)CC 影響較大；細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、相同蛋白結(jié)合（identical protein binding）、酶結(jié)合（enzyme binding）和一氧化氮合酶調(diào)節(jié)劑活性（nitricoxide synthase regulator activity）對(duì)MF 影響較大。KEGG 通路富集分析篩選出72 個(gè)KEGG 富集條目，根據(jù)P值篩選出前16 條密切相關(guān)的通路。見表2。結(jié)果顯示，人巨細(xì)胞病毒感染信號(hào)通路（Human cytomegalovirus infection）、 TNF 信號(hào)通路（TNF signaling pathway）和MAPK 信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）等為主要的富集通路。

表2 消炎退熱顆粒與炎癥和發(fā)熱密切相關(guān)的信號(hào)通路（前16 條）Table 2 Pathways closely associated with fever and inflammation for Xiaoyan Tuire Granules（top 16）

2.1.6構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò) 將消炎退熱顆粒的關(guān)鍵成分、核心靶點(diǎn)和信號(hào)通路導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，用其插件“Network analyzer”功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。將關(guān)鍵成分、核心靶點(diǎn)和信號(hào)通路導(dǎo)入Cytoscape 軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。見圖6。網(wǎng)絡(luò)圖包含98 個(gè)節(jié)點(diǎn)和354條邊。以節(jié)點(diǎn)Degree值大小為指標(biāo)，16個(gè)化合物Degree 值差異不大，均可能是消炎退熱顆粒的關(guān)鍵成分；72條作用通路Degree值范圍為3～8，其中AGE-RAGE 信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway，Degree=8）、阿爾茨海默病信號(hào)通路（Alzheimer disease，Degree=8）、絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路（MAPK signaling pathway， Degree=7）、 癌癥信號(hào)通路（Pathways in cancer，Degree=7）、人巨細(xì)胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection，Degree=7）、沙門氏菌感染（Salmonella infection，Degree=7）的連接度高于其他信號(hào)通路，可能為消炎退熱顆粒的關(guān)鍵信號(hào)通路。

圖6 消炎退熱顆粒的主要活性成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖Figure 6 The ＂active components-core targets-signaling pathways＂ network diagram of Xiaoyan Tuire Granules

2.1.7分子對(duì)接 將篩選出的活性成分與核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的陽性藥進(jìn)行分子對(duì)接，預(yù)測(cè)蛋白-分子相互作用的結(jié)合能。其中，化合物的mol2 文件來自PubChem數(shù)據(jù)庫，從PDB 數(shù)據(jù)庫獲取蛋白晶體結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)入Maestro 11.8 軟件。蛋白大分子先后通過Protein preparation wizard 模塊、Sample water orientations、OPLS3e 模塊進(jìn)行優(yōu)化，并以原始配體小分子為中心，生成大小為25 ?×25 ?×25 ? 的對(duì)接盒子文件。在LigPre 模塊中進(jìn)行化合物優(yōu)化，生成pH 值（7.0±2.0）下的離子化狀態(tài)，加氫、去鹽，合成互變異構(gòu)體，選擇“XP”超精密對(duì)接，并由Glide中“docking score”打分函數(shù)對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果見圖7。16個(gè)成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能均小于0 kJ·mol-1，表明藥物分子與靶蛋白的相互作用穩(wěn)定。進(jìn)一步可視化分析結(jié)果顯示，各化合物均能夠與對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)通過氫鍵形成穩(wěn)定結(jié)合。見圖8。咖啡酸、綠原酸和甘草苷可與AKT1 相互作用，作用于其殘基賴氨酸（LYS）179、天冬氨酸（ASP）292、丙氨酸（ALA）230 和精氨酸（ARG）4。秦皮乙素、靛玉紅、苯乙基內(nèi)酰脲和異甘草素可與TNF 相互作用，作用于其殘基亮氨酸（LEU）172、亮氨酸（LEU）168、天冬酰胺（ASN）119、天冬酰胺（ASN）171 和天冬氨酸（ASP）158。甘草素、大馬酮、7-乙酰氧基-2-甲基異黃酮、東莨菪素和紫檀素可與EGFR相互結(jié)合，作用于其殘基賴氨酸（LYS）745、天冬氨酸（ASP）855、蘇氨酸（THR）854、異亮氨酸（ILE）759和半胱氨酸（CYS）775。甘草次酸、阿魏酸、甘草酸和谷氨酰酪氨酸可與CASP3相互作用，作用于其殘基賴氨酸（LYS）210、天冬酰胺（ASN）208、絲氨酸（SER）209、絲氨酸（SER）65、精氨酸（ARG）64和精氨酸（ARG）207。

圖7 消炎退熱顆粒主要活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接的評(píng)分熱圖Figure 7 Scoring heat map of main active important components and key targets of Xiaoyan Tuire Granules

圖8 消炎退熱顆粒主要活性成分與核心靶點(diǎn)的模擬對(duì)接圖Figure 8 Simulated docking diagram of main active components and core targets of Xiaoyan Tuire Granules

2.2 消炎退熱顆粒的含量測(cè)定

2.2.1色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.25 mL·min-1；流動(dòng)相：0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸-5 mmol·L-1甲酸銨（B），梯度洗脫（0～1.0 min，15% A；1.0～3.0 min，15%～40%A；3.0～11.0 min，40%A；11.0～11.1 min，40%～15%A）；進(jìn)樣室溫度：4 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子化源（ESI 源）；檢測(cè)模式：正負(fù)離子掃描模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）；離子源溫度為120 ℃；脫溶劑溫度為300 ℃；離子源電壓為3.5 kV。8種成分的質(zhì)譜分析條件參數(shù)見表3。

表3 8 種化合物的質(zhì)譜條件參數(shù)Table 3 Mass spectrometric parameters of 8 compounds

2.2.2溶液的配制 均在避光下操作。

2.2.2.1 供試品溶液制備 取消炎退熱顆粒，研細(xì)，取粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中。精密加入甲醇2.0 mL，密塞，稱定質(zhì)量。超聲提取20 min（250 W，40 kHz），放冷。再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量。搖勻，取上清液用0.22 μm 濾膜濾過，棄去初濾液，續(xù)濾液為供試品溶液。

2.2.2.2 對(duì)照品溶液制備 取靛玉紅、異甘草素、甘草苷、甘草素、甘草酸、咖啡酸、綠原酸和秦皮乙素適量，除靛玉紅加三氯甲烷2.0 mL 溶解外，其余均加甲醇配制成單一成分的對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇分別配制成上述成分的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅰ和混合對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅱ，其濃度見表4。

表4 各對(duì)照品及混合對(duì)照品儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度（μg·mL-1）Table 4 The comantration of each reference substance and mixed standard solutions（μg·mL-1）

2.2.3專屬性 分別取空白溶劑（甲醇）、供試品溶液以及混合對(duì)照品溶液（為“2.2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅰ稀釋10 倍），按“2.2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣分析。見圖9。結(jié)果表明該方法專屬性良好，提取溶劑不干擾8種成分的含量測(cè)定。

圖9 消炎退熱顆粒中8 種化合物的質(zhì)譜圖Figure 9 UPLC-MS/MS chromatograms of 8 compounds in Xiaoyan Tuire Granules

2.2.4線性與范圍 分別精密量取“2.2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅰ1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，置10 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列濃度的混合對(duì)照品溶液。分別取上述溶液進(jìn)樣分析，以對(duì)照品溶液的濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得各化合物的回歸方程。結(jié)果見表5。

表5 8 種化合物的線性關(guān)系考察結(jié)果Table 5 The results of linear relationships test of 8 components

2.2.5檢測(cè)限和定量限 精密吸取單一對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，不斷稀釋已知濃度的對(duì)照品溶液，以信噪比為3∶1 和10∶1 分別計(jì)算檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結(jié)果見表5。

2.2.6精密度 精密吸取“2.2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅱ，按上述檢測(cè)條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各峰面積。結(jié)果靛玉紅、異甘草素、甘草素、甘草酸、甘草苷、秦皮乙素、咖啡酸、綠原酸峰面積的RSD 分別為4.8%、4.7%、4.6%、4.2%、4.2%、5.0%、5.0%、4.5%，表明該方法精密度良好。

2.2.7重復(fù)性稱取消炎退熱顆粒（批號(hào)：200304）共6份，每份約0.2 g，精密稱定，按“2.2.2.1”項(xiàng)下平行制備6份供試品溶液，依法分別測(cè)定。結(jié)果靛玉紅、異甘草素、甘草素、甘草酸、甘草苷、秦皮乙素、咖啡酸、綠原酸峰面積的RSD 分別為3.0%、4.4%、5.2%、5.5%、4.1%、2.4%、4.1%、4.7%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.8穩(wěn)定性 取消炎退熱顆粒（批號(hào)：200304）供試品溶液，室溫放置，按上述檢測(cè)條件分別于0、4、6 和12 h 進(jìn)樣分析。結(jié)果靛玉紅、異甘草素、甘草素、甘草酸、甘草苷、秦皮乙素、咖啡酸、綠原酸峰面積的RSD 分別為2.7%、2.8%、2.7%、2.8%、2.9%、1.8%、3.4%、2.4%，結(jié)果表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9準(zhǔn)確度 取已知含量（批號(hào)：200304）的消炎退熱顆粒6份，每份約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入精密量取的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅱ1.0 mL，按“2.2.2.1”項(xiàng)下方制備供試品溶液，平行制備6份，進(jìn)樣分析。結(jié)果靛玉紅、異甘草素、甘草素、甘草酸、甘草苷、秦皮乙素、咖啡酸和綠原酸的平均加樣回收率分別為92.8%、90.5%、93.6%、93.7%、95.7%、97.8%、93.1%和92.9%，RSD 分別為2.8%、2.1%、4.3%、4.2%、4.8%、4.3%、2.2%和5.3%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2.10耐用性 取消炎退熱顆粒（批號(hào)：200304）供試品溶液，對(duì)“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件中的流速（0.20、0.25、0.30 mL·min-1）、柱溫（38、40、42 ℃）、甲酸體積分?jǐn)?shù)（0.09%、0.10%、0.11%）等參數(shù)進(jìn)行調(diào)整后，測(cè)定樣品含量，以考察本方法的耐用性。結(jié)果顯示，不同條件下進(jìn)樣測(cè)定，各成分峰面積的RSD均小于3.5%，表明該方法耐用性良好。

2.2.11樣品的含量測(cè)定 取16 批消炎退熱顆粒，按“2.2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計(jì)算出8種成分的含量，結(jié)果見表6。8 種成分中以秦皮乙素的含量為最高，平均含量為208.69 μg·g-1；甘草酸次之，為113.85 μg·g-1；咖啡酸和甘草苷的平均含量為16.25和7.34 μg·g-1；而靛玉紅、甘草素、異甘草素和綠原酸的含量相對(duì)較低，平均含量僅為1.67、1.66、2.20、3.32 μg·g-1。進(jìn)一步對(duì)2個(gè)廠家樣品中8種成分平均含量進(jìn)行方差分析。結(jié)果顯示，咖啡酸、甘草酸和秦皮乙素的含量無顯著性差異（P＞0.05），而靛玉紅、甘草素、異甘草素、甘草苷和綠原酸的含量有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05）。

表6 16 批消炎退熱顆粒中8 種化合物的含量測(cè)定結(jié)果（±s，μg·g-1；n=3）Table 6 Contents of 8 analytes in 16 batches of Xiaoyan Tuire Granules（±s，μg·g-1；n=3）

注：兩廠家8種成分含量比較，**P＜0.01，*P＜0.05

綠原酸3.47±0.38 5.58±0.86 3.74±0.28 3.69±0.47 4.00±0.30 3.64±0.56 4.90±0.09 2.27±0.10 2.43±0.13 3.80±0.33 2.61±0.30 1.99±0.05 2.46±0.12 2.83±0.49 3.20±0.32 2.55±0.16 4.15±0.73 2.68±0.51**編號(hào)A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 A1～A7 B1～B9靛玉紅1.04±0.04 1.24±0.07 1.28±0.08 1.39±0.06 1.13±0.04 1.75±0.18 1.19±0.02 2.03±0.14 0.94±0.06 2.76±0.06 1.69±0.15 1.20±0.12 1.64±0.06 3.41±0.18 2.62±0.61 1.47±0.09 1.29±0.21 1.97±0.76*異甘草素3.85±0.27 1.83±0.19 5.61±0.19 2.22±0.06 4.14±0.23 1.89±0.09 4.33±0.13 1.24±0.17 1.23±0.10 1.51±0.01 1.34±0.25 1.24±0.10 0.99±0.10 1.29±0.06 1.31±0.21 1.20±0.04 3.41±1.34 1.26±0.13**甘草苷2.31±0.08 1.18±0.03 5.84±0.29 1.51±0.05 3.65±0.45 1.44±0.07 2.60±0.15 0.87±0.07 0.89±0.04 0.97±0.02 0.86±0.08 0.81±0.05 0.80±0.02 0.84±0.06 0.90±0.03 1.01±0.04 2.65±1.52 0.88±0.07**甘草酸104.99±13.19 112.74±0.86 138.32±4.16 113.50±4.86 134.47±10.61 96.79±2.31 141.11±3.90 100.30±12.13 101.90±2.64 139.20±4.79 119.23±15.03 85.48±22.61 96.87±0.18 101.89±19.73 129.03±3.21 105.83±2.72 120.27±16.25 108.86±16.00甘草素6.79±0.55 10.09±0.61 10.01±0.35 9.10±0.05 9.49±0.84 9.77±0.23 9.35±0.83 5.80±0.78 5.64±0.43 6.81±0.53 6.48±0.97 4.30±0.24 5.45±0.11 5.10±0.44 6.57±1.09 6.70±0.60 9.23±1.05 5.87±0.80**秦皮乙素152.35±7.34 187.17±16.08 219.28±4.52 168.85±0.65 271.80±20.26 181.58±6.61 194.01±9.21 209.68±3.43 197.93±3.90 262.31±5.89 205.47±14.27 207.37±10.75 232.93±4.56 255.99±9.11 217.56±11.09 174.81±2.22 196.43±36.29 218.23±26.32咖啡酸15.55±0.83 17.14±1.67 12.92±0.59 8.60±0.12 12.02±1.43 15.21±1.70 22.44±1.90 16.67±1.85 11.31±0.55 26.94±1.15 17.79±3.21 11.69±0.24 14.02±0.92 21.00±2.84 20.21±1.55 16.61±0.49 14.84±4.04 17.36±4.65

3 討論

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接研究本研究從消炎退熱顆粒中篩選出16個(gè)潛在的有效成分，并獲得10個(gè)相應(yīng)的核心靶點(diǎn)。其中咖啡酸能夠清除由中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基，降低促炎癥因子的表達(dá)[15]；甘草酸可通過抑制IL-18 的生成，下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9）的含量，從而發(fā)揮抗炎活性[16]；甘草素能夠抑制蛋白激酶（AKT），降低炎癥反應(yīng)，起到細(xì)胞保護(hù)作用[17]；異甘草素可降低巨噬細(xì)胞中前列腺素PGE2 和NO 的生成，以發(fā)揮抗炎作用；甘草苷可抑制髓過氧化物酶（MPO）活性，抑制細(xì)胞間黏附因子1（ICAM-1）的表達(dá)，降低組織炎性損傷[18]；靛玉紅能夠顯著降低脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7 炎癥細(xì)胞模型IL-6、TNF-α 的濃度，具有顯著的體外抗炎作用[19]；秦皮乙素能夠降低NO 的分泌，調(diào)節(jié)血管收縮，減輕組織器官的炎性損傷[20]；綠原酸能夠螯合金屬離子和清除自由基，調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/ERK/c-Jun 氨基末端激酶信號(hào)通路來降低組織的炎癥反應(yīng)[21]。

靶點(diǎn)篩選結(jié)果顯示，AKT1、TNF、IL6、JUN、IL1β、CASP3、EGFR、VEGFA、CTNNB1、GAPDH與核心成分的連接度值較高，推測(cè)可能是消炎退熱顆粒發(fā)揮作用的核心靶點(diǎn)。其中AKT1在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖及糖代謝的過程中起著重要作用。同時(shí)，能調(diào)節(jié)AKT1的表達(dá)以影響下游靶點(diǎn)，從而改善炎癥反應(yīng)[22]；TNF、IL-1β、IL-6 為典型的促炎細(xì)胞因子，能夠?qū)ρ装Y和免疫調(diào)節(jié)起促進(jìn)作用，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)程度[23]。TNF不僅直接促進(jìn)炎癥基因表達(dá)，還能間接地促使細(xì)胞死亡、誘導(dǎo)炎癥免疫反應(yīng)；IL-1β可誘導(dǎo)多種促炎介質(zhì)，如細(xì)胞因子和趨化因子，加重炎癥反應(yīng)；IL-6 可促進(jìn)炎癥部位單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)過度表達(dá)，促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)；JUN蛋白家族是炎癥中最重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，可通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞中促炎基因的轉(zhuǎn)錄從而增加促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[24]；EGFR、CASP3、VEGFA、CTNNB1 和GAPDH基因均參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、黏附和遷移等生理過程，在炎癥進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用[25-27]。

本研究進(jìn)一步對(duì)消炎退熱顆粒的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集于炎癥信號(hào)通路，如人巨細(xì)胞病毒（HCMV）通路、MAPK 信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號(hào)通路、Toll 樣受體（TLR）信號(hào)通路和TNF 信號(hào)通路等。其中MAPK 信號(hào)通路是最常見的炎癥信號(hào)通路，MAPKs 是絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶，是細(xì)胞膜表面受體與基因表達(dá)的重要信號(hào)調(diào)節(jié)酶[28]；HCMV感染可促進(jìn)患兒TLR4/p38 MAPK 信號(hào)通路激活，加重肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)和損傷，抑制該靶點(diǎn)能產(chǎn)生良好抗炎效果[29]；HIF-1α/BNIP3/Beclin-1 通路是線粒體自噬的激活通路，存在于線粒體外膜、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜，是線粒體自噬的重要調(diào)控蛋白，激活HIF-1通路能有效降低炎癥水平[30]； TLR介導(dǎo)的先天性免疫系統(tǒng)失調(diào)是炎癥機(jī)制的核心參與者，TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體防御的相關(guān)基因，包括炎癥細(xì)胞因子、趨化因子和抗原提呈分子，調(diào)節(jié)TLR能夠平衡機(jī)體免疫功能，改善炎癥水平[31]。

通過分子對(duì)接研究進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)16 個(gè)成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)均有良好的親和力，可能為潛在的活性成分。可視化分析結(jié)果顯示，各化合物均能夠與對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)通過氫鍵形成穩(wěn)定結(jié)合，預(yù)測(cè)消炎退熱顆?？赡芡ㄟ^多成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮藥效作用。

3.2 含量測(cè)定研究本研究建立了UPLC-MS/MS法測(cè)定上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的消炎退熱顆粒清熱抗炎的潛在活性成分。由于甘草次酸、阿魏酸、東莨菪素、紫檀素、大馬酮、7-乙酰氧基-2-甲基異黃酮、苯乙基內(nèi)酰脲、谷氨酰-酪氨酸等成分在樣品中含量較低未能檢出，因此僅對(duì)靛玉紅、異甘草素、甘草素、甘草酸、甘草苷、秦皮乙素、咖啡酸、綠原酸8 種成分進(jìn)行含量測(cè)定。

本研究應(yīng)用超聲提取法，考察了提取溶劑[甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙酸乙酯-甲醇（1∶1）、乙酸乙酯]、料液比（1∶1、1∶2、1∶5、1∶10 和1∶15）、超聲時(shí)間（15、20 、30 min），確定最佳提取條件為料液比1∶10，用甲醇超聲提取20 min。在色譜條件優(yōu)化過程中，分別考察了乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸-5 mmol·L-1甲酸銨和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸-10 mmol·L-1甲酸銨作為流動(dòng)相，其中甲醇-水和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸-10 mmol·L-1甲酸銨作為流動(dòng)相時(shí)，色譜柱壓力較大，不適合批量進(jìn)樣；乙腈-水和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸作為流動(dòng)相時(shí)，靛玉紅的峰形拖尾嚴(yán)重；以0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸-5 mmol·L-1甲酸銨作為流動(dòng)相時(shí)，各成分峰形較好。含量測(cè)定結(jié)果顯示，靛玉紅、異甘草素、甘草素、甘草酸、甘草苷、秦皮乙素、咖啡酸和綠原酸在各個(gè)批次的消炎退熱顆粒中均能檢出并定量。其中2個(gè)廠家的消炎退熱顆粒中秦皮乙素的平均含量分別達(dá)到218.23 和196.43 μg·g-1，含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于2020 年版《中國藥典》中秦皮乙素的規(guī)定（每袋不得少于0.3 mg）。同時(shí)方差分析結(jié)果顯示，兩個(gè)廠家的樣品中靛玉紅、甘草素、異甘草素、甘草苷和綠原酸的含量有顯著性差異。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對(duì)接技術(shù)，發(fā)現(xiàn)消炎退熱顆粒入血成分中潛在的16 種活性成分及其可能干預(yù)的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路，建立了UPLC-MS/MS 法測(cè)定其中的8 種活性成分的含量，并應(yīng)用該分析方法對(duì)市售16 個(gè)批次的消炎退熱顆粒進(jìn)行測(cè)定。該方法準(zhǔn)確、簡便，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)消炎退熱顆粒中多成分的定量分析，可為其進(jìn)一步的機(jī)理研究及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。