梁嬌，茆文莉，張力升，侯聰艷，陳思柔，張韌，何彥麗（廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006）

黑色素瘤是起源于表皮黑素細(xì)胞的惡性腫瘤，惡性程度高，具有高度侵襲性，其死亡率逐年升高，尚缺乏特效的治療手段。目前臨床上常使用放化療及靶向治療，但容易產(chǎn)生不良反應(yīng)和耐藥。因此，尋找新型、安全、有效的抑制黑色素瘤生長，減少其轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的藥物具有重要意義。粉防己堿又名漢防己甲素，是從中藥粉防己（StephaniatetrandraS.Moor）根中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿（結(jié)構(gòu)見圖1），具有抗腫瘤、抗炎、抗過敏、免疫抑制、鈣通道阻滯劑、抗氧化、抗菌等藥理作用[1]。其能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、自噬，抑制其增殖、遷移、侵襲，逆轉(zhuǎn)多重耐藥性等途徑，對肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用[1-2]。目前，粉防己堿對黑色素瘤轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制尚未見報(bào)道。因此，本研究擬觀察粉防己堿對小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16增殖、遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）方面的作用，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接方法探討其作用機(jī)制，通過體外實(shí)驗(yàn)對相關(guān)通路進(jìn)行驗(yàn)證，以期為粉防己堿抗黑色素瘤的藥理研究及臨床應(yīng)用提供參考。

圖1 粉防己堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Structure of tetrandrine

1 材料

1.1 細(xì)胞及動物小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，購自美國ATCC 細(xì)胞庫，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠18 只，體質(zhì)量20～24 g，7～8 周齡，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2018-0034，動物質(zhì)量合格證號：44005800013707。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)，批文號：20211230007。

1.2 藥物及試劑粉防己堿（批號：A0065，純度≥98%），成都曼思特生物科技有限公司；AKT 激動劑SC79（批號：SF2730，純度≥98%），上海碧云天生物科技有限公司；CCK-8 細(xì)胞活力檢測試劑盒（批號：MA0218），大連美侖生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白定量檢測試劑盒（批號：KGP903），南京凱基生物科技公司；E-鈣黏蛋白（E-cadherin，批號：3195）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin，批號：13116）、波形蛋白（Vimentin，批號：5741）、p-AKT（批號：4060）、AKT（批號：4691）、CREB（批號：9197）、p-CREB（批號：9198）、NF-κB p65（批號：8242）、p-NF-κB p65（批號：3033）、GAPDH（批號：5174）抗體，均購自美國CST 公司；羊抗兔IgG 二抗（批號：AS014），武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.3 主要儀器FORMA 371 型細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher 公司；Cence L600 型自動平衡離心機(jī)，湖南湘儀儀器有限公司；iMark型酶標(biāo)儀、Powerpac300型電泳儀，美國Bio-Rad公司；Eclipse TS100-F型倒置顯微鏡，日本尼康公司；Tanon-5200 型全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；Gene Speed 1730R型高速離心機(jī)，上?；蚩萍加邢薰尽?/p>

1.4 數(shù)據(jù)庫及軟件CTD 數(shù)據(jù)庫（http：//ctdbase.org）、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch）、 Similarity Ensemble Approach 數(shù)據(jù)庫（http：//sea.bkslab.org）、GeneCard數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）、UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）、Venny 可視化分析平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）、STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.org）、DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）、微生信在線平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn）、PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www1.rcsb.org），以及Cytoscape 3.7.1 軟件、OpenBabel 3.1.1 軟件、AutoDock 軟件。

2 方法

2.1 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖情況收集對數(shù)生長期的B16細(xì)胞，以每孔100 μL體積（細(xì)胞數(shù)為2×103個(gè)）接種于96 孔板中；細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度為0、2、4、6、8、10 μmol·L-1粉防己堿干預(yù)24、48 h；然后加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃下孵育3 h后，采用酶標(biāo)儀測定450 nm 波長下的各孔吸光度（A）值。計(jì)算：細(xì)胞相對活力（%）=（A實(shí)驗(yàn)組/A對照組）×100%，以及半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)收集對數(shù)生長期的B16 細(xì)胞，接種在6 孔板（每孔1×103個(gè)），培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)；然后分別加入不同濃度粉防己堿（1、2、4 μmol·L-1）干預(yù)，對照組加入1% DMSO；3 d 更換1 次培養(yǎng)液，培養(yǎng)10 d后，棄上清；4%多聚甲醛溶液固定30 min，采用結(jié)晶紫染色后在倒置顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算細(xì)胞集落形成能力。

2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)收集對數(shù)生長期的B16細(xì)胞，接種于6 孔板（每孔6×105個(gè)），待細(xì)胞鋪滿后進(jìn)行劃痕操作；加入不同濃度的粉防己堿（1、2、4 μmol·L-1）繼續(xù)培養(yǎng)，對照組加入1% DMSO；采用倒置顯微鏡于0、12、24 h觀察并拍照。計(jì)算：細(xì)胞劃痕愈合率（%）=（對照組劃痕寬度/實(shí)驗(yàn)組劃痕寬度）×100%。

2.4 Transwell 小室侵襲實(shí)驗(yàn)收集低血清培養(yǎng)12 h后的B16細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸；以每孔200 μL（5×104個(gè)）細(xì)胞懸液接種到鋪有Matrigel 膠的24 孔板上室內(nèi)，下室加入700 μL 含藥（1、2、4 μmol·L-1粉防己堿）培養(yǎng)基，對照組加入1% DMSO；孵育24 h后，用棉簽擦去上室細(xì)胞，然后用4%多聚甲醛溶液固定；再用0.1%結(jié)晶紫染色后，在顯微鏡下拍照記錄，采用ImageJ 軟件分析結(jié)果。計(jì)算：細(xì)胞侵襲率（%）=結(jié)晶紫染色面積/小室面積×100%。

2.5 Western Blot 法檢測B16 細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)水平收集對數(shù)生長期的B16細(xì)胞，接種于6孔板（每孔1.5×105個(gè)）；培養(yǎng)過夜后加入不同濃度的粉防己堿（1、2、4 μmol·L-1），對照組加入1% DMSO；繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，加入含1%PMSF 的RIPA 裂解液，提取總蛋白并采用BCA 法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為30 μg，通過SDS-PAGE 凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜；用5%脫脂奶粉封閉3 h后，分別加入E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH 一抗（1∶1 000），4 ℃下孵育過夜；洗膜后，加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫下孵育1 h；TBST 洗膜，采用ECL 化學(xué)發(fā)光顯影，掃描；使用ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，對目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

2.6 小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移觀察實(shí)驗(yàn)取18 只7～8 周齡C57BL/6J 雄性小鼠，尾靜脈注射2×105個(gè)B16 細(xì)胞，復(fù)制小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型。將造模小鼠隨機(jī)分為3組：模型對照組（生理鹽水）、粉防己堿低劑量組（50 mg·kg-1）和粉防己堿高劑量組（100 mg·kg-1），每組6 只。隨即開始粉防己堿灌胃給藥，每2 d 灌胃1 次，連續(xù)2 周。給藥結(jié)束后，小鼠頸椎脫臼處死，剝?nèi)》尾拷M織、拍照，觀察并計(jì)數(shù)肺部轉(zhuǎn)移的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)。

2.7 粉防己堿治療黑色素瘤的關(guān)鍵靶點(diǎn)收集與篩選通過CTD、SwissTargetPrediction 和Similarity Ensemble Approach數(shù)據(jù)庫檢索粉防己堿的作用靶點(diǎn)；以“Melanoma”為關(guān)鍵詞，通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲取黑色素瘤的疾病相關(guān)靶點(diǎn)；對粉防己堿作用靶點(diǎn)與黑色素瘤疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集，所得交集基因即為粉防己堿治療黑色素瘤的潛在作用靶點(diǎn)。利用UniProt 平臺對上述基因名稱進(jìn)行規(guī)范。

2.8 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將粉防己堿治療黑色素瘤的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析；將網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)結(jié)果保存為“TSV”格式文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件中，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用Cytoscape 3.7.1 軟件內(nèi)置工具分析PPI 網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)，包括連接度（Degree）、介度（Betweenness）及緊密度（Closeness），并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)判斷核心靶點(diǎn)。

2.9 GO 功能及KEGG 通路富集分析將粉防己堿治療黑色素瘤的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析。GO功能分析主要包括生物過程（Biologicalprocess，BP）、分子功能（Molecular function，MF）和細(xì)胞組分（Cell component，CC）。通過微生信平臺對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行可視化處理，并分析粉防己堿抗黑色素瘤的作用機(jī)制。

2.10 分子對接選擇PPI網(wǎng)絡(luò)中的潛在核心靶點(diǎn)與粉防己堿進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。利用PubChem 數(shù)據(jù)庫下載粉防己堿的三維結(jié)構(gòu)SDF 格式文件；通過OpenBabel 3.1.1 軟件轉(zhuǎn)化成Mol2 格式，即小分子配體；通過PDB 數(shù)據(jù)庫獲取核心靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)PDF格式文件，即大分子受體蛋白；最后，將小分子配體與大分子受體蛋白通過AutoDock軟件進(jìn)行分子對接。

2.11 Western Blot 法檢測B16 細(xì)胞AKT/NF-κB/CREB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)①收集對數(shù)生長期的B16細(xì)胞接種于6 孔板（每孔1.5×105個(gè)），培養(yǎng)過夜；然后加入不同濃度的粉防己堿（1、2、4 μmol·L-1）干預(yù)，對照組加入1% DMSO；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞，按照“2.5”項(xiàng)下方法檢測AKT、p-AKT、NF-κB p65、p-NF-κB p65、CREB、p-CREB蛋白表達(dá)情況。②收集對數(shù)生長期的B16細(xì)胞接種于6孔板（每孔1.5×105個(gè)），培養(yǎng)過夜；將細(xì)胞分為3 組，分別加入2 μmol·L-1粉防己堿、5 μmol·L-1SC79、2 μmol·L-1粉防己堿+5 μmol·L-1SC79；繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，收集各組細(xì)胞，按照“2.5”項(xiàng)下方法檢測p-AKT、p-NF-κB p65、p-CREB蛋白表達(dá)情況。

2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用Graphpad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用Turkey 檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 粉防己堿對B16 細(xì)胞增殖及其克隆形成的影響結(jié)果見圖2、圖3。與對照組（0 μmol·L-1）比較，4、6、8、10 μmol·L-1粉防己堿組的細(xì)胞相對活力均顯著降低（P＜0.001），且呈現(xiàn)濃度依賴性。粉防己堿干預(yù)24、48 h 的IC50分別為4.273、4.085 μmol·L-1。因此選取終濃度分別為1、2、4 μmol·L-1的粉防己堿進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與對照組比較，1、2、4 μmol·L-1粉防己堿組的細(xì)胞集落形成能力顯著降低（P＜0.01，P＜0.001）。結(jié)果表明，粉防己堿對B16細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用。

圖2 不同濃度粉防己堿（Tet）對B16 細(xì)胞增殖的影響（±s，n=6）Figure 2 Effect of tetrandrine on the proliferation of B16 cells（±s，n=6）

圖3 粉防己堿（Tet）對B16 細(xì)胞集落形成能力的影響（±s，n=6）Figure 3 Effect of tetrandrine on the colony formation of B16 cells（±s，n=6）

3.2 粉防己堿對B16 細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響結(jié)果見圖4、圖5。與對照組比較，1、2、4 μmol·L-1粉防己堿濃度組的細(xì)胞劃痕愈合率、細(xì)胞侵襲率均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。結(jié)果表明，粉防己堿能有效抑制B16細(xì)胞的遷移及侵襲。

圖4 粉防己堿（Tet）對B16 細(xì)胞遷移能力的影響（×100；±s，n=3）Figure 4 Effect of tetrandrine on the migration ability of B16 cells（×100；±s，n=3）

圖5 粉防己堿（Tet）對B16 細(xì)胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，×200；±s，n=3）Figure 5 Effect of tetrandrine on the metastasis ability of B16 cells（Crystal violet staining，×200；±s，n=3）

3.3 粉防己堿對B16 細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖6。與對照組比較，1、2、4 μmol·L-1粉防己堿組的B16 細(xì)胞Vimentin、N-cadherin 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01，P＜0.001），E-cadherin 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01，P＜0.001）。結(jié)果表明，粉防己堿能夠抑制黑色素瘤B16細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

圖6 粉防己堿（Tet）對B16 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Figure 6 Effects of tetrandrine on the expression of EMT-related proteins in B16 cells（±s，n=3）

3.4 粉防己堿對黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型小鼠的影響結(jié)果見圖7。與模型對照組比較，粉防己堿高劑量組小鼠的黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少（P＜0.05）。結(jié)果表明，粉防己堿能夠抑制小鼠黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移。

圖7 粉防己堿（Tet）抑制小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的情況（±s，n=6）Figure 7 Effect of tetrandrine on lung metastasis of melanoma in mice（±s，n=6）

3.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析將粉防己堿作用靶點(diǎn)與黑色素瘤疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集，共得到60 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。利用STRING 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行交集靶點(diǎn)的PPI 分析，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖8。圖中節(jié)點(diǎn)的大小、顏色與Degree值呈正相關(guān)，Degree 值越大，節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深。進(jìn)一步篩選出TNF、RELA、CHUK、ATM、BCL2、IL1B、ICAM1、NFKBIA、AKT1、PRKAA1、CDKN1B、CCND1、CDKN1A、COL2A1、FOXO3、CASP9、CREBBP 等核心靶點(diǎn)，其中AKT1為相互作用最強(qiáng)的靶點(diǎn)，可能是粉防己堿治療黑色素瘤的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖8 粉防己堿治療黑色素瘤潛在作用靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Figure 8 PPI network of potential targets of tetrandrine in the treatment of melanoma

GO 功能富集分析結(jié)果見圖9，BP 條目主要涉及I-κB激酶/NF-κB信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡的過程等；CC 條目主要涉及細(xì)胞質(zhì)、胞漿、線粒體外膜等；MF 條目主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、乙酰膽堿受體活性、蛋白激酶結(jié)合等。KEGG通路富集分析結(jié)果見圖10，主要涉及細(xì)胞凋亡、FoxO、TNF、PI3K-AKT、NF-κB等信號通路。

圖9 粉防己堿治療黑色素瘤潛在作用靶點(diǎn)的GO 功能富集分析Figure 9 GO enrichment analysis of potential targets of tetrandrine in the treatment of melanoma

圖10 粉防己堿治療黑色素瘤潛在作用靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析Figure 10 KEGG pathway enrichment analysis of potential targets of tetrandrine in the treatment of melanoma

3.6 分子對接驗(yàn)證選擇“3.5”項(xiàng)下篩選得到的TNF、NFKBIA、RELA、AKT1、CCND1 等核心靶點(diǎn)，分別與粉防己堿進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，結(jié)果見表1。結(jié)合能＜0 表明配體分子均能與受體蛋白自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能絕對值＞5.0 表示結(jié)合活性比較好，結(jié)合能絕對值＞7.0 表示結(jié)合活性較強(qiáng)。結(jié)果表明，粉防己堿與AKT1、TNF、RELA等核心靶點(diǎn)均有較強(qiáng)的結(jié)合活性。結(jié)合PPI 網(wǎng)絡(luò)及KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，調(diào)控AKT/NF-κB 通路可能是粉防己堿抗黑色素瘤的重要作用機(jī)制之一，故通過體外實(shí)驗(yàn)對該結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。

表1 核心靶點(diǎn)與粉防己堿的分子對接結(jié)果Table 1 Molecular docking results of core targets and tetrandrine

3.7 粉防己堿對B16 細(xì)胞AKT/NF-κB/CREB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖11 、圖12 。與對照組比較，粉防己堿1、2、4 μmol·L-1組細(xì)胞的p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-CREB/CREB 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），SC79 組細(xì)胞的p-AKT、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.001）。與SC79組比較，2 μmol·L-1粉防己堿+ SC79組細(xì)胞的p-AKT、p-NF-κB p65、p-CREB 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.001）。

圖11 粉防己堿（Tet）對B16 細(xì)胞AKT/NF-κB/CREB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Figure 11 Effects of tetrandrine on the protein expressions of AKT/NF-κB/CREB pathway in B16 cells（±s，n=3）

圖12 粉防己堿（Tet）+AKT 激動劑（SC79）對B16 細(xì)胞p-AKT、p-NF-κB p65、p-CREB 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Figure 12 Effects of tetrandrine plus AKT agonist（SC79）on the protein expressions of p-AKT，p-NF-κB p65 and p-CREB in B16 cells（±s，n=3）

4 討論

黑色素瘤是一種多發(fā)生于皮膚組織，具有強(qiáng)侵襲性的腫瘤，近年來其發(fā)生率和死亡率不斷升高。天然活性成分因其安全性及生物利用度高的特點(diǎn)，在治療腫瘤方面具有較大潛力。研究[3-9]發(fā)現(xiàn)，粉防己堿能夠抑制乳腺癌、肝癌、鼻咽癌、宮頸癌、腎癌、口腔癌和前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。其通過調(diào)控Caspase、Wnt/β-catenin、PI3K/Akt/mTOR、NF-κB、Hippo/YAP等信號通路[3，10-13]誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、自噬，抑制增殖、遷移和侵襲，逆轉(zhuǎn)多藥物耐藥等發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，粉防己堿抗黑色素瘤轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制尚未見報(bào)道。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮細(xì)胞從上皮狀態(tài)轉(zhuǎn)換為間質(zhì)狀態(tài)的過程，腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT 時(shí)，細(xì)胞從原發(fā)部位脫落并侵入鄰近組織，被認(rèn)為是多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲必不可少的一個(gè)過程[14]。阻斷癌細(xì)胞中的EMT 信號通路已成為一種越來越有前景的抗腫瘤策略。本研究結(jié)果表明，粉防己堿對B16細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力具有顯著抑制作用，并且能夠明顯下調(diào)B16 細(xì)胞間質(zhì)指標(biāo)Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)，上調(diào)上皮指標(biāo)E-cadherin 蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，粉防己堿能夠抑制B16細(xì)胞的EMT過程，降低其遷移和侵襲能力。進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，粉防己堿能夠明顯抑制小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析獲得60 個(gè)粉防己堿抗黑色素瘤的潛在作用靶點(diǎn)。進(jìn)一步通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，AKT1、TNF、CCND1、RELA、CASP9、CHUK、CREBBP 等可能是粉防己堿治療黑色素瘤的核心靶點(diǎn)，其中AKT1為相互作用最強(qiáng)的靶點(diǎn)。KEGG 通路富集分析顯示，潛在作用靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞凋亡、FoxO、TNF、PI3K-Akt、NF-κB 等信號通路。分子對接結(jié)果顯示，粉防己堿與核心靶點(diǎn)均有較好的結(jié)合能力。綜合分析表明，粉防己堿可能通過調(diào)控AKT/NF-κB 通路發(fā)揮抗黑色素瘤作用。有研究[15]表明，PI3K/AKT 信號通路激活可誘導(dǎo)NF-κB 介導(dǎo)的EMT 并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。AKT 信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其活化可調(diào)節(jié)多種生理生化反應(yīng)，如細(xì)胞的生長增殖、凋亡、自噬等[16]。核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的EMT，NF-κB p65 的核轉(zhuǎn)位可誘導(dǎo)多個(gè)參與EMT 的基因轉(zhuǎn)錄[17-18]。cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（Cyclic-AMP response binding protein，CREB）是一種轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子，調(diào)控其下游靶基因介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、DNA 損傷修復(fù)、神經(jīng)元再生等細(xì)胞功能。研究[19-21]表明，其可通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)進(jìn)而影響腫瘤EMT，發(fā)揮抑制黑色素瘤、腎癌、口腔癌等腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)表明，粉防己堿干預(yù)后黑色素瘤細(xì)胞p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-CREB/CREB 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)；回復(fù)實(shí)驗(yàn)使用AKT 激動劑（SC79）能夠上調(diào)黑色素瘤細(xì)胞p-AKT、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)，而粉防己堿可以逆轉(zhuǎn)上述作用。結(jié)果表明，粉防己堿可能通過調(diào)控AKT/NF-κB/CREB 通路逆轉(zhuǎn)EMT 進(jìn)程，從而抑制黑色素瘤的惡性行為。目前的AKT 抑制劑存在嚴(yán)重不良反應(yīng)[22]，而粉防己堿毒性較小，有研究[23]報(bào)道其可減少白血病患者放化療的不良反應(yīng)發(fā)生。粉防己堿可能具備作為AKT 抑制劑或黑色素瘤放化療輔助藥物的潛力，值得深入研究。

綜上所述，粉防己堿可能通過調(diào)控AKT/NF-κB/CREB通路抑制小鼠黑色素瘤的增殖、遷移、侵襲及EMT，進(jìn)而抑制小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移。后續(xù)將需要對粉防己堿抗黑色素瘤作用進(jìn)行更加全面的藥理學(xué)、毒理學(xué)及藥代動力學(xué)方面的研究，以深入探討其作為防治黑色素瘤藥物的潛力。