高雨嫣，盧金福，呂高虹，王恒斌，羅年翠，楊方鈺，許惠琴，喻斌，狄留慶，杜萍（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 21002；2.江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 21002；.雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇蘇州 21009；4.江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 21002；.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京 210029）

急性咽炎是一種主要由病毒、細(xì)菌或其他因素引發(fā)的上呼吸道急性感染性疾病，主要特征為咽部、鼻咽和扁桃體組織發(fā)炎，可出現(xiàn)灼熱、疼痛等癥狀[1]。急性咽炎久治不愈、反復(fù)發(fā)作可轉(zhuǎn)為慢性咽炎。六靈解毒丸由六神丸化裁而來，是部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)收載的中藥成方制劑，具有清熱解毒、消腫止痛等功效，是治療喉痹的常用中藥，對(duì)急性咽炎療效顯著[2-3]。前期研究[4]表明，六靈解毒丸對(duì)15%氨水咽部噴霧誘導(dǎo)的急性咽炎大鼠有較好的治療作用。本研究擬進(jìn)一步通過金黃色葡萄球菌感染致急性咽炎大鼠模型，探討六靈解毒丸對(duì)感染性急性咽炎的治療作用及相關(guān)機(jī)制，以期為其臨床用藥提供更豐富的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量90～100 g，雌雄兼用，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0001。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批文號(hào)：012009026206。

1.2 藥物及試劑六靈解毒丸，蘇州雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：RAO2001；臨用前取六靈解毒丸50 粒（175 mg），研磨成粉末后，用適量生理鹽水溶解并定容至50 mL，搖勻，終濃度為3.5 mg·mL-1；取適量?jī)?chǔ)備液，倍比稀釋成1.75、0.875、0.437 5 mg·mL-1，備用。藍(lán)芩口服液（每瓶10 mL），泰州揚(yáng)子江藥業(yè)有限公司，批號(hào)：19010422。

白細(xì)胞介素1β（IL-1β）抗體（批號(hào)：GR309542-28）、白細(xì)胞介素6（IL-6）抗體（批號(hào)：GR3190303-16）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體（批號(hào)：GR3272631-3），均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：202009）、IL-6 ELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：202009）、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：202009），均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；β-actin 抗體，南京巴傲得（Bioworld）生物科技有限公司，批號(hào)：AA1217J7525ACTB1；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗，美國(guó)Cell Signaling公司，批號(hào)：28；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗，武漢博士德（BOSTER）生物公司，批號(hào)：BST11C18B50；RIPA 裂解液（批號(hào)：20191114）、PMSF（批號(hào)：20190614），北京索萊寶科技有限公司；上樣緩沖液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：082919200302。

1.3 主要儀器Synergy HT 型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司；Mini-PROTEAN3 Cell 凝膠電泳儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；LAS 4000 mini 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)GE 公司；Allegra 64R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；Centrifuge 5702 型常溫離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；TY-80S型脫色搖床，常州國(guó)宇儀器制造有限公司。

1.4 模型復(fù)制、分組及給藥隨機(jī)選取10 只SD 大鼠作為空白組，其余大鼠制備急性咽炎模型[5]：用注射器吸取含菌量為1×109CFU·mL-1的金黃色葡萄球菌溶液0.02 mL，以近似水平方向注入大鼠上頜口頰部分的口腔黏膜處，24 h后重復(fù)感染1次，造模第3天即可形成大鼠急性咽炎模型。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為5 組：模型組、藍(lán)芩口服液組（原液5 mL·kg-1）及六靈解毒丸低、中、高劑量組（4.375、8.750、17.500 mg·kg-1），每組10 只。給藥組大鼠每日灌胃給藥1 次，連續(xù)7 d，模型組及空白組灌胃給予等體積生理鹽水。

1.5 一般情況觀察及咽喉局部炎癥評(píng)分造模及給藥期間每天觀察并記錄大鼠一般情況，包括皮毛、活動(dòng)、飲食、體質(zhì)量、死亡等情況。參照相關(guān)研究[6-7]對(duì)咽喉局部炎癥情況進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：①咽部無異常（-），計(jì)0 分；②咽部略有泛紅（+），計(jì)1分；③咽部有明顯紅腫充血的現(xiàn)象（++），且大鼠時(shí)常抓撓，計(jì)2 分；④咽部有明顯紅腫充血現(xiàn)象（+++），且有潰瘍處，計(jì)3分。

1.6 大鼠咽部組織病理學(xué)觀察末次給藥后處死大鼠，取咽部組織，用4%多聚甲醛溶液固定24 h，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后制備切片（4 μm）；將切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，進(jìn)行常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色；切片經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，中性樹脂封片；于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠咽部組織病理變化，并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分[8]。

1.7 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量末次給藥后，大鼠隔夜禁食12 h，用0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，以3 000×g離心10 min，取上清液。嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書步驟操作，檢測(cè)大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。

1.8 免疫組化法檢測(cè)大鼠咽部組織中IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平取大鼠新鮮咽部組織制備切片，脫蠟后以梯度乙醇水化；組織切片置于檸檬酸（pH=6.0）溶液中進(jìn)行抗原修復(fù)，取出；將切片放入3%過氧化氫溶液，室溫下避光孵育25 min；將切片置于PBS（pH=7.4）中脫色；加BSA 后在室溫下封閉30 min，棄封閉液；加入一抗，4 ℃下孵育過夜；PBS 洗滌，加HRP 標(biāo)記的二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記），室溫下孵育50 min；DAB 顯色、沖洗，經(jīng)復(fù)染、分色、脫水處理后封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照，采用ImageJ 圖像分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以陽(yáng)性染色區(qū)域面積比作為目的蛋白表達(dá)水平。

1.9 Western Blot 法檢測(cè)大鼠咽部組織中IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平取大鼠咽部黏膜下結(jié)締組織適量，剪碎后，加入RIPA裂解液（1% PMSF）；充分勻漿后置于冰上水平震蕩裂解30 min，分裝于EP 管中，以4 ℃、20 000×g離心10 min，取上清；采用BCA 法測(cè)定樣品蛋白含量。加上樣緩沖液制備樣品，上樣量為50 μg；經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜；以5% BSA 封閉2 h 后，加入一抗，4 ℃下孵育過夜；洗膜后，加IL-1β、TNF-α的二抗（HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，1∶5 000）和IL-6的二抗（HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，1∶2 000），室溫下孵育1 h；洗膜后，采用ECL 顯影并掃描；采用ImageJ 圖像軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，對(duì)目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 六靈解毒丸對(duì)急性咽炎大鼠一般體征的影響結(jié)果見表1、表2。造模3 d 后，大鼠出現(xiàn)精神狀態(tài)欠佳、食欲不振、懶動(dòng)等癥狀，且口腔分泌物增多，咽喉部均出現(xiàn)“++”至“+++”的紅腫，表明急性咽炎大鼠模型復(fù)制成功。與空白組比較，模型組大鼠咽喉紅腫程度顯著增加，炎癥評(píng)分顯著升高（P＜0.01），造模后第5～7 天的體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，藍(lán)芩口服液組及六靈解毒丸低、中、高劑量組大鼠的咽喉紅腫程度明顯減輕，炎癥評(píng)分顯著降低（P＜0.01）；造模后第7 天藍(lán)芩口服液組及六靈解毒丸中、高劑量組大鼠的體質(zhì)量顯著增加（P＜0.01）。

表1 六靈解毒丸對(duì)急性咽炎大鼠咽喉炎癥評(píng)分的影響（±s）Table 1 Effect of Liuling Jiedu Pills on laryngopharyngeal inflammation score of acute pharyngitis rats（±s）

表1 六靈解毒丸對(duì)急性咽炎大鼠咽喉炎癥評(píng)分的影響（±s）Table 1 Effect of Liuling Jiedu Pills on laryngopharyngeal inflammation score of acute pharyngitis rats（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

炎癥評(píng)分/分0 2.83±0.28**1.29±0.90##1.12±0.66##0.88±0.66##0.22±0.35##組別空白組模型組藍(lán)芩口服液組六靈解毒丸低劑量組六靈解毒丸中劑量組六靈解毒丸高劑量組劑量/（mg·kg-1）+++++--鼠數(shù)/只10咽喉紅腫程度-10 5 mL·kg-1 4.375 8.750 17.500 6 7 8 8 9 0 2 2 3 7+0 0 2 3 3 2 0 1 2 3 2 0 0 5 1 0 0 0

表2 六靈解毒丸對(duì)急性咽炎大鼠體質(zhì)量的影響（±s）Table 2 Effect of Liuling Jiedu Pills on body mass of acute pharyngitis rats（±s）

表2 六靈解毒丸對(duì)急性咽炎大鼠體質(zhì)量的影響（±s）Table 2 Effect of Liuling Jiedu Pills on body mass of acute pharyngitis rats（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別空白組模型組藍(lán)芩口服液組六靈解毒丸低劑量組六靈解毒丸中劑量組六靈解毒丸高劑量組劑量/（mg·kg-1）造模后體質(zhì)量/g第7天173.56±11.60 138.78±11.85*155.34±7.53##145.22±20.62 154.13±10.20##162.42±13.37##--鼠數(shù)/只10 5 mL·kg-1 4.375 8.750 17.500 6 7 8 8 9造模前體質(zhì)量/g 94.85±3.77 96.23±1.55 92.80±4.14 93.35±2.94 94.11±2.23 94.01±4.49第1天122.96±4.68 125.97±4.20 124.04±4.26 123.14±8.78 120.81±8.07 124.99±8.11第3天133.31±8.48 125.63±9.53 130.74±7.35 127.76±12.44 124.74±8.42 129.18±9.96第5天151.08±10.04 132.02±13.63**141.57±6.03##133.49±13.69 138.78±9.25 142.37±10.71

2.2 六靈解毒丸對(duì)急性咽炎大鼠咽部組織病理變化的影響結(jié)果見圖1。空白組大鼠的咽部組織黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，未見明顯上皮細(xì)胞變性和壞死等。與空白組比較，模型組大鼠咽部組織可見大量正常黏膜纖毛上皮消失，黏膜上皮變薄，局部?jī)H可見一層排列疏松的上皮細(xì)胞（圖1-B，黑色箭頭），固有層可見少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1-B，棕色箭頭），且腺體數(shù)量豐富，多為黏液腺體，病理學(xué)評(píng)分顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，藍(lán)芩口服液組及六靈解毒丸中、高劑量組大鼠的咽部組織黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，變性和壞死的上皮細(xì)胞明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，病理學(xué)評(píng)分明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 六靈解毒丸對(duì)急性咽炎大鼠咽部組織病理變化的影響（HE 染色，×200；±s，n=6～10）Figure 1 Effect of Liuling Jiedu Pills on pharyngeal histopathologic changes of acute pharyngitis rats（HE staining，×200；±s，n=6-10）

2.3 六靈解毒丸對(duì)急性咽炎大鼠血清炎癥因子水平的影響結(jié)果見圖2。與空白組比較，模型組大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著上升（P＜0.01）。與模型組比較，藍(lán)芩口服液組及六靈解毒丸低、中、高劑量組大鼠的血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著下降（P＜0.01）。

圖2 六靈解毒丸對(duì)急性咽炎大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響（±s，n=6～10）Figure 2 Effect of Liuling Jiedu Pills on the level of IL-1β，IL-6 and TNF- α in serum of acute pharyngitis rats（±s，n=6-10）

2.4 六靈解毒丸對(duì)急性咽炎大鼠咽部組織中炎癥因子表達(dá)水平的影響結(jié)果見圖3～圖6。與正常組比較，模型組大鼠咽部組織中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。而與模型組比較，藍(lán)芩口服液組及六靈解毒丸中、高劑量組大鼠咽部組織中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 六靈解毒丸對(duì)急性咽炎大鼠咽部組織中IL-1β 蛋白表達(dá)的影響（免疫組化，×200；±s，n=3）Figure 3 Effect of Liuling Jiedu Pills on the protein expression of IL-1β in throat tissue of acute pharyngitis rats（IHC，×200；±s，n=3）

圖4 六靈解毒丸對(duì)急性咽炎大鼠咽部組織中IL-6 蛋白表達(dá)的影響（免疫組化，×200；±s，n=3）Figure 4 Effect of Liuling Jiedu Pills on the protein expression of IL-6 in throat tissue of acute pharyngitis rats（IHC，×200；±s，n=3）

圖5 六靈解毒丸對(duì)急性咽炎大鼠咽部組織中TNF-α 蛋白表達(dá)的影響（免疫組化，×200；±s，n=3）Figure 5 Effect of Liuling Jiedu Pills on the protein expression of TNF-α in throat tissue of acute pharyngitis rats（IHC，×200；±s，n=3）

圖6 六靈解毒丸對(duì)急性咽炎大鼠咽部組織中IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Figure 6 Effect of Liuling Jiedu Pills on the protein expressions of IL-1β，IL-6 and TNF-α in pharyngeal tissue of acute pharyngitis rats（±s，n=3）

3 討論

人體的咽喉部存在許多條件致病菌，當(dāng)菌群失衡、人體抵抗力下降則容易誘發(fā)感染，形成急性咽炎。除了病毒感染以外，金黃色葡萄球菌感染較為常見，因此本研究采用將金黃色葡萄球菌注入大鼠咽喉的方法模擬復(fù)制臨床急性咽炎動(dòng)物模型。該模型穩(wěn)定、可靠，模型組的病理改變與急性咽炎的臨床特征基本吻合。

急性咽炎屬于中醫(yī)“喉痹”范疇，《素問·陰陽(yáng)別論》中記載：“一陰一陽(yáng)結(jié)，謂之喉痹”，多因風(fēng)、熱、痰、火所致，治宜疏風(fēng)、清熱、祛痰、瀉火。六靈解毒丸由人工牛黃、珍珠、石菖蒲等組成，方中主藥人工牛黃清熱解毒、化痰定驚；珍珠解毒生肌、安神定驚；石菖蒲開竅豁痰、化濕開胃；諸藥合用共奏清熱解毒、消腫止痛、化濕祛痰之功效[9]。本研究結(jié)果顯示，六靈解毒丸可明顯改善金黃色葡萄球菌致急性咽炎大鼠的咽部組織炎癥病理改變，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，保護(hù)黏膜上皮細(xì)胞，能夠顯著降低血清炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，下調(diào)咽部組織中IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)。

炎癥是機(jī)體受到傷害性刺激后形成的一種防御性反應(yīng)如稀釋毒素、修復(fù)組織等，但過于劇烈的炎癥反應(yīng)往往加重機(jī)體的損傷，甚至危及生命，因此炎癥控制是臨床治療的重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞因子是炎癥過程的重要參與者，主要由激活的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，如IL-1β、TNF-α 等[10-12]。IL-1 具有廣泛的生物學(xué)活性，如免疫調(diào)節(jié)、刺激腎上腺皮質(zhì)激素釋放、刺激骨髓釋放中性粒細(xì)胞等。其中IL-1β的促炎活性較強(qiáng)，通過IL-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可誘導(dǎo)多種促炎介質(zhì)如細(xì)胞因子、趨化因子的產(chǎn)生，并最終導(dǎo)致廣泛的炎癥反應(yīng)，如急性期反應(yīng)、發(fā)熱、血管擴(kuò)張、低血壓等全身性反應(yīng)，在局部促進(jìn)黏附分子、趨化因子的合成與分泌，繼而促進(jìn)淋巴細(xì)胞的募集，導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。在此基礎(chǔ)上，免疫細(xì)胞被進(jìn)一步激活而放大炎癥。

核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）是細(xì)胞受到有害刺激后的第一反應(yīng)者，經(jīng)NF-κB抑制蛋白（IκB）絲氨酸磷酸化、泛素化修飾等過程釋放NF-κB 二聚體；NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核與相關(guān)位點(diǎn)的基因結(jié)合，啟動(dòng)IL、TNF等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄進(jìn)程，觸發(fā)NLRP3 炎癥小體的組裝和活化。NLRP3 炎癥小體通過蛋白水解切割促使含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶原1（pro-Caspase-1）變?yōu)橛谢钚缘腃aspase-1，活化的Caspase-1 對(duì)pro-IL-β 剪切，使其成為有活性的IL-1β[13-14]。另一方面，炎癥細(xì)胞因子同時(shí)也具有激活NF-κB 的作用[15]，在炎癥反應(yīng)中構(gòu)成瀑布式的放大效應(yīng)。

在炎癥反應(yīng)中，IL-6 的升高早于其他細(xì)胞因子，也早于C 反應(yīng)蛋白（CRP）和降鈣素原（PTC），而且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，因此可用于急性炎癥的早期輔助診斷。局部激活的IL-1β 可導(dǎo)致繼發(fā)性炎癥介質(zhì)（如IL-6 等）的激活。與IL-1β 類似，TNF-α 是一種多效性促炎因子，在調(diào)節(jié)多種發(fā)育和免疫過程中發(fā)揮著不同的作用，包括炎癥、分化、脂質(zhì)代謝和凋亡，與多種疾病相關(guān)。

綜上所述，六靈解毒丸可顯著改善急性咽炎大鼠的癥狀及咽部組織炎癥病理改變，其機(jī)制可能與下調(diào)IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性因子表達(dá)水平有關(guān)，但是否與單核細(xì)胞分泌、NF-κB 及炎癥小體活化有關(guān)，有待進(jìn)一步深入研究。