鐘艾琪，王奇，莫友勝（.廣州中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新中心，廣東廣州 50405；. 廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)院肝病科，廣東廣州 50006）

藥物性肝損傷（Drug-induced liver injury，DILI）是指由各種藥物引起的肝損傷，嚴重的可導致肝功能衰竭甚至死亡。DILI 發(fā)病機制十分復雜，目前尚未完全闡明，并且缺乏診斷標志物和特異性治療藥物[1]。溶質載體家族7 成員11（SLC7A11）/谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）信號通路是抑制細胞鐵死亡的核心機制[2]。有研究[3]報道，鐵死亡參與了對乙酰氨基酚（APAP）誘導的急性肝損傷進程。葛根素（Puerarin）是中藥葛根中的類黃酮提取物，具有保肝功效，對急性肝損傷有一定治療作用[4-5]。但葛根素是否對APAP 誘導的DILI 有防治作用尚不明確。因此，本研究擬觀察葛根素對APAP 誘導急性肝損傷小鼠的保護作用，并基于SLC7A11/GPX4信號通路探討其改善鐵死亡的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠，7 周齡，體質量（21±2）g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（粵）2018-0001，動物質量合格證號：44005800013127。所有小鼠分籠飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心實驗室，小鼠自由飲食，適應性喂養(yǎng)1 周后開始實驗。本實驗經廣州中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批，倫理批文號：20220516007。

1.2 藥物及試劑葛根素（純度為98%），天津希恩思生化科技有限公司，批號：P92932HIS1；對乙酰氨基酚（APAP），美國MCE 公司，批號：65793；谷丙轉氨酶（ALT）檢測試劑盒（批號：2021610）、谷草轉氨酶（AST）檢測試劑盒（批號：2021609）、乳酸脫氧酶（LDH）檢測試劑盒（批號：20210730）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（批號：20210820），均購自南京建成生物工程研究所；HE 染色試劑盒，北京蘭杰柯科技有限公司，批號：BL700B；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號：20210720；CellROX?Deep Red Reagent，美國賽默飛科技公司，貨號：C10422；免疫染色強力通透液（批號：P0097）、山羊血清（批號：C0265）、抗熒光淬滅封片液（批號：P0131）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：082820201027）、DEPC 水（批號：110420201107），均購自上海碧云天生物技術有限公司；EDTA抗原修復液（批號：BST16A11B23）、DAPI染色液（批號：13F11B77）、Anti-GPX4 抗體（貨號：BM5231）、Anti-SLC7A11 Monoclonal Antibody（貨號：BM5318），均購自武漢博士德生物工程有限公司；4-羥基壬烯醛（4-HNE）抗體，北京博奧森生物技術有限公司，貨號：bs-6313R；RNAiso Plus（貨號：9109）、TB Green 染料法定量試劑盒（批號：AL13568A）、PrimeScriptTM RT Master Mix（批號：AL22271A），均購自北京寶日醫(yī)生物技術有限公司。

1.3 主要儀器5424R型冷凍離心機，德國Eppendorf公司；Multiskan SkyHigh 型全波長酶標儀，美國Thermo Fisher 公司； ASP200S 型組織脫水機、EG1160 型石蠟包埋機、RM2135 型病理切片機、CM3050 型冰凍切片機、DMi8 型倒置顯微鏡，均購自德國Leica 公司；KZ-III-F 型高速低溫組織研磨儀，武漢賽維爾生物科技有限公司；T100 型PCR儀，美國BIO-RAD公司；Applied Biosystems 7500型定量PCR 儀，美國應用生物系統(tǒng)公司；NP80 型多功能紫外-可見分光光度計，德國IMPLEN GMBH公司。

1.4 分組、給藥、模型復制及樣本采集將24 只小鼠適應性喂養(yǎng)1周，稱體質量后按隨機數(shù)字表法分為4 組：正常組、模型組及葛根素低、高劑量組（50、200 mg·kg-1），每組6 只。采用預給藥方式，葛根素低、高劑量組每天灌胃給藥1 次，連續(xù)3 d；正常組、模型組給予等容積的0.5% CMC-Na 溶劑。末次給藥1 h后，模型組及葛根素低、高劑量組腹腔注射APAP（300 mg·kg-1）[6]復制DILI 小鼠模型，正常組腹腔注射等容積的無菌生理鹽水。各組小鼠禁食24 h后，稱體質量；采集血液，以4 ℃、3 000 r·min-1（離心半徑=10 cm）離心10 min，取上清液，保存于-80 ℃冰箱；行頸椎脫臼法處死小鼠，摘取肝臟，用生理鹽水洗滌；濾紙吸盡臟器表面液體后，稱定質量；將肝組織分為2份，1份用4%多聚甲醛溶液固定后用于組織病理學分析，另1 份用液氮速凍后，-80 ℃保存。

1.5 微板法檢測血清ALT、AST、LDH 含量取“1.4”項下制備的血清，室溫下解凍后，嚴格按照檢測試劑盒說明書步驟操作，采用微板法測定血清ALT、AST、LDH水平。

1.6 肝臟組織HE、TUNEL 染色取“1.4”項下固定后的肝組織，經脫水、透明、包埋后切片（4 μm），切片經二甲苯脫蠟、蘇木素-伊紅（HE）染色，乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后，在光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理變化并采集圖像。另外，小鼠肝臟組織切片采用TUNEL DAB 染色后，在光學顯微鏡下觀察肝細胞凋亡情況并采集圖像，呈現(xiàn)棕褐色的為陽性細胞即凋亡細胞。

1.7 TBA 法檢測肝臟組織MDA 含量取“1.4”項下液氮速凍的肝組織適量，加入9 倍量0.9%生理鹽水，充分進行組織勻漿；以4 ℃、2 500 r·min-1（離心半徑=10 cm）離心10 min，取上清；使用BCA蛋白定量試劑盒檢測樣品的蛋白濃度；嚴格按照試劑盒說明書步驟操作，采用TBA法檢測肝組織MDA含量。

1.8 免疫熒光法檢測肝組織中活性氧（ROS）、4-HNE、GPX4 及SLC7A11 的表達水平取“1.4”項下固定后的肝組織，修剪為0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm 的組織塊；PBS 清洗3 次后，4 ℃下經30%蔗糖浸泡過夜脫水；O.C.T.包埋后制備冰凍切片（25 μm）。將各組小鼠肝組織冰凍切片放入裝有PBS 的48 孔板中；吸去PBS，滴加通透劑，室溫下通透20 min；吸去通透液，用PBS 洗滌3 次，每次5 min。①檢測ROS表達水平：加入CellROX?Deep Red Reagent 熒光探針工作液（5 μmol·L-1），37 ℃下避光放置30 min。②檢測4-HNE、GPX4 及SLC7A11 表達水平：使用封閉液在室溫下封閉30 min；加入稀釋后的一抗，4 ℃下孵育48 h，PBS 洗滌3 次，每次5 min；滴加熒光標記二抗，室溫下避光孵育2 h。以下步驟①②相同：用PBS 洗滌3 次，每次5 min；將切片轉移至載玻片上，稍晾干，滴加DAPI 染色液，室溫下避光染色10 min；吸去DAPI后稍晾干，滴加封片劑封片，在熒光顯微鏡下（激發(fā)波長：640 nm；吸收波長：665 nm）觀察拍照，并對結果進行半定量分析。

1.9 qRT-PCR 法檢測肝臟組織鐵死亡相關基因GPX4、TFRC、SLC11A2 mRNA 表達水平稱取“1.4”項下液氮速凍的肝組織50 mg，應用RNA 提取裂解液提取總RNA，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作。使用多功能紫外-可見分光光度計測定RNA 純度及濃度。進行mRNA 逆轉錄酶聚合酶鏈反應，反應體系：4 μL 5× RT Master Mix、2 μL RNA、14 μL去離子水；反應條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃∞。以cDNA 為模板，進行實時熒光定量PCR 擴增反應，反應體系：12.5 μL TB Green、8.5 μL 去離子水、1 μL 上游引物、1 μL 下游引物、2 μL 模板cDNA；擴增程序：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，循環(huán)40 次；95 ℃、10 s；65 ℃、5 s；95 ℃、15 s。進行熔解曲線分析，根據(jù)擴增曲線讀取Ct 值，以β-actin 為內參，采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達水平。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.10 統(tǒng)計學處理方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 葛根素對APAP 致DILI 小鼠血清ALT、AST水平的影響結果見表2。與正常組比較，模型組小鼠的血清ALT、AST水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，葛根素低、高劑量組小鼠的血清AST 水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），血清ALT水平有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果表明，葛根素對APAP致DILI小鼠的肝功能具有保護作用。

表2 各組小鼠血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）水平的變化（±s，n=6）Table 2 Changes of ALT and AST levels in serum of mice in each group（±s，n=6）

表2 各組小鼠血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）水平的變化（±s，n=6）Table 2 Changes of ALT and AST levels in serum of mice in each group（±s，n=6）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

AST/（U·L-1）42.5±16.7**307.6±29.5 108.6±106.8*107.5±91.7**組別正常組模型組葛根素低劑量組葛根素高劑量組劑量/（mg·kg-1）--5 0 200 ALT/（U·L-1）116.0±38.3**796.1±106.1 495.0±415.8 448.7±386.6

2.2 葛根素對APAP 致DILI 小鼠血清LDH 水平的影響結果見表3。與正常組比較，模型組小鼠的血清LDH 水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，葛根素低、高劑量組小鼠的血清LDH 水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結果表明，葛根素能抑制APAP 致DILI 小鼠的肝細胞損傷。

表3 各組小鼠血清中乳酸脫氫酶（LDH）水平的變化（±s，n=6）Table 2 Changes of LDH level in serum of mice in each group（±s，n=6）

表3 各組小鼠血清中乳酸脫氫酶（LDH）水平的變化（±s，n=6）Table 2 Changes of LDH level in serum of mice in each group（±s，n=6）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

LDH/（U·L-1）103.9±22.1**480.6±45.7 198.8±93.6**216.9±147.9**組別正常組模型組葛根素低劑量組葛根素高劑量組劑量/（mg·kg-1）--5 0 200

2.3 葛根素對APAP 致DILI 小鼠肝組織病理變化的影響結果見圖1。HE 染色顯示，正常組小鼠的肝小葉呈多面棱柱狀，中央細胞核呈圓形泡狀，肝細胞呈多角形并有序排列在中央靜脈周圍的肝板中。與正常組比較，模型組小鼠的肝小葉出現(xiàn)明顯損傷，表現(xiàn)為肝細胞腫脹破裂，胞質空泡化，細胞核碎裂，肝血竇充血及炎性細胞浸潤。與模型組比較，葛根素低、高劑量組小鼠的肝小葉結構較清晰，肝索呈放射狀排列，肝組織壞死面積明顯減少。結果表明，葛根素能改善APAP致DILI小鼠的肝組織病理損傷。

圖1 各組小鼠的肝組織病理形態(tài)學變化及肝細胞凋亡情況（HE、TUNEL 染色，×400）Figure 1 The histopathologic changes and hepatocyte apoptosis of liver tissue in each group of mice（HE and TUNEL staining，×400）

2.4 葛根素對APAP 致DILI 小鼠肝細胞凋亡情況的影響結果見圖1。TUNEL 染色顯示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織切片DAB 染色的深棕色面積明顯增加，表明凋亡細胞增多。與模型組比較，葛根素低、高劑量組小鼠肝組織切片DAB 染色的深棕色面積（凋亡細胞）明顯減少。結果表明，葛根素能減少APAP致DILI小鼠的肝細胞凋亡。

2.5 葛根素對APAP 致DILI 小鼠肝組織中MDA含量的影響結果見表4。與正常組比較，模型組小鼠肝組織中MDA 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，葛根素高劑量組小鼠肝組織中MDA 水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果表明，葛根素能改善APAP 致DILI 小鼠肝組織的氧化損傷。

表4 各組小鼠肝組織中丙二醛（MDA）水平的變化（±s，n=6）Table 4 Changes of MDA level in liver tissue of mice in each group（±s，n=6）

表4 各組小鼠肝組織中丙二醛（MDA）水平的變化（±s，n=6）Table 4 Changes of MDA level in liver tissue of mice in each group（±s，n=6）

注：與模型組比較，*P＜0.05

MDA/（nmol·mg-1）2.3±1.1*4.8±2.1 3.4±1.2 2.1±1.0*組別正常組模型組葛根素低劑量組葛根素高劑量組劑量/（mg·kg-1）--5 0 200

2.6 葛根素對APAP 致DILI 小鼠肝組織中ROS、4-HNE 表達水平的影響結果見圖2、表5。與正常組比較，模型組小鼠肝組織中的ROS、4-HNE 紅色熒光（陽性表達）顯著增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，葛根素低、高劑量組小鼠肝組織中的ROS、4-HNE 紅色熒光（陽性表達）顯著減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。結果表明，葛根素能降低APAP 致DILI 小鼠肝組織的脂質過氧化水平。

表5 各組小鼠肝組織中ROS 含量及4-HNE 的表達情況（±s，n=6）Table 5 Expressions of ROS and 4-HNE in liver tissue of mice in each group（±s，n=6）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

4-HNE相對熒光強度12.9±1.4*22.0±1.7 15.5±1.2*15.4±0.9*組別正常組模型組葛根素低劑量組葛根素高劑量組劑量/（mg·kg-1）--5 0 200 ROS相對熒光強度16.3±0.9**34.6±2.2 21.9±4.3**15.2±1.7**

2.7 葛根素對APAP 致DILI 小鼠肝組織GPX4、SLC7A11 表達水平的影響結果見圖3、表6。與正常組比較，模型組小鼠肝組織中的GPX4、SLC7A11紅色熒光（陽性表達）顯著減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，葛根素低劑量組小鼠肝組織中的GPX4、SLC7A11 紅色熒光（陽性表達）明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），葛根素高劑量組小鼠肝組織中的GPX4、SLC7A11 紅色熒光（陽性表達）有增強趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果表明，葛根素能夠上調APAP 致DILI小鼠肝組織SLC7A11、GPX4表達水平。

表6 各組小鼠肝組織中GPX4、SLC7A11 的表達情況（±s，n=6）Table 6 Expressions of GPX4 and SLC7A11 in liver tissue of mice in each group（±s，n=6）

表6 各組小鼠肝組織中GPX4、SLC7A11 的表達情況（±s，n=6）Table 6 Expressions of GPX4 and SLC7A11 in liver tissue of mice in each group（±s，n=6）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

SLC7A11相對熒光強度3 750.2±1 114.5**134.6±65.4 1 346.7±452.6*809.7±311.1組別正常組模型組葛根素低劑量組葛根素高劑量組劑量/（mg·kg-1）--5 0 200 GPX4相對熒光強度4 309.5±967.1**1 165.9±347.9 3 922.7±764.2**2 461.8±850.8

2.8 葛根素對APAP 致DILI 小鼠肝組織鐵死亡相關基因表達的影響結果見表7。與正常組比較，模型組小鼠肝組織中的GPX4、SLC11A2 mRNA 表達均明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），TFRC表達有下調趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，葛根素低劑量組小鼠肝組織中的GPX4、TFRC mRNA 表達明顯上調，葛根素高劑量組小鼠肝組織中的GPX4、SLC11A2 mRNA 表達明顯上調，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果表明，葛根素能夠上調APAP 致DILI 小鼠肝組織鐵死亡相關基因GPX4、TFRC、SLC11A2的表達。

表7 各組小鼠肝組織中GPX4、TFRC、SLC11A2 mRNA表達情況（±s，n=4）Table 7 mRNA expressions of GPX4，TFRC and SLC11A2 in liver tissue of mice in each group（±s，n=4）

表7 各組小鼠肝組織中GPX4、TFRC、SLC11A2 mRNA表達情況（±s，n=4）Table 7 mRNA expressions of GPX4，TFRC and SLC11A2 in liver tissue of mice in each group（±s，n=4）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

SLC11A2 mRNA相對表達量1.06±0.23*0.47±0.19 0.87±0.30 1.10±0.11*組別正常組模型組葛根素低劑量組葛根素高劑量組劑量/（mg·kg-1）--5 0 200 GPX4 mRNA相對表達量1.02±0.20*0.30±0.19 0.76±0.15*0.99±0.27*TFRC mRNA相對表達量0.57±0.30 0.25±0.14 1.01±0.53*0.77±0.29

3 討論

藥物性肝損傷（DILI）是由各種藥物引起的急慢性肝損傷，對乙酰氨基酚（APAP）是常見的解熱鎮(zhèn)痛藥，過量或長期使用會導致嚴重的肝損傷[7]。本研究結果顯示，經APAP 誘導后，模型組小鼠的血清ALT、AST、LDH 水平均顯著升高，HE 染色顯示肝組織壞死面積增加，TUNEL 染色顯示肝細胞凋亡增加，表明APAP誘導DILI小鼠模型復制成功。而與模型組比較，葛根素給藥組小鼠的血清ALT、AST、LDH 水平降低，肝組織病理損傷明顯改善，肝細胞凋亡明顯減少，表明葛根素對APAP誘導的DILI有明顯的保護作用。

鐵死亡是一種鐵依賴的脂質過氧化的新型細胞死亡方式，在APAP 誘導DILI 發(fā)生發(fā)展中有重要作用，其中活性氧（ROS）介導的脂質過氧化是鐵死亡發(fā)生的關鍵步驟[8]。脂質過氧化的起始階段主要由細胞中的鐵參與自由基化合物生成，其中丙二醛（MDA）和4-羥基壬烯醛（4-HNE）是脂質過氧化的主要產物，能反映組織脂質過氧化的程度。轉鐵蛋白受體（TFRC）和溶質載體家族11 成員2（SLC11A2）是參與鐵輸送的重要基因[9]。細胞鐵死亡的發(fā)生分為外源性和內源性細胞通路，內源性途徑可以通過下調細胞內抗氧化酶［如谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）］的表達或活性來進一步激活鐵死亡[10]；外源性途徑可通過抑制由溶質載體家族7成員11（SLC7A11）和溶質載體家族3 成員2（SLC3A2）組成的胱氨酸/谷氨酸反向轉運體（System Xc-）[11]，或通過誘導掌管細胞內外鐵運輸?shù)霓D鐵蛋白及膜鐵轉運蛋白來啟動鐵死亡。

有研究[12]證實，葛根素能夠調節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)，抑制鐵過載，從而抑制細胞鐵死亡，但其對APAP誘導DILI的治療作用及鐵死亡機制尚未闡明。本研究結果顯示，葛根素能明顯降低APAP致DILI小鼠肝組織中的MDA含量，下調ROS水平和4-HNE蛋白表達，上調SLC7A11、GPX4蛋白表達及GPX4、TFRC、SLC11A2基因表達，從而發(fā)揮對肝細胞鐵死亡的保護作用。

綜上所述，葛根素對APAP誘導的DILI小鼠有明顯的保護作用，可能與其通過SLC7A11/GPX4通路抑制細胞鐵死亡有關。本研究結果可為DILI 的臨床防治及葛根素的藥理作用研究提供新的思路。但本研究也存在一定局限性，由于葛根素水溶性差，生物利用度低，本研究中葛根素給藥沿用了輔助混懸劑0.5% CMC-Na，后續(xù)將加入新型載藥系統(tǒng)研究，以提高葛根素的生物利用度。