葉雪珂，單國(guó)順，付郁，史輯，余意，梁明，姚娓［1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧大連 116023；2.大連醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院/研究院，遼寧大連 116044；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600；4.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制工藝原理重點(diǎn)研究室，遼寧大連 116600；.無限極（中國(guó)）有限公司，廣東廣州 10663］

地黃為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品[1-2]。作為“生熟異用”的典型代表，生地黃炮制成熟地黃后，其性味由甘、寒轉(zhuǎn)為甘、微溫，功效由清熱涼血、養(yǎng)陰生津轉(zhuǎn)為補(bǔ)血滋陰、益精填髓，被廣泛應(yīng)用于血虛諸證以及肝腎陰虛的諸多癥候[3-4]。其中，腎陰虛證是一種由神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)引起的代謝性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要是下丘腦-垂體-靶腺軸（腎上腺、甲狀腺、性腺）的多層次功能障礙[5]。研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，腎陰虛證與腸道菌群代謝紊亂密切相關(guān)。地黃中富含環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類、黃酮類及糖類等化學(xué)成分[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，地黃在炮制過程中環(huán)烯醚萜苷及苯乙醇苷類成分的含量會(huì)逐漸降低，多糖和低聚糖還會(huì)不同程度水解成還原性寡糖。而植物寡糖可以通過促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌增殖以及短鏈脂肪酸釋放，從而調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，從而緩解腎陰虛癥狀[10-12]。故推測(cè)地黃炮制前后對(duì)腎陰虛證的治療作用可能與其對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。因此，本研究擬從腸道菌群角度出發(fā)，結(jié)合靶向代謝組學(xué)和16SrRNA 基因測(cè)序技術(shù)，探討生、熟地黃對(duì)腎陰虛證大鼠的治療機(jī)制，并對(duì)地黃“生熟異用”的炮制機(jī)理進(jìn)行闡釋。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SD 雄性大鼠，SPF 級(jí)，體質(zhì)量（180±20）g，購自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：210726211101236656。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批文號(hào)：2022YS（DW）-041-03。

1.2 藥物及試劑生地黃（產(chǎn)地：河南，批號(hào)：D2009038）、熟地黃（產(chǎn)地：河南，批號(hào)：2009037），均購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司。益生菌干粉制劑，南京同仁堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：G30130221；地塞米松磷酸鈉注射液，山西石藥銀湖制藥有限公司，批號(hào)：H14022567；環(huán)磷酸腺苷（cAMP）試劑盒、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）試劑盒、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）試劑盒、促腎上腺激素釋放激素（ACTH）試劑盒、皮質(zhì)酮（CORT）試劑盒，均購自上?？婆d生物科技有限公司，批號(hào)分別為：21121342N、21121345N、21121343N、21121336N、21121344N；糞便DNA抽提試劑盒，美國(guó)QIAGEN公司，貨號(hào)：47014；乙酸（Acetic acid，CAS：64-19-7）、丙酸（Propionic acid，CAS：79-09-4）、丁酸（Butyric acid，CAS：107-92-6）、異丁酸（Isobutyric acid，CAS：79-31-2）、戊酸（Valeric acid，CAS：109-52-4）、異戊酸（Isovaleric acid，CAS：503-74-2）、己酸（Caproic acid，CAS：142-62-1）、4-甲基戊酸（4-Methylvaleric acid，CAS：646-07-1），均購自上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)分別為：A21D11L136236、 YY2008052、 M30D11K136125、M30D11K136123、M30D11K136122、M29D11K136116、M30D11K136124、Y11M8C35742；磷酸（色譜純），天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20190212。

1.3 主要儀器7890B-5977B 型氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有7697A 型頂空進(jìn)樣器、MassHunter Workstation B.07.00 型工作站），美國(guó)Agilent 公司；ELx800 型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek 公司；Gene Amp?9700型PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems 公司；Miseq高通量二代測(cè)序儀，美國(guó)Illumina 公司；DYY-6C 型電泳儀，北京六一儀器廠；QuantiFluor-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)，美國(guó)Promega 公司；BX53 型生物顯微鏡，日本Olympus公司。

1.4 模型復(fù)制、分組及給藥SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組、模型組、益生菌組、熟地黃高/中/低劑量組、生地黃高/中/低劑量組，每組9 只。參考相關(guān)研究[13-14]進(jìn)行腎陰虛證動(dòng)物模型復(fù)制，除空白組外，其余各組大鼠均肌肉注射地塞米松磷酸鈉注射液（0.35 mg·kg-1），每日1次，持續(xù)21 d，每日測(cè)量大鼠體質(zhì)量。

于造模第7 天開始灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)給藥14 d。依據(jù)臨床生、熟地黃常用劑量30 g 為高劑量、15 g 為中劑量、7.5 g 為低劑量，以體表面積折算大鼠給藥劑量，生、熟地黃高/中/低劑量組分別給予生、熟地黃水煎液3.5、1.75、0.875 g·kg-1灌胃；按照臨床每日3 g給藥劑量折算益生菌組給予益生菌溶液0.35 g·kg-1灌胃；空白組及模型組大鼠給予相同體積生理鹽水灌胃。

1.5 取材末次給藥后，抓取各組大鼠懸空后仰，保持頭高位，按壓腹部促進(jìn)排便，直接用2 mL 消毒離心管接取糞便1～2 粒，-80 ℃下保存。留便后大鼠采用20%烏拉坦麻醉，腹主動(dòng)脈取血5 mL，4 ℃下放置30 min 后，低溫條件下以3 000 r·min-1（離心半徑=13.5 cm）離心15 min，分離血清，-80 ℃下保存，備用。同時(shí)摘取各組大鼠腎上腺組織，以10%福爾馬林溶液固定。

1.6 腎上腺組織病理學(xué)觀察取各組固定后的大鼠腎上腺組織，經(jīng)脫水、透明、包埋后制備切片（4 μm）；切片經(jīng)二甲苯脫蠟、蘇木素-伊紅（HE）染色、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察腎上腺組織病理變化。

1.7 大鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)取“1.5”項(xiàng)下大鼠血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書步驟操作，檢測(cè)各組大鼠血清中的cAMP、cGMP、CRH、ACTH、CORT水平。

1.8 腸道微生物群的組成分析將大鼠糞便在液氮中研碎，以總DNA 快速提取試劑盒提取腸內(nèi)容物中的腸道菌群總DNA，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提基因組DNA 的純度及濃度。選取細(xì)菌16SrRNA 基因的高度可變的V4 區(qū)（長(zhǎng)度約280 bp）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每個(gè)樣本重復(fù)3 次；將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（美國(guó)AXYGEN 公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)純度。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR 產(chǎn)物通過QuantiFluorTM-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)定量，然后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合，構(gòu)建Miseq 文庫并進(jìn)行測(cè)序。Miseq 測(cè)序得到PE reads，首先根據(jù)overlap 關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行操作單元分類（OUT）聚類分析和物種分類學(xué)分析。基于OTU 分析結(jié)果，對(duì)各個(gè)樣本進(jìn)行多種α 多樣性指數(shù)分析，以及對(duì)測(cè)序深度進(jìn)行檢測(cè)；基于分類學(xué)信息，在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析及16S 基因功能預(yù)測(cè)。然后進(jìn)行一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及可視化分析，并根據(jù)分析結(jié)果探討不同干預(yù)對(duì)模型動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)及功能的影響。

1.9 糞便中短鏈脂肪酸含量測(cè)定精密稱取各組大鼠糞便100 mg 于20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，加入50 μL 0.2% H3PO4溶液，內(nèi)含4-甲基戊酸內(nèi)標(biāo)溶液（0.668 mg·mL-1），迅速密封，供上機(jī)測(cè)試。進(jìn)樣條件：頂空進(jìn)樣器樣品瓶加熱溫度：80 ℃；定量環(huán)加熱溫度：140 ℃；傳輸線加熱溫度：160 ℃；GC 循環(huán)時(shí)間：45 min；加熱時(shí)間：20 min；平衡時(shí)間：10 min；加壓時(shí)間：0.15 min；進(jìn)樣時(shí)間：0.5 min。

色譜條件：色譜柱為Agilent DB-WAX（DB-1MS）毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣方式：不分流；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；四極桿溫度：150 ℃。程序升溫：起始溫度60 ℃；然后以30 ℃·min-1升溫至120 ℃；以5 ℃·min-1升溫至140 ℃，維持1 min；然后以10 ℃·min-1升溫至150 ℃，維持1 min；再以5 ℃·min-1升溫至160 ℃，維持1 min；最后以35 ℃·min-1升溫至230 ℃；然后運(yùn)行溫度230 ℃，維持5 min。載氣為氦氣，載氣流速：1.0 mL·min-1。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI）；電子能量70 eV；溶劑延時(shí)4.5 min；掃描方式為全掃描（SCAN）和選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式；掃描范圍：30～200m/z。7種短鏈脂肪酸及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 7 種短鏈脂肪酸及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of 7 short chain fatty acids and internal standards

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生、熟地黃對(duì)腎陰虛大鼠一般狀態(tài)及體質(zhì)量的影響結(jié)果見表2。與空白組比較，模型組大鼠形體消瘦、大便干結(jié)、小便發(fā)黃、自主活動(dòng)增加、飲食減少、易被激惹、反應(yīng)活躍，第7、14、21天體質(zhì)量明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，熟地黃給藥組大鼠第21 天的體質(zhì)量均明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），而生地黃給藥組大鼠體質(zhì)量變化不明顯（P＞0.05）。

表2 生、熟地黃對(duì)腎陰虛大鼠體質(zhì)量的影響（±s，n=9）Table 2 Effect of Rehmanniae Radix and Rehmanniae Radix Praeparata on body mass of rats with kidney yin deficiency syndrome（±s，n=9）

表2 生、熟地黃對(duì)腎陰虛大鼠體質(zhì)量的影響（±s，n=9）Table 2 Effect of Rehmanniae Radix and Rehmanniae Radix Praeparata on body mass of rats with kidney yin deficiency syndrome（±s，n=9）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

第21天體質(zhì)量/g 300.10±12.51 204.57±15.73##225.83±14.17**228.22±13.72**227.80±10.37**221.23±14.11*216.21±14.32 217.51±11.57 214.72±8.21組別空白組模型組益生菌組熟地黃高劑量組熟地黃中劑量組熟地黃低劑量組生地黃高劑量組生地黃中劑量組生地黃低劑量組第1天體質(zhì)量/g 220.5±15.25 224.5±15.29 221.67±11.31 223.67±11.36 217.58±14.80 226.45±15.32 226.98±15.38 225.67±13.61 224.56±10.12第7天體質(zhì)量/g 256.33±10.70 231.57±14.11#232.91±14.68 233.39±10.96 236.89±8.99 236.22±14.48 234.21±14.37 235.20±14.63 231.60±9.78第14天體質(zhì)量/g 285.60±11.37 207.97±11.27##211.87±9.65 216.80±12.59 216.90±10.96 212.62±11.39 209.06±13.79 208.92±11.56 207.77±10.81

2.2 生、熟地黃對(duì)腎陰虛大鼠血清中相關(guān)生化指標(biāo)的影響結(jié)果見表3。與空白組比較，模型組大鼠血清中cAMP、CRH、ACTH、CORT 含量及cAMP/cGMP比值均顯著升高（P＜0.01），cGMP 含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，熟地黃給藥組大鼠血清中cAMP、CRH、ACTH、CORT 含量及cAMP/cGMP比值均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），cGMP 含量明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；生地黃高劑量組大鼠血清中CRH、CORT 含量明顯降低（P＜0.01），生地黃中劑量組大鼠血清中ACTH含量明顯降低（P＜0.05）。

表3 生、熟地黃對(duì)腎陰虛大鼠血清中cAMP、cGMP、CRH、ACTH、CORT 含量的影響（±s，n=6）Table 3 Effects of Rehmanniae Radix and Rehmanniae Radix Praeparata on the contents of cAMP，cGMP，CRH，ACTH and CORT in serum of rats with kidney yin deficiency syndrome（±s，n=6）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

CORT/（ng·mL-1）7.58±0.49**12.11±1.07##7.85±0.91**8.04±0.81**9.25±1.16**10.35±0.61*9.55±0.81**11.73±0.83 12.06±0.52組別空白組模型組益生菌組熟地黃高劑量組熟地黃中劑量組熟地黃低劑量組生地黃高劑量組生地黃中劑量組生地黃低劑量組cAMP/（nmol·L-1）3.13±1.59**6.41±0.16##4.36±1.39*4.87±0.84*4.36±1.02*5.41±0.93 5.96±0.76 7.48±0.45 6.56±1.17 cGMP/（nmol·L-1）12.52±1.66**7.69±0.82##10.91±1.14*11.31±1.71**11.10±1.74**10.50±0.78*10.28±0.87 10.50±2.40 7.95±1.87 cAMP/cGMP 0.25±0.12**0.81±0.06##0.41±0.16**0.43±0.13**0.39±0.07**0.51±0.07*0.59±0.12 0.75±0.22 0.85±0.17 CRH/（pg·mL-1）26.70±3.84**66.67±7.29##35.30±4.11**39.48±6.36**43.40±6.61**53.84±6.38**51.86±6.08**60.42±1.91 68.93±2.18 ACTH/（pg·mL-1）44.82±5.79**74.59±2.35##45.64±2.67**45.85±5.75**55.87±7.37**59.15±8.85**65.51±3.68 64.43±3.80*69.58±6.43

2.3 生、熟地黃對(duì)腎陰虛大鼠腎上腺組織病理變化的影響結(jié)果見圖1?？瞻捉M大鼠腎上腺皮質(zhì)球狀帶、束狀帶、網(wǎng)狀帶結(jié)構(gòu)清晰；模型組大鼠腎上腺皮質(zhì)變薄，皮質(zhì)各層邊界不清；各給藥組大鼠腎上腺皮質(zhì)結(jié)構(gòu)均有所改善，尤其熟地黃給藥組大鼠腎上腺皮質(zhì)各層增厚明顯，改善作用優(yōu)于生地黃組。

2.4 生、熟地黃對(duì)腎陰虛大鼠腸道菌群的影響

2.4.1物種注釋及評(píng)估 各組樣本通過測(cè)序并經(jīng)質(zhì)控過濾后共獲得1 163 792 條有效序列，平均單個(gè)樣本產(chǎn)生32 328 條有效序列，在97%相似度水平下對(duì)序列進(jìn)行聚類，共發(fā)現(xiàn)1 141 種OTUs。在一定范圍內(nèi)，稀疏曲線隨著序列采樣數(shù)量的增加而趨于平坦（見圖2-A），說明本研究中每個(gè)樣本的測(cè)序量充分。同時(shí)，物種累計(jì)曲線結(jié)果顯示其趨于平緩，此時(shí)群落中的OTU 總數(shù)將不再隨著新樣本的加入而顯著增加（見圖2-B）。結(jié)果表明，當(dāng)前測(cè)序深度已接近飽和，所獲得數(shù)據(jù)可以用于分析。

圖2 各組樣本的稀疏曲線圖（A）與物種累計(jì)曲線圖（B）Figure 2 Sparse curve（A）and species accumulation curve（B）of each group of samples

2.4.2α 及β 多樣性分析 通過對(duì)腸道菌群α 多樣性分析后，可得到豐度指數(shù)（Sobs、Ace、Chao）、多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson）及覆蓋度指數(shù)（Coverage），結(jié)果見表4。與空白組比較，各組間Coverage 指數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），各組覆蓋度良好；模型組豐度指數(shù)（Sobs、Ace、Chao）、多樣性指數(shù)（Shannon）顯著升高（P＜0.01），Simpson 指數(shù)顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，熟地黃中、高劑量組的Sobs 指數(shù)明顯降低（P＜0.05），熟地黃給藥組及生地黃高劑量組的Chao 指數(shù)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），熟地黃高劑量組的Simpson指數(shù)明顯升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，模型組大鼠腸道微生物群落豐富度明顯增高，微生物群落多樣性的變化趨勢(shì)與豐富度變化大致相同；各給藥組的腸道微生物群落豐富度均有不同程度的降低，其中熟地黃中、高劑量組下降趨勢(shì)最為明顯，作用優(yōu)于生地黃組。

表4 生、熟地黃對(duì)腎陰虛大鼠腸道菌群α 多樣性的影響（±s，n=4）Table 4 Effect of Rehmanniae Radix and Rehmanniae Radix Praeparata on α diversity of gut microbiota in rats with kidney yin deficiency syndrome（±s，n=4）

表4 生、熟地黃對(duì)腎陰虛大鼠腸道菌群α 多樣性的影響（±s，n=4）Table 4 Effect of Rehmanniae Radix and Rehmanniae Radix Praeparata on α diversity of gut microbiota in rats with kidney yin deficiency syndrome（±s，n=4）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

Coverage指數(shù)0.995 67 0.995 96 0.996 34 0.996 24 0.996 07 0.996 11 0.996 16 0.996 31 0.996 04組別空白組模型組益生菌組熟地黃高劑量組熟地黃中劑量組熟地黃低劑量組生地黃高劑量組生地黃中劑量組生地黃低劑量組Sobs指數(shù)413.50±17.68 578.00±8.49##453.50±14.85**511.50±4.95*517.00±10.61*559.67±30.35 596.00±8.48 577.00±24.02 571.00±10.44 Ace指數(shù)525.50±28.47 694.15±11.01##519.91±21.72**616.31±0.38 615.52±1.71 648.31±13.15 702.51±11.97 712.46±15.46 683.18±19.35 Chao指數(shù)524.63±20.46 708.02±24.01##527.06±6.05**614.65±0.38**618.17±1.32**654.55±12.07*620.32±6.50**685.70±18.47 683.01±19.81 Shannon指數(shù)2.82±0.25 4.12±0.12##3.13±0.25**3.75±0.21 3.85±0.24 4.19±0.10 4.01±0.05 4.01±0.08 4.04±0.13 Simpson指數(shù)0.127±0.021 0.043±0.006##0.121±0.011**0.078±0.020*0.063±0.008 0.063±0.003 0.067±0.011 0.047±0.005 0.047±0.001

β 多樣性分析的重點(diǎn)是比較不同樣品（空白組、模型組、熟地黃高劑量組、生地黃高劑量組）間腸道微生物群的多樣性。通過主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示，空白組和模型組的腸道微生物組成分布明顯分開，模型組與生地黃高劑量組關(guān)系密切，見圖3-A。同時(shí)，采用UPGMA 聚類分析方法判斷樣品間物種組成的相似性，樣本距離越近、分支越短說明2 個(gè)樣本的物種組成越相似。結(jié)果顯示，空白組和模型組的物種差異顯著，而生地黃高劑量組與模型組更為相似（見圖3-B）。

圖3 各組樣本的PCoA 分析圖（A）與樣本層級(jí)聚類分析圖（B）Figure 3 PCoA analysis chart（A）and sample hierarchy cluster analysis chart（B）of each group of samples

綜合分析，生地黃對(duì)腎陰虛大鼠腸道微生物群落豐富度和多樣性的改變較小，而熟地黃作用相對(duì)更加明顯，說明熟地黃可以更好地維持腎陰虛大鼠腸道微生物群落豐富度和多樣性的穩(wěn)定。

2.4.3群落組成分析 基于門水平的群落組成分析顯示（見圖4-A），各組大鼠腸道菌群均由Firmicutes（厚壁菌門）、Bacteroidota（擬桿菌門）、Actinobacteriota（放線菌門）及其他組成；厚壁菌門和擬桿菌門占全部樣品總數(shù)90%以上，在各組大鼠腸道菌群中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位；但不同組之間存在顯著差異。與空白組比較，模型組大鼠糞便中的厚壁菌門豐度顯著降低，擬桿菌門、放線菌門的豐度顯著升高；與模型組比較，益生菌組和熟地黃高劑量組的菌群豐度恢復(fù)趨勢(shì)與空白組更加相近，顯示其對(duì)菌群比例的調(diào)節(jié)作用最佳。

基于屬水平的群落組成分析顯示（見圖4-B），各組都具有特定的菌屬，且相同菌屬的豐度也不一致。方差分析結(jié)果顯示，乳桿菌屬（Lactobacillus）、norank_f__Muribaculaceae 的變化最為顯著。與空白組比較，模型組大鼠糞便中乳桿菌屬的豐度顯著降低（P＜0.01），norank_f__Muribaculaceae 的豐度顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組的乳酸菌豐度均有所上升，其中益生菌組顯著升高（P＜0.01）；norank_f__Muribaculaceae豐度均有所下降，其中益生菌組及熟地黃中、高劑量組顯著降低（P＜0.01），效果明顯優(yōu)于生地黃組（見圖4-C、圖4-D）。

采用LEfSe 分析法，以LDA 得分≥3 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，比較各組大鼠腸道菌群豐度在各物種分類水平上的差異，得到多級(jí)物種層級(jí)聚類樹圖，結(jié)果見圖5?？瞻捉M共鑒定出9 個(gè)細(xì)菌類群，其中g(shù)__Lactobacillus、o__Lactobacillales、f__Lactobacillaceae、c__Bacilli 和p__Fimicutes 的相對(duì)占比豐度較高，為優(yōu)勢(shì)菌群。隨著腎陰虛證的發(fā)生，c__Bacteroidia、p__Bacteroidota、o__Bacteroidales、f__Muribaculaceae、g__norank_f__Muribaculaceae 等13 個(gè)分類群在模型組中顯著富集。益生菌組有3個(gè)分類群；熟地黃中、低劑量組分別有5個(gè)和6個(gè)分類群；生地黃高劑量組則無分類群；生地黃中劑量組有2個(gè)分類群；生地黃低劑量組有11 個(gè)分類群，其中f__Prevotellaceae 的相對(duì)豐度占比較高。

圖5 各組大鼠腸道菌群LEfSe 分析Figure 5 LEfSe analysis of gut microbiota in each group of rats

2.4.4功能預(yù)測(cè)分析 利用PICRUSt 軟件對(duì)測(cè)序所得的OTU 豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并對(duì)OTU 進(jìn)行COG（Clusters of Orthologous Groups）功能注釋，獲得OTU在COG 功能水平的注釋信息及各功能在不同樣本中的豐度信息。整體而言，所有樣本的COG 相關(guān)功能主要集中在能量代謝與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方面（見圖6-A），這與腎陰虛的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)?？瞻捉M、模型組、益生菌組、熟地黃高劑量組、生地黃高劑量組的COG 功能主要集中于氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝，碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生，復(fù)制、重組和修復(fù)等方面，見圖6-B。各功能在不同組間的豐度信息不同，這可能是由于腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致的差異，而該差異可能進(jìn)一步影響腸道內(nèi)環(huán)境，加重腸道菌群紊亂。

圖6 全體樣本的COG 功能分類統(tǒng)計(jì)圖（A）與各組樣本的COG 功能分類統(tǒng)計(jì)圖（B）Figure 6 The COG functional classification statistical chart for all samples（A）and the COG functional classification statistical chart for each group of samples（B）

2.5 生、熟地黃對(duì)腎陰虛大鼠糞便中短鏈脂肪酸的影響通過靶向代謝組學(xué)分析大鼠糞便樣品中的短鏈脂肪酸的含量，結(jié)果見表5。與空白組比較，模型組大鼠糞便中的乙酸、丁酸、丙酸、已酸水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），異丁酸水平明顯上升（P＜0.01）。與模型組比較，益生菌組及熟地黃低、中、高劑量組大鼠糞便中的乙酸、丁酸、丙酸水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），異丁酸水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；生地黃給藥組的上述指標(biāo)雖然有所改善，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 生、熟地黃對(duì)腎陰虛大鼠糞便中短鏈脂肪酸含量的影響（±s，n=9）Table 5 Effect of Rehmanniae Radix and Rehmanniae Radix Praeparata on short chain fatty acid content in feces of rats with kidney yin deficiency syndrome（±s，n=9）

表5 生、熟地黃對(duì)腎陰虛大鼠糞便中短鏈脂肪酸含量的影響（±s，n=9）Table 5 Effect of Rehmanniae Radix and Rehmanniae Radix Praeparata on short chain fatty acid content in feces of rats with kidney yin deficiency syndrome（±s，n=9）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

己酸/（μg·g-1）29.84±3.40 15.25±4.90##11.76±4.15 11.74±1.86 16.99±0.68 21.11±1.44*16.86±1.16 5.21±0.99**13.72±2.56組別空白組模型組益生菌組熟地黃高劑量組熟地黃中劑量組熟地黃低劑量組生地黃高劑量組生地黃中劑量組生地黃低劑量組乙酸/（μg·g-1）1 523.72±115.97 1 025.96±56.21##1 355.42±46.15**1 303.84±33.62**1 177.00±69.98*1 142.74±105.87 1 093.78±112.90 966.11±25.65 1 067.73±51.52丁酸/（μg·g-1）271.15±12.36 178.74±5.86##268.40±17.58**288.54±11.91**228.57±14.96**230.68±16.10**188.77±8.92 194.41±16.29 198.29±10.61丙酸/（μg·g-1）20.21±2.59 15.30±0.33#20.48±3.39**21.15±2.20*19.78±0.37*19.57±2.19*18.37±1.66 15.91±1.36 15.66±2.15異丁酸/（μg·g-1）88.27±4.47 123.17±5.28##107.48±6.67*108.83±3.39*83.69±1.26**102.71±7.00**113.85±10.35 116.08±2.97 122.83±9.58戊酸/（μg·g-1）19.66±1.18 19.65±0.85 19.18±1.84 22.28±2.35 17.62±0.42 22.67±2.30 20.79±2.11 22.50±1.22 20.98±0.81異戊酸/（μg·g-1）5.62±0.46 6.08±0.44 5.95±0.34 5.71±1.21 5.69±0.72 6.48±0.80 6.55±0.75 6.56±0.36 6.42±1.04

3 討論

腎上腺皮質(zhì)激素造模法是目前公認(rèn)的腎陰虛證造模方法之一[14]。從中醫(yī)學(xué)角度來說，生理劑量下的糖皮質(zhì)激素具有“少火生氣”之意，而過量使用后則容易導(dǎo)致“陽勝耗陰”，使陰精內(nèi)斂、無法滋養(yǎng)機(jī)體，最終造成腎陰虧虛或陰虛火旺[15]。cAMP、cGMP是細(xì)胞內(nèi)參與能量代謝的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)[16]。研究[17]表明，腎陰虛患者血清中cAMP 水平升高，cGMP 水平降低，同時(shí)cAMP/cGMP 比值也顯著升高。此外，下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸作為調(diào)節(jié)機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、能量代謝的重要樞紐，腎陰虛證患者多表現(xiàn)為HPA 軸功能亢進(jìn)[18]。血清中CRH、ACTH、CORT 水平的變化是HPA 軸的重要指征[19]。因此，本研究將血清cAMP、cGMP、cAMP/cGMP、CRH、ACTH、CORT 水平作為判斷腎陰虛模型復(fù)制成功的客觀指標(biāo)。研究結(jié)果表明，持續(xù)肌肉注射地塞米松磷酸鈉注射液（0.35 mg·kg-1）后，大鼠出現(xiàn)形體消瘦、大便干結(jié)、小便發(fā)黃、自主活動(dòng)增加等腎陰虛癥狀，且血清cAMP、cAMP/cGMP、CRH、ACTH、CORT 水平均顯著升高，cGMP 水平顯著降低，表明腎陰虛大鼠模型復(fù)制成功。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，益生菌對(duì)腎陰虛大鼠的HPA軸也具有一定的改善，與相關(guān)研究[20]報(bào)道益生菌可以通過神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)和HPA 軸改善宿主的神經(jīng)、代謝、激素和免疫信號(hào)通路一致。研究[21]表明，腸道菌群及其代謝物可以直接或間接參與機(jī)體的能量代謝與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，影響宿主的生長(zhǎng)、發(fā)育，與中醫(yī)理論中腎為先天之本，主司生長(zhǎng)發(fā)育，調(diào)控臟腑氣化的論述異曲同工。在一定程度上，腸道菌群的功能與中醫(yī)的“腎”相一致，有研究[22]發(fā)現(xiàn)，慢性腎炎患者腸道菌群紊亂，主要表現(xiàn)為病原菌中腸球菌、腸桿菌的豐度升高，而益生菌中的乳酸桿菌、雙歧桿菌的豐度降低。因此，推測(cè)腸道菌群失衡是腎陰虛的病理基礎(chǔ)，腎陰虛時(shí)腸道菌群及其代謝產(chǎn)物發(fā)生紊亂。因此，本研究通過16SrRNA 測(cè)序和靶向代謝組學(xué)方法探討了地黃炮制前后對(duì)腎陰虛證大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的影響。

首先，通過α及β多樣性分析可知，腎陰虛大鼠的腸道微生物群落豐富度、多樣性升高，說明腎陰虛時(shí)腸道菌群的穩(wěn)定性受到了影響，由此導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。在生、熟地黃干預(yù)后，微生物群落豐富度和多樣性均有不同程度的降低，其中熟地黃組的變化較生地黃組更為明顯，說明熟地黃可以更好地維持腸道微生物群落豐富度和多樣性的穩(wěn)定。

其次，在門水平上模型組大鼠腸道中的厚壁菌門豐度顯著降低，擬桿菌門和放線菌門的豐度顯著升高。研究[23]發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門和擬桿菌門的比例失調(diào)與能量代謝相關(guān)。在屬水平上模型組大鼠腸道中的乳桿菌屬豐度顯著降低。厚壁菌門作為機(jī)體最大的一類細(xì)菌群，在維持宿主免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮重要作用，其中乳酸桿菌屬屬于厚壁菌門，是最常用的益生菌[24]，它可以產(chǎn)生乙酸鹽、乳酸鹽和抗菌物質(zhì)，從而影響內(nèi)分泌系統(tǒng)和能量代謝穩(wěn)態(tài)，以防止病原體干擾機(jī)體健康[25-26]。通過靶向代謝組學(xué)分析各組大鼠糞便中的短鏈脂肪酸（SCFAs）含量發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的乙酸、丁酸、丙酸水平顯著降低，與厚壁菌門和乳酸桿菌屬豐度呈正相關(guān)。短鏈脂肪酸作為腸道菌群的代謝產(chǎn)物，主要由腸道內(nèi)的雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌發(fā)酵膳食纖維后產(chǎn)生，其中乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽占短鏈脂肪酸總含量的95%以上[27]。乙酸鹽可以調(diào)節(jié)腸道pH值，維持腸道菌群穩(wěn)定性，并阻止致病菌的侵入；乙酸還有助于滋養(yǎng)腸道中產(chǎn)生丁酸的細(xì)菌，促進(jìn)腸道有益菌群的多樣性。丁酸則主要由厚壁菌門產(chǎn)生，它可以為結(jié)腸細(xì)胞提供能量，同時(shí)具有保持腸壁完整性的重要功能。而丙酸與乙酸的功能具有相似性。由此可見，腎陰虛時(shí)大鼠的腸道菌群紊亂影響了短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，進(jìn)一步加劇了腸道菌群的紊亂，而給予益生菌及熟地黃干預(yù)后，大鼠糞便中的乙酸、丁酸、丙酸、異丁酸水平得到明顯恢復(fù)。

最后，通過COG 功能分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腎陰虛大鼠的腸道菌群顯著影響氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝，以及碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝等，主要與能量代謝及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方面密切相關(guān)，這與腎陰虛證的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。而生、熟地黃均能一定程度改善腎陰虛大鼠的癥狀及腸道菌群比例，且熟地黃的調(diào)節(jié)作用顯著優(yōu)于生地黃，這可能與地黃經(jīng)炮制后主要化學(xué)成分發(fā)生改變有關(guān)。研究[22]證實(shí)，腸道菌群介導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)化作用可促進(jìn)熟地黃所含糖苷類物質(zhì)在腸道的降解和吸收。同時(shí)，熟地黃中的糖類物質(zhì)可促進(jìn)腸道有益菌雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長(zhǎng)，并對(duì)腸桿菌和腸球菌等有害菌的生長(zhǎng)具有抑制作用[28]。因此，地黃經(jīng)炮制后對(duì)腎陰虛證大鼠治療作用的增強(qiáng)可能與其對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。因此，后續(xù)將對(duì)熟地黃發(fā)揮滋陰益腎作用的具體物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行更深入的研究，以期揭示地黃炮制增效的科學(xué)內(nèi)涵。