鄭旭霞，柴爽，魏立偉，秦娜［河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院），河南鄭州 450016］

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種骨骼脆性增加并伴隨著低骨密度和微架構(gòu)惡化的疾病，其因雌激素缺乏使骨小梁結(jié)構(gòu)受損、骨皮質(zhì)變薄，即使患者在非創(chuàng)傷或輕微創(chuàng)傷性時(shí)，受損的骨骼也會(huì)骨折[1]。骨質(zhì)疏松性骨折的致殘率及致死率均較高，隨著人口老齡化，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥已成為一個(gè)全球性問(wèn)題。如今，臨床上應(yīng)用的治療藥物大多是化學(xué)合成藥物，有一定的副作用，利用傳統(tǒng)中藥或其制劑治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥已成為新的研究熱點(diǎn)[2]。

依據(jù)中醫(yī)藥理論，在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院）自擬了骨松益骨方，該方由黃芪、黨參、當(dāng)歸、淫羊藿、杜仲、延胡索、制沒(méi)藥、雞血藤配伍組成，適用于脾腎氣虛血瘀、原發(fā)性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。臨床研究[3-4]證實(shí)，骨松益骨方可促進(jìn)骨形成，提高患者骨密度，有效改善患者腎虛血瘀癥狀及原發(fā)性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的臨床癥狀，較好地緩解了患者骨質(zhì)疏松性骨痛癥狀，降低了脆性骨折發(fā)生率且不良反應(yīng)小。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，依據(jù)系統(tǒng)生物學(xué)理論通過(guò)搭建“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，可探尋藥物-疾病的關(guān)聯(lián)性[5-6]，這恰恰與中藥的多組分、多歸經(jīng)、多靶點(diǎn)、多功效等特點(diǎn)相符，符合中醫(yī)理論的“整體思想”。本研究擬基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，建立多層網(wǎng)絡(luò)，并借助去卵巢動(dòng)物模型，驗(yàn)證骨松益骨方的作用及對(duì)PI3K/Akt 信號(hào)通路的影響，從多角度闡釋骨松益骨方防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制，為后續(xù)的藥效研究及預(yù)測(cè)作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 篩選骨松益骨方活性成分及相關(guān)靶基因在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http//tcmspw.com/tcmsp.php）中篩選骨松益骨方中的8 味中藥黃芪、黨參、當(dāng)歸、淫羊藿、杜仲、延胡索、制沒(méi)藥、雞血藤的活性成分，條件設(shè)定為：口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30% 、藥物相似性（Drug-Likeness，DL）≥0.18，再將活性成分對(duì)應(yīng)的靶基因輸入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)UniProt（https：//www.uniprot.org/）將其轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的基因名稱。

1.2 獲取絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥疾病相關(guān)基因及藥物潛在作用靶點(diǎn)利用GeneCards（https：//www.Genecards.org）、TTD（https：//db.idrblab.org/ttd/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）、OMIM（https：//omim.org/）檢索并篩選絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥疾病相關(guān)基因。利用R語(yǔ)言將骨松益骨方靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖，獲得骨松益骨方活性成分治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建“藥物活性成分-作用靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)利用Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物活性成分-作用靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。中藥活性成分及作用靶點(diǎn)以“節(jié)點(diǎn)”表示，節(jié)點(diǎn)之間的相互作用以“邊”表示。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將骨松益骨方活性成分治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置篩選條件：置信度分?jǐn)?shù)（Score）＞0.9，同時(shí)隱藏網(wǎng)絡(luò)中無(wú)聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將結(jié)果輸入R語(yǔ)言計(jì)算，并將排前25位的靶點(diǎn)繪制成柱形圖，即得骨松益骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析將中藥-疾病靶標(biāo)利用R語(yǔ)言相關(guān)數(shù)據(jù)包計(jì)算，篩選條件：P＜0.05且Q值＜0.05，得到GO生物功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。

1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究骨松益骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制

1.6.1動(dòng)物 SPF級(jí)6月齡未孕雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量（280±30）g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可合格證號(hào)：SCXK（豫）2017-0001，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：DW2019050005。動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度控制為（26±0.5）℃、濕度為50%、以及12 h光/暗交替環(huán)境中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：KY2021-006-02。

1.6.2藥物及試劑 骨松益骨方由黃芪、黨參、當(dāng)歸、杜仲、淫羊藿、延胡索、制沒(méi)藥、雞血藤組成，每劑總質(zhì)量127 g，中藥飲片購(gòu)自河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院中藥房。中藥飲片加適量水浸泡30 min，加熱煮沸后文火煎30 min，倒出藥液，紗布過(guò)濾；殘?jiān)偌?次，倒出藥液。將2次水煎液混合，置70 ℃恒溫水浴，濃縮藥液至4.62 g·mL-1，4 ℃保存?zhèn)溆?。戊巴比妥鈉注射液，北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)：AM00469；LY294002，美國(guó)MCE 公司，批號(hào)：HY-10108；羊抗兔二抗兔源抗GAPDH、PI3K、p-PI3K、AKT 及p-AKT 一抗，美國(guó)Abcam 公司，批號(hào)分別為 ： ab181602、ab151549、ab138364、ab179463、ab38449；BCA 試劑盒、HE 染色試劑盒、RIPA 裂解液，上海碧云天公司，批號(hào)分別為：P0011、C0105、P0013K；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.6.3儀器 SMZ745 光學(xué)顯微鏡，日本尼康公司；XElx800 酶標(biāo)儀，美國(guó)Perkin Elmer 公司；1659001蛋白電泳儀、Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Centrifuge5424R 低溫高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf股份公司；GIS-500凝膠成像儀，Miulab公司；ABI7500型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀，美國(guó)ABI公司。

1.6.4分組及模型復(fù)制 將60只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，骨松益骨方低、中、高劑量組，骨松益骨方高劑量+LY294002（PI3K/Akt 通路抑制劑）組，每組10只，分籠喂養(yǎng)。模型組，骨松益骨方低、中、高劑量組及骨松益骨方+LY294002組采用摘除雙側(cè)卵巢法進(jìn)行模型復(fù)制[7]；假手術(shù)組同樣采取背側(cè)入路，但是僅切除卵巢周圍等體積大小脂肪。術(shù)后給予一次肌肉注射芐星青霉素（200 U·g-1）預(yù)防感染，自由進(jìn)食水，12 h 光照周期。切除大鼠卵巢后4 周，血中雌激素水平即可出現(xiàn)明顯降低，HE 染色出現(xiàn)骨質(zhì)疏松病理變化，標(biāo)志絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型復(fù)制成功[7-8]。

1.6.5給藥 術(shù)后4 周開(kāi)始灌胃給藥，給藥劑量以臨床成人常用劑量（按70 kg計(jì)算）并按照人和大鼠體表面積折算，骨松益骨方低、中、高劑量組給藥劑量分別為1.25、2.5、5 g·kg-1中藥藥液，同時(shí)以0.3 mg·kg-1的劑量尾靜脈注射生理鹽水；骨松益骨方高劑量+LY294002組以5 g·kg-1中藥藥液灌胃，同時(shí)以0.3 mg·kg-1的劑量尾靜脈注射LY294002；假手術(shù)組及模型組以等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃，同時(shí)以0.3 mg·kg-1的劑量進(jìn)行尾靜脈注射生理鹽水，每天1次，給藥時(shí)間為12周。給藥結(jié)束后采用3%戊巴比妥鈉（1.5 mL·kg-1）腹腔注射進(jìn)行麻醉，取左側(cè)股骨和脛骨，去除周圍軟組織，將股骨放入4%多聚甲醛保存，用石蠟包埋，切片，并進(jìn)行HE 染色；脛骨放入-80℃冰箱保存，供熒光定量PCR和Western Blot檢測(cè)。

1.6.6檢測(cè)指標(biāo) 將剝離干凈的股骨遠(yuǎn)端脫鈣后用HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察骨組織結(jié)構(gòu)變化。提取大鼠脛骨近端總RNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)PI3K和Akt的mRNA 水平進(jìn)行分析，并采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)量。提取大鼠脛骨近端總蛋白，采用Western Blot 法進(jìn)行PI3K、Akt 蛋白定量。PI3K、Akt 的引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1，引物由大連TaKaRa生物工程公司設(shè)計(jì)合成。

表1 PI3K、Akt 的引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度Table 1 Primer sequences and product length for PI3K and Akt

1.6.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組之間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨松益骨方活性成分及相關(guān)靶基因在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索關(guān)鍵詞“黃芪”“黨參”“當(dāng)歸”“淫羊藿”“杜仲”“延胡索”“制沒(méi)藥”“雞血藤”并以O(shè)B≥30%和DL≥0.18進(jìn)行篩選，分別得到20、21、2、23、28、49、45、24個(gè)活性成分。選擇“RelatedTargets”，篩選中藥活性成分所對(duì)應(yīng)的靶基因，將無(wú)法找到相關(guān)靶基因的藥物活性成分除外后，分別得到黃芪315 個(gè)靶基因、黨參257 個(gè)靶基因、當(dāng)歸185 個(gè)靶基因、淫羊藿291個(gè)靶基因、杜仲374個(gè)靶基因、延胡索659 個(gè)靶基因、沒(méi)藥242 個(gè)靶基因、雞血藤305 個(gè)靶基因。將靶基因?qū)險(xiǎn)niProt 轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的基因名稱，去除重復(fù)后，得到骨松益骨方活性成分靶基因共118個(gè)。

2.2 有效成分靶基因和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥靶基因的交集利用GeneCards、TTD、PharmGkb、OMIM 四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)， 輸入關(guān)鍵詞“postmenopausal osteoporosis”，搜索絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的靶基因，分別得1 139、4、15 和10 個(gè)疾病靶基因，刪除重復(fù)基因后共獲得1 155個(gè)基因。利用R語(yǔ)言將活性成分靶基因和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥靶基因取交集，得到70 個(gè)交集靶基因，同時(shí)繪制韋恩圖（見(jiàn)圖1）。這70 個(gè)交集靶基因即為骨松益骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的潛在作用靶基因。

圖1 骨松益骨方-絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥靶點(diǎn)的韋恩圖Figure 1 Venn diagram of Gusong Yigu Decoction-targets of postmenopausal osteoporosis

2.3 “藥物活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建利用Cytoscape 軟件，對(duì)骨松益骨方活性成分與交集基因靶點(diǎn)關(guān)系進(jìn)行可視化分析，繪制“藥物活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行拓?fù)浞治?，依?jù)參數(shù)度值（degree）和緊密中心性（closeness centrality，CC）的中位數(shù)篩選核心網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，共得到91個(gè)活性成分，其中degree 較高的活性成分包括：槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）、7-O-甲基異木糖醇（7-O-methylisomucronulatol）、異鼠李素（isorhamnetin）、7-甲氧基-2-甲基異黃酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）、脫水淫羊藿素（Anhydroicaritin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、8-O-甲基雷烏西（8-O-Methylreyusi）、甘草查爾酮a（licochalcone a）等。骨松益骨方作用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)靶基因共70 個(gè)，degree 較高的關(guān)鍵靶基因?yàn)楹耸荏w輔激活蛋白2（nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）、熱休克蛋白90α 編碼基因（Heat Shock Protein 90 AlphaFamily Class A Member 1，HSP90AA1）、前列腺素氧化環(huán)化酶1（Prostaglandin-Endoperoxide Synthase1，PTGS1）、雄激素受體（androgenreceptor，AR）、雌激素受體1（Estrogen Receptor 1，ESR1）、孕酮受體（Progesterone Receptor，PGR）、絲氨酸蛋白酶1（PRSS1）、過(guò)氧化物酶體增生激活受體γ（Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma，PPARG）。以上活性成分和靶基因可能是骨松益骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵活性成分以及靶基因。

圖2 骨松益骨方“藥物活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 Network of “active ingredients-targets” of Gusong Yigu Decoction

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建見(jiàn)圖3，運(yùn)用STRING 數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)得到的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行分析，構(gòu)建靶點(diǎn)之間的PPI網(wǎng)絡(luò)。共得到70 種蛋白之間的互作關(guān)系，顯示關(guān)系189 條。其中節(jié)點(diǎn)代表靶蛋白，邊代表2 種蛋白的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)篩選，可以得到這個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖中位于核心位置的樞紐蛋白，包括ESR1、CTNNB1、HSP90AA1、FOS、AR、RELA、NCOA1等。再借助R 語(yǔ)言統(tǒng)計(jì)各節(jié)點(diǎn)的邊的數(shù)量，并將Count 值排前25 位的靶基因繪制成柱形圖，見(jiàn)圖4。

圖3 骨松益骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI network of GusongYigu Decoction against postmenopausal osteoporosis

圖4 骨松益骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白Figure 4 Core targets of GusongYigu Decoction against postmenopausal osteoporosis

表2 骨松益骨方對(duì)模型大鼠脛骨近端骨組織中PI3K、Akt mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of Gusong Yigu Decoction on mRNA expressions of PI3K，Akt in bone tissue of proximal tibia of model rats（±s，n=10）

表2 骨松益骨方對(duì)模型大鼠脛骨近端骨組織中PI3K、Akt mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of Gusong Yigu Decoction on mRNA expressions of PI3K，Akt in bone tissue of proximal tibia of model rats（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與骨松益骨方高劑量組比較，△△P＜0.01

Akt 1.15±0.22 0.62±0.08**1.07±0.15##0.59±0.07△△組別假手術(shù)組模型組骨松益骨方高劑量組骨松益骨方高劑量+LY294002組PI3K 1.03±0.17 0.56±0.06**0.99±0.12##0.53±0.05△△

2.5 GO 富集分析和KEGG 通路分析GO富集分析共得到1 926條富集結(jié)果，其中生物過(guò)程（BP）1 789個(gè)，主要涉及對(duì)類固醇激素的反應(yīng)、對(duì)金屬離子的反應(yīng)、對(duì)輻射的反應(yīng)等；細(xì)胞組分（CC）40 個(gè)，主要包括膜筏、膜微域、膜區(qū)等；分子功能（MF）97個(gè)，主要有脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性、核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）聚合酶Ⅱ特異性，泛素蛋白連接酶結(jié)合等。取排前10位的GO富集分析氣泡圖，見(jiàn)圖5。

圖5 骨松益骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的GO 富集分析氣泡圖（前10 位）Figure 5 Bubble diagram of GO functional enrichment analysis for Gusong Yigu Decoction against postmenopausal osteoporosis（top 10）

KEGG富集分析共得到42條富集通路，主要涉及PI3K/Akt 信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、內(nèi)分泌抵抗、MAPK 信號(hào)通路、鉑類藥物耐藥性、p53 信號(hào)通路、白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）-17 信號(hào)通路等，提示骨松益骨方可能通過(guò)以上信號(hào)通路對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)揮治療作用。取排前30 位作KEGG 富集分析氣泡圖，見(jiàn)圖6。

圖6 骨松益骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的KEGG 通路分析氣泡圖（前30 位）Figure 6 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis for Gusong Yigu Decoction against postmenopausal osteoporosis（top 30）

2.6 骨松益骨方對(duì)模型大鼠股骨遠(yuǎn)端骨組織形態(tài)的影響見(jiàn)圖7。假手術(shù)組大鼠骨組織形態(tài)正常，模型組大鼠骨組織呈現(xiàn)骨小梁明顯稀疏、變細(xì)、無(wú)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，皮質(zhì)骨變薄等病理變化。與模型組比較，骨松益骨方低、中、高劑量組在骨小梁的數(shù)量、分布、連續(xù)性等方面明顯改善。與骨松益骨方高劑量組比較，骨松益骨方高劑量+LY294002 組大鼠骨組織病理?yè)p傷明顯加重。

圖7 HE 染色檢測(cè)各組大鼠骨組織形態(tài)（×100）Figure 7 The bone histomorphology of rats in each group detected by HE staining（×100）

2.7 骨松益骨方對(duì)模型大鼠脛骨近端骨組織中PI3K、Akt mRNA 表達(dá)的影響見(jiàn)表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脛骨近端骨組織中PI3K、Akt mRNA的表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，骨松益骨方高劑量組大鼠脛骨近端骨組織中PI3K、Akt mRNA 的表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.01）。與骨松益骨方高劑量組比較，骨松益骨方高劑量+LY294002 組大鼠脛骨近端骨組織中PI3K、Akt mRNA的表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）。

2.8 骨松益骨方對(duì)模型大鼠脛骨近端骨組織中PI3K、Akt 蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)圖8、表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脛骨近端骨組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，骨松益骨方高劑量組大鼠脛骨近端骨組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt明顯升高（P＜0.01）。與骨松益骨方高劑量組比較，骨松益骨方高劑量+LY294002組大鼠脛骨組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 明顯降低（P＜0.01）。

圖8 骨松益骨方對(duì)模型大鼠脛骨組織中PI3K、Akt 蛋白表達(dá)影響的電泳圖Figure 8 Electrophoretogram of the effects of Gusong Yigu Decoction on protein expressions of PI3K and Akt in bone tissue of proximal tibia of model rats

表3 骨松益骨方對(duì)模型大鼠脛骨近端組織中PI3K、Akt蛋白表達(dá)的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of Gusong Yigu Decoction on protein expressions of PI3K and Akt in bone tissue of proximal tibia of model rats（±s，n=10）

表3 骨松益骨方對(duì)模型大鼠脛骨近端組織中PI3K、Akt蛋白表達(dá)的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of Gusong Yigu Decoction on protein expressions of PI3K and Akt in bone tissue of proximal tibia of model rats（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與骨松益骨方高劑量組比較，△△P＜0.01

p-Akt/Akt 0.94±0.16 0.42±0.10**0.68±0.12##0.35±0.09△△組別假手術(shù)組模型組骨松益骨方高劑量組骨松益骨方高劑量+LY294002 組p-PI3K/PI3K 0.78±0.11 0.26±0.08**0.82±0.13##0.14±0.06△△

3 討論

骨松益骨方已被證實(shí)[3-4]能提高骨質(zhì)疏松癥患者骨密度，有效改善患者臨床癥狀，且不良反應(yīng)小。本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，探討骨松益骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，共篩選得到91 個(gè)有效成分和70個(gè)中藥-疾病靶點(diǎn)，其中槲皮素、山柰酚、木犀草素、7-O-甲基異木糖醇等活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)較多，是骨松益骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的活性成分。有研究[9-11]表明，槲皮素，山柰酚，木犀草素、異鼠李素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮均為黃酮類化合物，具有植物雌激素樣作用，能夠清除衰老的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）和內(nèi)皮細(xì)胞并抑制其衰老，加快BMMSCs 的增殖及分化，上調(diào)RUNX2、OSX 等成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)BMP 信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)成骨分化等，從而防治骨質(zhì)疏松。脫水淫羊藿素通過(guò)拮抗選擇性雌激素受體β信號(hào)通路，使UMR106成骨樣細(xì)胞分化、增殖加快，同時(shí)抑制RAW264.7破骨樣細(xì)胞形成和破骨細(xì)胞的骨吸收[12]。β-谷甾醇也可表現(xiàn)出雌激素樣作用，主要通過(guò)影響成骨細(xì)胞增殖、抑制破骨細(xì)胞活性、增加骨密度來(lái)防治骨質(zhì)疏松[13]。另外，槲皮素、山奈酚、異鼠李素等通過(guò)降低活性氧水平或發(fā)揮雌激素樣作用，從而改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，逆轉(zhuǎn)骨代謝[14-15]。閔珺[16]研究表明，PI3K/AKT/FoxO/NF-κB通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與氧化平衡的另一條重要通路，槲皮素可激活此通路促進(jìn)成骨分化，進(jìn)而改善OP狀態(tài)。因此，骨松益骨方活性成分主要通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞形成，以及抗氧化、抗炎等作用對(duì)抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。

絕經(jīng)后婦女快速骨丟失的主要機(jī)制即為雌激素缺乏，雌激素可加速破骨細(xì)胞凋亡、抑制破骨細(xì)胞活性，從而調(diào)控骨骼穩(wěn)態(tài)[17]。而雌激素缺乏勢(shì)必會(huì)加重骨質(zhì)疏松的進(jìn)程，破骨細(xì)胞又是體內(nèi)唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞，因此調(diào)控雌激素及破骨細(xì)胞可以有效干預(yù)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[18]。PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選出骨松益骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白有ESR1、CTNNB1、HSP90AA1、FOS、AR、RELA、NCOA1等，其中排第一位的ESR1與破骨細(xì)胞的形成關(guān)系密切。ESR1 編碼雌激素受體可調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)雌激素水平，其mRNA 表達(dá)與雌激素增殖基因、調(diào)節(jié)基因mRNA表達(dá)呈正相關(guān)[19]。韓林靜等[20]證實(shí)，ESR1作為雌激素通路上的核心靶點(diǎn)基因，通過(guò)控制骨代謝和峰值的獲取，抑制骨損失來(lái)維持體內(nèi)骨量平衡及骨生長(zhǎng)。HSP90AA1是一種熱休克蛋白，具有維持細(xì)胞蛋白穩(wěn)態(tài)及正常功能的作用，下調(diào)HSP90AA1可以調(diào)控MAPK通路中與成骨相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，使間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）向成骨方向分化[21-22]。雄激素調(diào)控骨代謝基于AR 介導(dǎo)，AR 在MSCs、成骨、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中皆可明顯表達(dá)，其能夠抑制破骨細(xì)胞分化，同時(shí)促進(jìn)MSCs 向成骨細(xì)胞分化以及成骨細(xì)胞骨化、礦化等，調(diào)控機(jī)制與Wnt /β-catenin、MAPK、BMP /SmadsRunx2 等通路有關(guān)[23]。

根據(jù)GO 富集分析，骨松益骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥可能通過(guò)影響細(xì)胞對(duì)類固醇激素的反應(yīng)、對(duì)金屬離子的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等多個(gè)BP 過(guò)程；CC層面主要涵蓋了轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等；從MF層面來(lái)看骨松益骨方通過(guò)調(diào)控酶活性、轉(zhuǎn)錄因子等抗骨質(zhì)疏松癥。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，骨松益骨方作用絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的靶點(diǎn)主要涉及PI3K/Akt信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、內(nèi)分泌抵抗、MAPK 信號(hào)通路、鉑類藥物耐藥性、p53 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路等。①PI3K/Akt 信號(hào)通路：PI3K/Akt信號(hào)通路主要影響體內(nèi)細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)和凋亡、激活，其可刺激成骨細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)，同時(shí)抑制其凋亡[24]；此外，PI3K 通路還可以通過(guò)刺激破骨細(xì)胞肌動(dòng)蛋白絲的形成，進(jìn)而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的趨化、附著和擴(kuò)散等，抑制PI3K 信號(hào)通路的表達(dá)能減少成熟破骨細(xì)胞的骨吸收[25]。②TNF信號(hào)通路：引發(fā)骨質(zhì)疏松癥最直接原因之一是體內(nèi)破骨細(xì)胞的增加，而NF-κB 受體活化因子配體（RANKL）作為T(mén)NF 超家族的一員，影響著骨細(xì)胞的成熟分化[26]。此外，炎癥因子也是影響骨質(zhì)疏松發(fā)生的關(guān)鍵因素之一[27]；炎癥因子（如IL、TNF 等）的釋放可以激活NF-κB 通路，造成細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)基因突變引發(fā)腫瘤[28]。因此，這可能是導(dǎo)致檢索絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥通路時(shí)經(jīng)常會(huì)檢索到腫瘤相關(guān)通路的原因。③MAPK 信號(hào)通路：MAPK是細(xì)胞內(nèi)一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，既可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，又能抑制骨吸收[29]。激活MAPK信號(hào)通路可以加快BMP-2、ALP的表達(dá)及成骨細(xì)胞礦化，從而促使骨的形成。而當(dāng)MAPK下游因子ERK失活時(shí)，又可以抑制破骨細(xì)胞形成和活化[30]。沈云玲[31]等發(fā)現(xiàn)調(diào)控NF-κB和MAPK信號(hào)通路可以有效延緩大鼠骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展。④IL-17信號(hào)通路：阻斷IL-17信號(hào)通路，可以延緩破骨細(xì)胞吸收，用于預(yù)防雌激素缺乏性骨丟失；而IL-17受體缺失的小鼠模型行卵巢切除術(shù)后，未因雌激素缺失使骨小梁減少[32]。劉連勇等[33]研究發(fā)現(xiàn)，IL-17 信號(hào)通路介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可以破壞細(xì)胞外基質(zhì)及軟骨合成，抑制膠原修復(fù)基質(zhì)和蛋白聚糖，進(jìn)而調(diào)控骨質(zhì)疏松病理生理過(guò)程。另外有研究[34]發(fā)現(xiàn)，抗IL-17抗體可以使受損骨組織中成骨標(biāo)志物水平升高，減輕氧化應(yīng)激損傷，提升骨骼再生能力，進(jìn)而增強(qiáng)骨質(zhì)疏松性骨折的骨愈合和骨再生的能力。對(duì)上述通路分析發(fā)現(xiàn)，骨松益骨方主要在促進(jìn)成骨、抑制破骨及抗炎等方面維持骨代謝動(dòng)態(tài)平衡，從而有效治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。

在動(dòng)物驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，我們主要研究了骨松益骨方對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響。PI3K/Akt細(xì)胞信號(hào)通路通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和骨形成而參與骨質(zhì)疏松的抑制。建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，通過(guò)檢測(cè)各組大鼠骨組織結(jié)構(gòu)變化及PI3K/Akt 信號(hào)通路相關(guān)mRNA 和蛋白表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證骨松益骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，骨松益骨方可有效改善模型組大鼠骨小梁的組織形態(tài)；并可明顯提升PI3K、Akt mRNA以及磷酸化的PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平，提示骨松益骨方可能通過(guò)激活PI3K/Akt 信號(hào)通路發(fā)揮抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥作用。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”多層網(wǎng)絡(luò)，闡明骨松益骨方通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，并佐以實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為深入研究骨松益骨方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制提供了新視角；但本研究受限于網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)的不全面及時(shí)效性，結(jié)果也具有一定的局限性，需要更多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。因此課題組后續(xù)將在此基礎(chǔ)上繼續(xù)開(kāi)展生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。