史可心，宋征宇，劉傳芬，胡瑾（. 河北北方學(xué)院，河北張家口 075000；. 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科，河北張家口 075000）

腦卒中給全球健康造成巨大負擔(dān)，分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中又稱腦梗死，可由腦動脈內(nèi)形成血凝塊引起，造成神經(jīng)功能缺損，增加血流后可恢復(fù)血液供應(yīng)，但仍引發(fā)一系列氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[1-3]。壞死性凋亡，也叫做程序性壞死，受體相互作用蛋白激酶1（receptor interaction protein kinase 1，RIPK1）、受體相互作用蛋白激酶3（receptor interaction protein kinase 3，RIPK3）和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like proteins，MLKL）是參與調(diào)節(jié)壞死性凋亡的主要分子[4]。近年來多個研究表明腦卒中過程中存在壞死性凋亡，從而進一步加劇腦損傷，比如Naito等[5]發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷后可迅速激活壞死性凋亡，促進腦出血和神經(jīng)炎癥；β-石竹烯可通過抑制壞死性凋亡神經(jīng)元死亡減輕缺血性腦損傷[6]。因此，尋找可抑制腦梗死神經(jīng)元壞死性凋亡的藥物，將可有效減輕腦梗死過程中的腦損傷。

松蘿酸是一種天然存在于中藥松蘿中的二苯并呋喃衍生物，是地衣類植物的重要次級代謝物之一，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種藥理活性，且具有神經(jīng)保護作用[7]。目前，松蘿酸已被廣泛用于膳食補充劑、日化產(chǎn)品（飼料、染料、食品、香水和化妝品）和醫(yī)藥。Erfani等[8]研究發(fā)現(xiàn)，松蘿酸可明顯改善短暫性全腦缺血后記憶障礙，降低CA1 錐體細胞凋亡，降低腦缺血后神經(jīng)炎癥因子的數(shù)量，且改善脂質(zhì)過氧化過程，表明松蘿酸可改善腦缺血后神經(jīng)元損傷以及記憶障礙。

目前關(guān)于松蘿酸對腦缺血后壞死性凋亡的作用尚不清楚，故本研究擬采用大腦中動脈阻塞再灌注（middle cerebral artery occlusion/Reperfusion，MCAO/R）方法建立大鼠腦梗死模型，觀察經(jīng)松蘿酸干預(yù)后，腦梗死大鼠神經(jīng)功能、腦梗死體積、腦組織病理損傷、神經(jīng)元壞死比例、壞死性凋亡相關(guān)通路RIPK1/RIPK3/MLKL因子水平的變化，研究松蘿酸對腦梗死大鼠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物120 只雄性SD 大鼠，SPF 級，6 周齡，體質(zhì)量為180～200 g，購自賽業(yè)（固安）生物科技有限公司。動物質(zhì)量合格證號：37009200011233 ，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2021-003。動物飼養(yǎng)在溫度（22±2）℃、濕度（55～60）%、12 h 光照/12 h黑暗循環(huán)的環(huán)境中。本研究經(jīng)河北北方學(xué)院實驗動物中心倫理委員會批準，批準號：2021-0891。

1.2 藥物及試劑松蘿酸（純度98.69%）、RIP1 抑制劑Necrostatin-1（NEC-1），美國MCE公司，批號分別為：HY-N0656、HY-15760；戊巴比妥鈉（純度＞99%），上海伊卡生物技術(shù)有限公司，批號：P0225；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）、HE染色試劑盒、ECL發(fā)光液，索萊寶公司，批號分別為：T8170、G1120、PE0010；DAPI，美國Thermo 公司，批號：D3571；RNA 提取試劑盒，美國AXYGen 公司，批號：AP-MN-MSRNA- 250G； AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix，南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：MQ101-01/02；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，中國TaKaRa 公司，批號：RR036A；兔源NeuN、P-RIPK1、RIPK1、RIPK3，均購自美國CST公司，批號分別為：#24307、#53286、#3493、#15828；MLKL、GAPDH 抗體、HRP 標記兔IgG/（H+L）二抗，均購自英國Abcam 公司，批號分別為：ab243142、ab181602、ab6721。

1.3 主要儀器Morris 水迷宮及分析軟件Etho Vision，荷蘭Noldus 公司；GS-500 全自動凝膠成像分析系統(tǒng)，騁克儀器有限公司；ST40/ST40R 低溫離心機，美國Thermo 公司；CFX96TM熒光定量PCR儀，美國BIO-RAD公司。

1.4 MCAO/R 法建立大鼠腦梗死模型及分組取120只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、NEC-1 組及低、中、高劑量松蘿酸組，每組20 只。適應(yīng)性飼喂5 d后，模型組、NEC-1組及低、中、高劑量松蘿酸組采用MCAO/R 建立大鼠腦梗死模型[9]。將大鼠用戊巴比妥鈉進行麻醉后，仰臥位固定，暴露頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，將頸內(nèi)動脈用尼龍線閉塞，2 h后慢慢抽離尼龍線，恢復(fù)大腦中動脈血流。假手術(shù)組同樣手術(shù)，但不結(jié)扎線栓。低、中、高劑量松蘿酸組在恢復(fù)大腦中動脈血流前給藥1 次，分別腹腔注射松蘿酸20、25、30 mg·kg-1（5% DMSO 溶解）[8]；NEC-1 組在恢復(fù)大腦中動脈血流前給藥1 次，腹腔注射NEC-11.0 mg·kg-1（5%DMSO 溶解）[10]；假手術(shù)組、模型組則腹腔注射等體積5%的DMSO。造模結(jié)束次日，每天給藥1 次，共3 d。

1.5 Zea-Longa 評分法[11]確定造模成功恢復(fù)大腦中動脈血流后2 h，按照Zea-Longa 評分法評分：無神經(jīng)功能損傷癥狀為0分；不能完全伸展病變對側(cè)前爪為1分；爬行時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2分；爬行時向?qū)?cè)傾倒為3分；不能自主行走為4分。1～3分者納入下一步實驗，本實驗中上述造模大鼠均造模成功。

1.6 大鼠神經(jīng)功能損傷評分藥物干預(yù)3 d 后，采用改良大鼠神經(jīng)功能損傷評分（mNSS）[12]對實驗大鼠的神經(jīng)功能損傷進行評分，分數(shù)越高神經(jīng)功能損傷越嚴重。

1.7 TTC 染色檢測腦梗死體積mNSS 評分結(jié)束后，大鼠用戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1腹腔注射）麻醉，心臟快速灌注冰生理鹽水，迅速取腦；每組取5只大鼠腦組織，-20 ℃冰箱速凍，20 min后取出；將腦半球外組織行冠狀切片，將切片放入TTC 溶液中染色，固定，拍照，ImageJ 軟件分析評估大鼠相對腦梗死體積。相對腦梗死體積=切片白色缺血區(qū)域體積/切片總體積×100%。

1.8 HE 染色觀察腦組織病理損傷每組取5 只大鼠腦組織放入福爾馬林溶液中，24 h 后取出進行梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，切片；將切片依次放入二甲苯、乙醇中；再放入蘇木素中染色5 min，分化后放入伊紅染料中；再次將切片放入乙醇、二甲苯中；最后滴加中性樹脂封片，光鏡下觀察圖像并拍照。

1.9 PI/NeuN 染色觀察神經(jīng)元壞死每組取5 只大鼠處死前3 h腹腔注射碘化丙啶（propidium iodide，PI），末次給藥30 min后，心臟快速灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，取腦，固定，梯度脫水，包埋OCT 化合物，切片（避光），用抗NEUN 抗體（1∶100 稀釋）孵育切片過夜；第2 天磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3 次，每次5 min，然后將切片與羊抗兔IgG/（H+L）（1∶500稀釋）避光室溫孵育2 h；與二抗孵育后，用PBS 緩沖液繼續(xù)洗滌3 次，每次5 min；再將標本用DAPI 染色，熒光顯微鏡拍照，以Image LabTM軟件分析。

1.10 RT-qPCR 法檢測大鼠缺血腦組織中RIPK1、RIPK3、MLKL 的mRNA 水平每組取5 只大鼠的一塊缺血腦組織剪碎，研磨，一部分用于提取RNA，另一部分用于提取蛋白。按照試劑盒提取RNA，合成cDNA，進行RT-PCR 擴增。RT-PCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s，循環(huán)40 次，在NCBI 查找基因序列RIPK1、RIPK3、MLKL，引物由北京擎科生物公司設(shè)計并合成，引物序列見表1。使用2-ΔΔCt法計算RIPK1、RIPK3、MLKL 的相對表達量，實驗重復(fù)3 次，取均值。

1.11 Western Blot 法檢測大鼠缺血腦組織中RIP1/RIP3/MLKL 信號通路相關(guān)蛋白表達取“1.10”項下剩余的研磨后缺血腦組織，加入RIPA 裂解液提取蛋白，將獲得的蛋白用BCA 法進行定量。樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜上，將膜用5%脫脂乳4 ℃過夜封閉；棄去脫脂乳加入1∶1 000 稀釋的兔源p-RIPK1、RIPK1、RIPK3、MLKL、GAPDH抗體，4 ℃孵育8 h，洗膜3遍，每次10 min；加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 二抗室溫孵育1 h，洗膜3 遍，每次10 min；將膜用ECL顯色液處理，凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析目的條帶灰度值（Image LabTM軟件）。實驗重復(fù)3次。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理方法使用SPASS 25.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料結(jié)果表示為均數(shù)±標準差（±s）。單因素方差分析確定多組之間差異，進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠mNSS 評分比較見表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠mNSS 評分明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量松蘿酸組及NEC-1組大鼠mNSS 評分明顯降低（P＜0.05），且松蘿酸組呈劑量依賴性降低（P＜0.05）；高劑量松蘿酸組與NEC-1組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠mNSS 評分、腦組織相對梗死體積、PI 陽性神經(jīng)元比例比較（±s，n=5）Table 2 Comparison of mNSS score，relative infarct volume of brain tissue and proportion of PI positive neurons in each group（±s，n=5）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低劑量松蘿酸組比較，&P＜0.05；與中劑量松蘿酸組比較，△P＜0.05

PI陽性神經(jīng)元比例/%0.00±0.00 31.25±3.41*22.61±2.64#13.31±1.61#&5.45±0.67#&△4.52±0.54#分組假手術(shù)組模型組低劑量松蘿酸組中劑量松蘿酸組高劑量松蘿酸組NEC-1組mNSS評分/分0.00±0.00 12.78±1.45*9.74±1.13#7.95±1.01#&5.14±0.61#&△5.06±0.56#腦組織相對梗死體積/%0.00±0.00 38.21±3.63*25.85±2.17#15.14±1.02#&6.12±0.53#&△5.41±0.43#

2.2 各組大鼠腦組織相對梗死體積比較見表2 和圖1。假手術(shù)組大鼠無腦梗死，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死體積明顯增大（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量松蘿酸組及NEC-1 組大鼠腦梗死體積明顯減?。≒＜0.05），且松蘿酸組呈劑量依賴性減?。≒＜0.05）；高劑量松蘿酸組與NEC-1組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠腦組織的相對梗死體積（TTC 染色）Figure 1 Relative infarct volume of brain tissue in each group（TTC staining）

2.3 HE 染色觀察腦組織病理損傷見圖2。假手術(shù)組大鼠缺血側(cè)神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，核膜清晰。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)破壞，細胞萎縮變形，核固縮。與模型組比較，低、中、高劑量松蘿酸組大鼠缺血側(cè)神經(jīng)細胞形態(tài)受損程度逐漸減輕，核膜逐漸清晰，胞體逐漸恢復(fù)正常，呈劑量依賴性。與模型組比較，NEC-1組大鼠缺血側(cè)神經(jīng)細胞形態(tài)基本完好，核膜基本清晰。高劑量松蘿酸組與NEC-1組結(jié)構(gòu)接近。

圖2 各組大鼠腦組織的病理損傷狀況（HE 染色，×400）Figure 2 Pathological injury of brain tissue of rats in each group（HE staining，×400）

2.4 各組大鼠神經(jīng)元壞死情況比較見表2 和圖3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織PI 陽性神經(jīng)元比例明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量松蘿酸組及NEC-1 組大鼠腦組織PI 陽性神經(jīng)元比例明顯降低（P＜0.05），且松蘿酸組呈劑量依賴性降低（P＜0.05）；高劑量松蘿酸組與NEC-1 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 各組大鼠腦組織的神經(jīng)元壞死狀況（PI/NeuN 染色，×400）Figure 3 Neuronal necrosis in brain tissue of rats in each group（PI/NeuN staining，×400）

2.5 各組大鼠缺血腦組織中RIPK1、RIPK3、MLKL 的mRNA 水平比較見表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血腦組織中RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA 水平均明顯上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量松蘿酸組及NEC-1 組大鼠缺血腦組織中RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA 水平均明顯下調(diào)（P＜0.05），且松蘿酸組呈劑量依賴性降低（P＜0.05）；高劑量松蘿酸組與NEC-1組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠缺血腦組織中RIPK1、RIPK3、MLKL 的mRNA 水平比較（±s，n=5）Table 3 Comparison of mRNA levels of RIPK1，RIPK3 and MLKL in ischemic brain tissue of rats in each group（±s，n=5）

表3 各組大鼠缺血腦組織中RIPK1、RIPK3、MLKL 的mRNA 水平比較（±s，n=5）Table 3 Comparison of mRNA levels of RIPK1，RIPK3 and MLKL in ischemic brain tissue of rats in each group（±s，n=5）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低劑量松蘿酸組比較，&P＜0.05；與中劑量松蘿酸組比較，△P＜0.05

MLKL 0.21±0.03 1.01±0.12*0.72±0.09#0.54±0.05#&0.24±0.01#&△0.23±0.02#分組假手術(shù)組模型組低劑量松蘿酸組中劑量松蘿酸組高劑量松蘿酸組NEC-1組RIPK1 0.26±0.03 1.02±0.13*0.78±0.07#0.52±0.06#&0.31±0.03#&△0.27±0.02#RIPK3 0.23±0.02 1.03±0.11*0.76±0.08#0.51±0.05#&0.27±0.02#&△0.25±0.03#

2.6 各組大鼠缺血腦組織中RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路相關(guān)蛋白表達比較見圖4。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血腦組織中p-RIPK1/RIPK1 比值及RIPK3、MLKL蛋白水平均明顯上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，低、中、高劑量松蘿酸組及NEC-1 組大鼠缺血腦組織中p-RIPK1/RIPK1 比值及RIPK3、MLKL 蛋白水平均明顯下調(diào)（P＜0.05），且松蘿酸組呈劑量依賴性降低（P＜0.05）；高劑量松蘿酸組與NEC-1組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠缺血腦組織中RIPK1/RIPK3/MLKL 信號通路相關(guān)蛋白的表達（±s，n=5）Figure 4 Expression of RIPK1/RIPK3/MLKL signaling pathwayrelated proteins in ischemic brain tissue of rats in each group（±s，n=5）

3 討論

缺血性腦卒中是全球死亡和終身殘疾的主要原因之一，造成了巨大的公共衛(wèi)生負擔(dān)，缺血性腦卒中的嚴重程度以及患者恢復(fù)情況在很大程度上取決于細胞死亡或恢復(fù)[13-14]。本研究用MCAO/R 方法建立大鼠腦梗死模型，通過mNSS評分、腦梗死體積、腦組織病理損傷、神經(jīng)元形態(tài)變化分析腦梗死大鼠腦損傷情況，結(jié)果顯示與假手術(shù)組比，模型組大鼠mNSS評分、腦梗死體積均明顯升高，腦組織以及神經(jīng)元嚴重損傷，表明腦梗死大鼠模型出現(xiàn)腦損傷。

松蘿酸是一種存在于地衣類植物松蘿中的次級代謝物，具有廣泛的藥理活性，包括抗炎，抗氧化等[15]。Studzińska-Sroka 等[7]研究發(fā)現(xiàn)松蘿酸對血腦屏障具有高滲透性，表明松蘿酸能夠穿過血腦屏障，提示松蘿酸是具有神經(jīng)保護作用的生物活性物質(zhì)。研究[16]發(fā)現(xiàn)兩種松蘿酸對映體恢復(fù)了阿爾茲海默癥小鼠的學(xué)習(xí)和認知能力，降低了皮質(zhì)和海馬體上的髓過氧化物酶活性和脂質(zhì)氫過氧化物（LOOH），并降低了海馬體上的IL-1β水平，表明松蘿酸可以恢復(fù)阿爾茲海默癥小鼠認知障礙，減輕炎癥反應(yīng)。通過以上研究猜測松蘿酸可能對腦損傷具有保護作用。本文用不同劑量松蘿酸處理腦梗死大鼠，結(jié)果表明與模型組比較，松蘿酸處理后大鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死體積、神經(jīng)元壞死比例均明顯降低，腦組織病理損傷減輕，表明松蘿酸可減輕腦梗死大鼠腦損傷，結(jié)果顯示與前人研究一致，松蘿酸具有神經(jīng)保護作用。

壞死性凋亡是一種受調(diào)節(jié)的細胞死亡類型，它是由炎癥受體激活引起的，可通過進一步激活RIPK1/RIPK3/MLKL 信號通路發(fā)揮作用[17]。壞死性凋亡與腦梗死的發(fā)病機制有關(guān)，比如已經(jīng)開發(fā)出的RIPK1 抑制劑NEC-1 可減少腦缺血后小鼠腦梗死體積，抑制RIPK1 可減輕腦梗死引起的腦損傷[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)MCAO 小鼠模型出現(xiàn)大量神經(jīng)元細胞死亡，以及RIPK1、RIPK3和MLKL表達明顯增加，而當Hsp3相互作用蛋白過表達后可減少MCAO 后神經(jīng)元細胞死亡，降低RIPK1、RIPK3 和MLKL 水平，提示通過調(diào)節(jié)RIPK1/RIPK3/MLKL軸可以抑制腦缺血再灌注誘導(dǎo)的壞死性凋亡。有研究[20]發(fā)現(xiàn)顆粒蛋白前體PGRN具有神經(jīng)保護作用，MCAO小鼠體內(nèi)敲低PGRN后，可加速MCAO誘導(dǎo)的壞死性凋亡，且促進RIPK1、RIPK3、MLKL表達，表明抑制RIPK1、RIPK3、MLKL表達及磷酸化可以減輕CIRI。以上研究表明壞死性凋亡與腦梗死密切相關(guān)，且抑制壞死性凋亡可減輕腦梗死損傷。

本研究顯示松蘿酸可降低腦梗死大鼠的神經(jīng)元壞死，因此猜測松蘿酸可能通過抑制RIPK1/RIPK3/MLKL 信號通路抑制腦梗死大鼠神經(jīng)元壞死性凋亡，從而減輕腦梗死大鼠腦損傷。結(jié)果可見，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血腦組織中RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA 水平，p-RIPK1/RIPK1 比值及RIPK3、MLKL蛋白水平均明顯上調(diào)，說明模型組大鼠RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路被激活，引起神經(jīng)元壞死性凋亡；與模型組比較，低、中、高劑量松蘿酸組大鼠缺血腦組織中RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA 水平、p-RIPK1/RIPK1 比值及RIPK3、MLKL 蛋白水平均明顯下調(diào)，表明松蘿酸可抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路，從而減輕腦梗死大鼠神經(jīng)元壞死性凋亡。為了進一步驗證此結(jié)果，我們選用RIPK1抑制劑NEC-1處理腦梗死大鼠作為陽性對照，抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路激活，結(jié)果與松蘿酸處理腦梗死大鼠相似，表明松蘿酸可以通過抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路抑制腦梗死大鼠神經(jīng)元壞死性凋亡，從而減輕腦梗死大鼠腦損傷。

綜上所述，松蘿酸可通過抑制RIPK1/RIPK3/MLKL 信號通路抑制腦梗死大鼠神經(jīng)元壞死性凋亡，從而減輕腦梗死大鼠腦損傷，但下游具體調(diào)控機制需進一步研究。