譚睿陟，鄒遠(yuǎn)霞，劉鵬，粟宏偉，李平，王麗（.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心，四川瀘州 66000；. 北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院腎病科，北京 00；. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院泌尿外科，四川瀘州 66000；. 北京中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所免疫介導(dǎo)炎癥疾病北京重點實驗室，北京 0009）

慢性腎臟?。–hronic Kidney Disease，CKD）的發(fā)病率不斷升高，近十年以來，慢性腎臟病患病率增加了29.3%[1]，目前其患病人數(shù)占全球總?cè)藬?shù)的10%～13%[2]，已成為一個主要的公共衛(wèi)生問題。慢性腎臟病的風(fēng)險隨著年齡的增長而增加，且高血壓、糖尿病、心血管疾病、腎毒素、急性腎損傷等都是慢性腎臟病的危險因素[3]。近年來的研究[4]表明，腎臟纖維化是慢性腎臟病的主要病理表現(xiàn)，其進(jìn)行性的特征不僅損害腎臟，還會損害心臟，被認(rèn)為是誘發(fā)慢性腎臟病患者極高發(fā)病率和死亡率的重要原因。值得注意的是，纖維化過程的早期階段以涉及先天免疫和適應(yīng)性免疫的復(fù)雜炎癥事件為特征[5]。而在器官損傷的早期階段，纖維化通常是由持續(xù)數(shù)月的免疫反應(yīng)誘導(dǎo)的慢性炎癥引起的[6]。其中巨噬細(xì)胞是一類重要的炎癥細(xì)胞，在慢性腎臟病炎癥和纖維化中具有關(guān)鍵的促進(jìn)作用[7]。已有研究[8-9]報道，巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)C 型凝集素（Macrophage-inducible C-type lectin，Mincle）是巨噬細(xì)胞表面促炎癥的受體，在多種腎臟損傷中扮演重要角色。

柴黃益腎顆粒（ChaihuangYishenGranules），又稱芪龍利水方（由七味藥，柴胡、黃芪、當(dāng)歸、穿山龍、石韋、豬苓、水蛭組成），起源于著名中醫(yī)師時振聲治療慢性腎病的臨床經(jīng)驗[10]，是由北京中日友好醫(yī)院腎病科李平研究員結(jié)合時振聲教授臨床經(jīng)驗開發(fā)的慢性腎病治療中藥復(fù)方，已于2008 年獲得國家藥監(jiān)局頒發(fā)的臨床試驗批件。該方目前已在臨床被用于治療慢性腎臟疾病，并在減少蛋白尿、降低腎臟纖維化、抑制炎癥方面具有明顯效果[11-12]，但具體機(jī)制還未闡明。

本研究擬采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎（Unilateral Ureteral Obstruction，UUO）法誘導(dǎo)慢性腎臟損傷和纖維化，運用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法、流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot等方法觀察柴黃益腎顆粒對UUO 小鼠腎臟炎癥、纖維化和損傷的改善作用，及巨噬細(xì)胞炎癥響應(yīng)關(guān)鍵分子Mincle 是否為柴黃益腎顆粒干預(yù)UUO 腎臟損傷和纖維化的關(guān)鍵靶點，以期探討柴黃益腎顆粒對UUO 小鼠腎損傷和纖維化的保護(hù)作用及其與巨噬細(xì)胞Mincle的調(diào)控作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級雄性C57BL/6 小鼠，22～25 g，36 只，8 周齡大小，購自成都藥康生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2020-034，動物質(zhì)量合格證號：511214900004452。所有小鼠均飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心動物房內(nèi)，溫度為20～23 ℃，相對濕度為40%～60%，12 h/12 h 明暗交替。本實驗所涉及的動物實驗方案已通過西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，審批編號為：20211122-079。

1.2 主要藥品和試劑柴黃益腎顆粒免煎劑（組方含柴胡、黃芪、當(dāng)歸、穿山龍、石韋、豬苓、水蛭），由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備；免疫組化試劑盒，批號：PV-9000，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；小鼠白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司，批號分別為：EMC001b、EMC004、EMC102a；小鼠Mincle抗體，批號：sc-390806，購自美國Santa Cruz 公司；小鼠纖維粘連蛋白（fibronectin，F(xiàn)n）和α-肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體均購自上海艾比瑪特醫(yī)藥科技有限公司，批號分別為：T59537、TA1032；小鼠磷酸化核因子-kappa B（phosphorylated-nuclear factor-kappa B，p-NK-κB）、核因子-kappa B（nuclear factor-kappa B，NK-κB）、磷酸化脾酪氨酸激酶（phosphorylated-spleen tyrosine kinase，p-Syk）、脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司，批號分別為：3033S、8242S、2717S、13198S；Mincle激動劑海藻糖-6，6-二苯甲酸酯（trehalose-6，6-dibehenate，TDB）試劑購自美國InvivoGen 公司，批號：tlrl-tdb；cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑（批號：R323-01）、熒光定量PCR試劑（批號：Q711-03），均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 主要儀器FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀，美國BD公司；Synergy2 酶標(biāo)儀，美國BioTek 公司；RM2255型組織切片系統(tǒng)、ICC50W 顯微鏡，德國Leica 公司；ChemiDoc XRS+型凝膠成像系統(tǒng)、Mini-Protein Tetra system型蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；LightCycler480 Ⅱ型實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀，瑞士Roche公司； NANODROP 2000型超微量分光光度計、EVOS熒光顯微鏡，美國Thermo公司。

1.4 分組、給藥及采樣將36只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、柴黃益腎顆粒低劑量組、柴黃益腎顆粒高劑量組、陽性對照厄貝沙坦組和柴黃益腎顆粒高劑量+TDB 組，每組6 只小鼠。術(shù)后1 h，柴黃益腎顆粒低、高劑量組及柴黃益腎顆粒高劑量+TDB 組分別灌胃免煎劑3.835、7.67、7.67 g·kg-1（藥物劑量按照人免煎劑每日用量25.287 g換算），陽性對照組灌胃厄貝沙坦20 mg·kg-1，假手術(shù)組、模型組小鼠灌胃等量生理鹽水，每日1 次，連續(xù)灌胃7 d。柴黃益腎顆粒高劑量+TDB組于術(shù)后1 h一次性腹腔注射10 mg·kg-1TDB。造模7 d后，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)心臟采血后迅速分離腎臟組織。

1.5 單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）造模[13]模型組和各藥物干預(yù)組小鼠經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉后，腹部朝下平臥在手術(shù)臺上。左側(cè)大腿根部附近皮膚去毛，用75%乙醇消毒，縱向剪開該處皮膚約1 cm，并隨后剪開下方的肌肉層1 cm。用鑷子輕輕拉出腎臟相連的脂肪墊，將腎臟帶出。用鑷子從腎臟下極脂肪慢慢梳理出白色輸尿管，并用縫合線在輸尿管上做兩次結(jié)扎，兩次結(jié)扎位置相鄰0.5 cm，隨后從結(jié)扎的中間剪斷輸尿管。將腎臟放回腹腔內(nèi)部，依次縫合肌肉層和皮膚層，并消毒。實驗過程中保持室溫（25±2）℃，術(shù)后給小鼠保暖直至蘇醒。

1.6 腎臟組織形態(tài)的觀察按“1.4”項下取得的各組腎臟組織，于4%多聚甲醛固定48 h，采用常規(guī)石蠟包埋對組織進(jìn)行處理。隨后將包埋的腎臟進(jìn)行切片，切片厚度為4 μm。獲得的腎臟切片隨后進(jìn)行脫蠟、復(fù)水后采用蘇木精-伊紅染色（蘇木精染色5 min，伊紅染色40 s）和天狼星紅染色進(jìn)行組織病理染色。將染色完成的切片晾干后用中性樹膠封片。采用萊卡光學(xué)顯微鏡觀察和拍攝各組小鼠腎臟病理變化。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測小鼠腎臟組織中α-SMA 的表達(dá)各組小鼠腎臟組織固定、包埋、切片、脫蠟、復(fù)水后用檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）微波修復(fù)抗原。隨后用5% BSA 對組織切片進(jìn)行室溫封閉30 min。對組織滴加α-SMA（1∶200 稀釋）一抗4 ℃孵育過夜后加生物素標(biāo)記的二抗（稀釋比例為1∶1 000），并用DAB（稀釋20 倍）顯色，蘇木精染細(xì)胞核后晾干封片。采用萊卡光學(xué)顯微鏡觀察和拍攝各組小鼠腎臟組織中α-SMA的著色情況。

1.8 免疫熒光法檢測小鼠腎臟組織中Mincle 的表達(dá)獲得的各組腎臟組織經(jīng)固定、脫水后，采用OCT 包埋。將腎臟組織切片后滴加0.5%破膜劑室溫處理15 min，并用5% FBS 對組織切片封閉30 min；滴加Mincle 一抗（1∶50）4 ℃孵育過夜；PBS 清洗2 次后，滴加FITC 二抗（1∶200）孵育組織1 h，隨后清洗組織2 次；滴加DAPI工作液，并封片；采用EVOS顯微鏡觀察各組腎臟中Mincle的熒光表達(dá)情況。

1.9 ELISA 檢測腎臟組織勻漿中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的濃度收集小鼠腎臟后制備組織勻漿，并稀釋10 倍；向反應(yīng)孔中加入小鼠腎臟組織勻漿稀釋液以及不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃孵育90 min；用洗滌液清洗5 次后，加入生物素化抗體工作液，37 ℃處理60 min；清洗5 次后加入酶結(jié)合物工作液37 ℃避光孵育30 min；最后以此加入顯色底物和終止液，在450 nm 波長下測量OD 值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各樣本中IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度。

1.10 Real-time PCR 法檢測腎臟組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的mRNA 表達(dá)水平運用Trizol 試劑提取組織樣本的RNA，并吸取1 μg RNA用于逆轉(zhuǎn)錄。取獲得的cDNA 1 μL 用于PCR 鑒定。實時定量PCR 反應(yīng)體系：5 μL SYBR mix，1 μL cDNA，1 μL正向+反向引物，3 μL ddH2O。實時定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃、5min，40 個循環(huán)（95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、20 s），72 ℃、7 min，4 ℃保存。根據(jù)獲得的CT值計算基因的相對表達(dá)量。

1.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測腎臟組織中表達(dá)Mincle 的巨噬細(xì)胞數(shù)量取新鮮的腎臟組織置于6 孔板的2 mL 培養(yǎng)基中，用剪刀將組織剪碎；加入60 μL膠原Ⅳ消化液，以1 500 r·min-1、37 ℃震蕩消化15 min后用槍頭將組織吹散，再消化15 min；以1 500 r·min-1離心5 min（離心半徑10.5 cm）后用紅細(xì)胞裂解液破紅，并過70 μm細(xì)胞篩；將得到的細(xì)胞以1 500 r·min-1離心5 min（離心半徑10.5 cm）后加入4%多聚甲醛室溫固定30 min；PBS清洗2次后加入5% BSA固定30 min。隨后加入Mincle 和F4/80 一抗于4 ℃孵育過夜；PBS清洗2 次后加入FITC 和APC 熒光二抗，避光室溫孵育1 h；在流式細(xì)胞儀中根據(jù)單染劃門，并檢測各細(xì)胞熒光表達(dá)情況。

1.12 Western Blot 法檢測腎臟組織中多種蛋白表達(dá)SDS-PAGE 膠中每孔上樣70 μg蛋白后電泳，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)膜至0.22 μm的PVDF膜上，5%BSA室溫封閉1 h，隨后加入對應(yīng)的一抗，4 ℃孵育過夜；按照抗體來源加入對應(yīng)的辣根酶標(biāo)記的抗鼠或抗兔二抗（1∶3 000），室溫孵育1 h；將膜放入超敏化學(xué)發(fā)光試劑中10～30 s并拍照；采用ImageJ 軟件讀取條帶灰度值。

1.13 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，并用沃勒-鄧肯法及鄧尼特法進(jìn)行事后多重比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對UUO 小鼠腎臟損傷和纖維化的影響見圖1。蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組腎臟病理損傷嚴(yán)重，腎小管上皮細(xì)胞腫脹脫落、壞死和免疫細(xì)胞浸潤明顯增加；與模型組比，柴黃益腎顆粒低劑量組、高劑量組對小鼠腎組織病理損傷均有所減弱，其中高劑量組的改善效果較好。天狼星紅染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比，模型組間質(zhì)深色著色區(qū)域明顯增加，表明腎臟中間質(zhì)纖維化明顯；與模型組比，柴黃益腎顆粒低劑量組、高劑量組對小鼠腎組織間質(zhì)纖維化均有所減輕，其中高劑量組抗腎臟纖維化效果較好。

圖1 柴黃益腎顆粒對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）誘導(dǎo)的模型小鼠腎纖維化和腎損傷的影響（蘇木精-伊紅染色，天狼星紅染色，×200）Figure 1 Effect of Chaihuang Yishen Granule on UUO-induced renal fibrosis and injury（HE and Sirius Red staining，×200）

2.2 對UUO 小鼠腎臟α-SMA 表達(dá)的影響結(jié)果見圖2。免疫組化結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組腎臟間質(zhì)α-SMA著色區(qū)域明顯增加；與模型組比，柴黃益腎顆粒低劑量組、高劑量組中小鼠腎組織α-SMA表達(dá)有所減弱，其中高劑量組α-SMA表達(dá)減少更多。

圖2 柴黃益腎顆粒對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中α-SMA 表達(dá)的影響（免疫組化，×200）Figure 2 The effect of Chaihuang Yishen Granules on expression of a-SMA in kidney of UUO mice（IHC，×200）

2.3 對UUO 小鼠腎臟Fn 和α-SMA 蛋白的影響結(jié)果見圖3和表1。Western Blot結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組腎臟中纖維化指標(biāo)Fn和α-SMA蛋白的相對表達(dá)量均明顯增加（P＜0.01）；與模型組比，柴黃益腎顆粒低、高劑量組中小鼠腎組織Fn和α-SMA蛋白的相對表達(dá)量均明顯降低（P＜0.01）。

表1 柴黃益腎顆粒對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中Fn 和α-SMA 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Table 1 Effect of Chaihuang Yishen Granules on the protein expression of Fn and α-SMA in the kidneys of UUO mice（±s，n=3）

表1 柴黃益腎顆粒對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中Fn 和α-SMA 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Table 1 Effect of Chaihuang Yishen Granules on the protein expression of Fn and α-SMA in the kidneys of UUO mice（±s，n=3）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

α-SMA/GAPDH 0.16±0.04 0.98±0.12##0.26±0.07**0.20±0.02**0.34±0.03**組別假手術(shù)組模型組柴黃益腎顆粒低劑量組柴黃益腎顆粒高劑量組陽性對照厄貝沙坦組Fn/GAPDH 0.18±0.04 1.15±0.15##0.36±0.04**0.37±0.05**0.61±0.05**

圖3 各組小鼠腎臟中Fn 和α-SMA 蛋白表達(dá)狀況Figure 3 Protein expression of Fn and α-SMA in mice kidneys of each group

2.4 對UUO 小鼠腎臟炎癥因子濃度的影響采用ELISA法檢測各組小鼠腎臟懸液炎癥因子濃度，結(jié)果見表2。與假手術(shù)組比，模型組小鼠腎臟懸液中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的濃度明顯增加（P＜0.01）；與模型組比，柴黃益腎顆粒低劑量組中炎癥因子TNF-α 的含量明顯降低（P＜0.05），高劑量組IL-1β、IL-6 及TNF-α 的濃度均明顯降低（P＜0.01），表明柴黃益腎顆粒具有明顯的抗炎癥作用。

表2 柴黃益腎顆粒對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中IL-1β、IL-6 和TNF-α 濃度的影響（±s，n=6）Table 2Effect of Chaihuang Yishen Granules on the concentrations of IL-1β，IL-6 and TNF-α in the kidneys of UUO mice（±s，n=6）

表2 柴黃益腎顆粒對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中IL-1β、IL-6 和TNF-α 濃度的影響（±s，n=6）Table 2Effect of Chaihuang Yishen Granules on the concentrations of IL-1β，IL-6 and TNF-α in the kidneys of UUO mice（±s，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

TNF-α/（pg·mL-1）74.61±7.75 363.55±35.51##295.58±10.25*181.14±22.87**197.65±32.21**組別假手術(shù)組模型組柴黃益腎顆粒低劑量組柴黃益腎顆粒高劑量組陽性對照厄貝沙坦組IL-1β/（pg·mL-1）98.68±34.08 356.71±41.49##287.05±27.45 172.11±51.23**203.49±19.57**IL-6/（pg·mL-1）126.83±51.74 715.37±31.59##609.66±48.36 342.82±63.40**373.04±73.85**

2.5 對UUO 小鼠腎臟NF-κB 活性的影響結(jié)果見圖4 和表3。與假手術(shù)組比較，模型組腎臟中炎癥關(guān)鍵蛋白NF-κB的磷酸化水平明顯增加（P＜0.01）；與模型組比，柴黃益腎顆粒高劑量組中小鼠腎組織NF-κB的磷酸化水平明顯降低（P＜0.01）。

表3 柴黃益腎顆粒對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中NF-κB 磷酸化的影響（±s，n=3）Table 3 Effect of Chaihuang Yishen Granules on the protein level of p-NF-κB in the kidneys of UUO mice（±s，n=3）

表3 柴黃益腎顆粒對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中NF-κB 磷酸化的影響（±s，n=3）Table 3 Effect of Chaihuang Yishen Granules on the protein level of p-NF-κB in the kidneys of UUO mice（±s，n=3）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

p-NF-κB/NF-κB 0.14±0.04 0.71±0.09##0.62±0.05 0.40±0.06**0.44±0.03**組別假手術(shù)組模型組柴黃益腎顆粒低劑量組柴黃益腎顆粒高劑量組陽性對照厄貝沙坦組

圖4 各組小鼠腎臟中NF-κB 磷酸化的狀況Figure 4 Phosphorylation of NF-κB in the mice kidneys of each group

2.6 對UUO 小鼠腎臟炎癥因子mRNA 表達(dá)的影響結(jié)果見表4。Real-time PCR 結(jié)果表明，與假手術(shù)組比，模型組小鼠腎臟中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的mRNA 表達(dá)均明顯增加（P＜0.01）；與模型組比，柴黃益腎顆粒高劑量組中以上炎癥因子的表達(dá)量均明顯降低（P＜0.01）。

表4 柴黃益腎顆粒對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=6）Table 4 Effect of Chaihuang Yishen Granules on the mRNA levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in the kidneys of UUO mice（±s，n=6）

表4 柴黃益腎顆粒對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=6）Table 4 Effect of Chaihuang Yishen Granules on the mRNA levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in the kidneys of UUO mice（±s，n=6）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

TNF-α 5.0×10-4±1.2×10-4 6.8×10-2±9.4×10-3##2.9×10-2±1.8×10-2*1.3×10-2±4.3×10-3**2.2×10-2±1.0×10-2**組別假手術(shù)組模型組柴黃益腎顆粒低劑量組柴黃益腎顆粒高劑量組陽性對照厄貝沙坦組IL-1β 6.1×10-5±3.9×10-5 3.9×10-3±1.3×10-3##8.6×10-4±4.5×10-4**4.1×10-4±1.8×10-4**8.8×10-4±1.0×10-4**IL-6 6.8×10-6±2.4×10-6 1.4×10-4±4.6×10-5##8.0×10-5±2.2×10-5 3.9×10-5±1.5×10-5**4.8×10-5±8.5×10-6**

2.7 對UUO 小鼠腎臟巨噬細(xì)胞Mincle 表達(dá)的影響結(jié)果見圖5。免疫熒光結(jié)果顯示Mincle（綠色熒光）主要表達(dá)于腎臟間質(zhì)，與假手術(shù)組比，模型組小鼠腎臟間質(zhì)中綠色熒光明顯增加，表明Mincle 表達(dá)明顯升高；與模型組比，柴黃益腎顆粒高劑量組能有效減少綠色熒光，抑制Mincle的表達(dá)。

圖5 柴黃益腎顆粒對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中Mincle 表達(dá)的影響（免疫熒光）Figure 5 The effect of Chaihuang Yishen Granules on expression of Mincle in kidney of UUO mice（IF）

2.8 對UUO 小鼠腎臟Mincle 蛋白的影響結(jié)果見圖6和表5。Western Blot 結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組腎臟中Mincle及其下游的磷酸化Syk蛋白的相對表達(dá)量均明顯增加（P＜0.01）；與模型組比，柴黃益腎顆粒高劑量組中小鼠腎組織Mincle 和磷酸化Syk蛋白的相對表達(dá)量均明顯降低（P＜0.01）。

表5 柴黃益腎顆粒對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中Mincle 蛋白及Syk 磷酸化的影響（±s，n=3）Table 5 Effect of Chaihuang Yishen Granules on the protein levels of Mincle and p-Syk in the kidneys of UUO mice（±s，n=3）

表5 柴黃益腎顆粒對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中Mincle 蛋白及Syk 磷酸化的影響（±s，n=3）Table 5 Effect of Chaihuang Yishen Granules on the protein levels of Mincle and p-Syk in the kidneys of UUO mice（±s，n=3）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

p-Syk/Syk 0.22±0.03 1.72±0.27##1.15±0.21*0.74±0.09**1.22±0.10*組別假手術(shù)組模型組柴黃益腎顆粒低劑量組柴黃益腎顆粒高劑量組陽性對照厄貝沙坦組Mincle/GAPDH 0.09±0.01 1.36±0.19##1.15±0.09 0.41±0.09**0.60±0.15**

圖6 各組小鼠腎臟中Mincle 蛋白及Syk 磷酸化的狀況Figure 6 Protein levels of Mincle and Syk in the mice kidneys of each group

2.9 對UUO 小鼠腎臟Mincle 陽性巨噬細(xì)胞數(shù)量的影響結(jié)果見圖7 和表6。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組腎臟中表達(dá)Mincle（APC熒光）的巨噬細(xì)胞（F4/80 FITC 熒光）比例明顯增加（P＜0.01）；與模型組比，柴黃益腎顆粒低、高劑量組中小鼠腎組織中表達(dá)Mincle的巨噬細(xì)胞比例均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表6 柴黃益腎顆粒對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中Mincle 在巨噬細(xì)胞中表達(dá)的影響（±s，%；n=3）Table 6 The effect of Chaihuang Yishen Granules on the expression of Mincle in macrophages in the kidneys of UUO mce（±s，%；n=3）

表6 柴黃益腎顆粒對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中Mincle 在巨噬細(xì)胞中表達(dá)的影響（±s，%；n=3）Table 6 The effect of Chaihuang Yishen Granules on the expression of Mincle in macrophages in the kidneys of UUO mce（±s，%；n=3）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

Mincle+/（F4/80）+2.24±1.09 18.15±4.17##7.15±0.50*3.63±2.36**7.23±1.95*組別假手術(shù)組模型組柴黃益腎顆粒低劑量組柴黃益腎顆粒高劑量組陽性對照厄貝沙坦組

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠腎臟中Mincle 在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)Figure 7 The expression of Mincle in macrophages in the mice kidneys of each group by flow cytometry

2.10 Mincle 配體TDB 對柴黃益腎顆粒抑制UUO 腎臟損傷和纖維化的影響見圖8。蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示，與柴黃益腎顆粒高劑量組比較，柴黃益腎顆粒高劑量+TDB 組腎臟病理損傷嚴(yán)重，腎小管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹脫落、壞死明顯增加；天狼星紅染色結(jié)果顯示，與柴黃益腎顆粒高劑量組比較，柴黃益腎顆粒高劑量+TDB組腎臟中間質(zhì)纖維化增強，說明增加Mincle 表達(dá)可抵消柴黃益腎顆粒對UUO 模型小鼠腎臟炎癥和纖維化的保護(hù)作用。

圖8 TDB 恢復(fù)了柴黃益腎顆粒抑制的單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎纖維化和腎損傷（蘇木精-伊紅染色，天狼星紅染色，×200）Figure 8 TDB reversed the inhibition of Chaihuang Yishen Granules on fibrosis and injury in Chaihuang Yishen Granule treated UUO mice（HE and Sirius Red staining，×200）

2.11 Mincle 配體TDB 對柴黃益腎顆粒抑制UUO模型小鼠腎臟Mincle、α-SMA、Fn、p-NF-κB 和p-Syk 蛋白的影響結(jié)果見圖9 和表7。與柴黃益腎顆粒高劑量組比較，柴黃益腎顆粒高劑量+TDB組腎臟中Mincle、α-SMA、Fn 及下游信號磷酸化NF-κB及Syk 的蛋白相對表達(dá)量均明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）。

表7 TDB 對柴黃益腎顆粒干預(yù)的單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中Mincle、α-SMA、Fn 及下游信號磷酸化NF-κB 和Syk 蛋白相對表達(dá)量的影響（±s，n=3）Table 7 The protein levels of Mincle，α-SMA，F(xiàn)n，p-NF-κB and p-Syk in kidney of each group（±s，n=3）

表7 TDB 對柴黃益腎顆粒干預(yù)的單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中Mincle、α-SMA、Fn 及下游信號磷酸化NF-κB 和Syk 蛋白相對表達(dá)量的影響（±s，n=3）Table 7 The protein levels of Mincle，α-SMA，F(xiàn)n，p-NF-κB and p-Syk in kidney of each group（±s，n=3）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與柴黃益腎顆粒高劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

p-Syk/Syk 0.19±0.03 0.82±0.05##0.22±0.07**0.99±0.07△△組別假手術(shù)組模型組柴黃益腎顆粒高劑量組柴黃益腎顆粒高劑量+TDB 組Mincle/GAPDH 0.12±0.03 1.13±0.08##0.53±0.11**1.22±0.10△△α-SMA/GAPDH 0.11±0.01 0.82±0.04##0.28±0.08**0.71±0.07△△Fn/GAPDH 0.76±0.10 2.19±0.11##1.07±0.03**1.45±0.15△p-NF-κB/NF-κB 0.07±0.02 0.88±0.06##0.29±0.04**0.95±0.12△△

圖9 TDB 作用下各組小鼠腎臟中Mincle、α-SMA、Fn 及下游信號磷酸化NF-κB 和Syk 蛋白表達(dá)量狀況Figure 9 The effect of TDB on protein levels of Mincle，α-SMA，F(xiàn)n，p-NF-κB and p-Syk in Chaihuang Yishen Granules treated kidney of UUO mice

2.12 Mincle 配體TDB 對柴黃益腎顆粒抑制UUO模型小鼠腎臟炎癥因子濃度的影響結(jié)果見表8。ELISA結(jié)果表明，與柴黃益腎顆粒高劑量組比，柴黃益腎顆粒高劑量+TDB 組小鼠腎臟懸液中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度明顯增加（P＜0.01）。

表8 TDB 對柴黃益腎顆粒干預(yù)的單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中IL-1β、IL-6 和TNF-α 濃度的影響（±s，n=3）Table 8 The effect of TDB on concentration of IL-1β，IL-6 and TNF-αin Chaihuang Yishen Granules treated kidney of UUO mice（±s，n=3）

表8 TDB 對柴黃益腎顆粒干預(yù)的單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型小鼠腎臟中IL-1β、IL-6 和TNF-α 濃度的影響（±s，n=3）Table 8 The effect of TDB on concentration of IL-1β，IL-6 and TNF-αin Chaihuang Yishen Granules treated kidney of UUO mice（±s，n=3）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與柴黃益腎顆粒高劑量組比較，△△P＜0.01

TNF-α/（pg·mL-1）66.33±13.61 378.59±45.71##169.02±35.16**320.74±35.92△△組別假手術(shù)組模型組柴黃益腎顆粒高劑量組柴黃益腎顆粒高劑量+TDB 組IL-1β/（pg·mL-1）54.33±9.02 389.70±78.69##149.31±29.57**316.02±22.34△△IL-6/（pg·mL-1）137.38±39.55 861.01±75.72##367.34±41.0**678.77±22.50△△

3 討論

慢性腎臟病是日益嚴(yán)重的健康問題，其在我國的發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到了10.8%[14]，對人民生命健康以及國家醫(yī)療體系造成了很大的危害和負(fù)擔(dān)。慢性腎病在早期階段可能沒有癥狀，且疾病軌跡難以把握，容易使人忽視對其的治療，造成嚴(yán)重的后果，比如發(fā)展為腎臟衰竭后，只能通過腎臟替代療法維持生命[15]。因此，探索慢性腎病的發(fā)病規(guī)律和潛在發(fā)病機(jī)制，對于疾病的預(yù)防和治療具有重要意義。研究[3]表明，慢性腎炎、高血壓、糖尿病、腎毒性藥物的不當(dāng)服用、尿路梗阻等均是誘導(dǎo)慢性腎病的危險因素。在慢性腎病的病理發(fā)展過程中，腎臟纖維化被認(rèn)為是腎臟損傷不可逆的關(guān)鍵病理變化，其是適應(yīng)不良修復(fù)的最終病理過程[4]。而慢性腎臟病纖維化發(fā)生的驅(qū)動因素可能是自身免疫、氧化應(yīng)激或炎癥[16]。重塑的病理性腎臟纖維化過程經(jīng)常導(dǎo)致腎臟功能的障礙，并可能與高發(fā)病率和高死亡率息息相關(guān)[17]。因此調(diào)控慢性腎病炎癥，預(yù)防和緩解纖維化進(jìn)程可能是改善慢性腎臟病腎臟損傷，避免腎臟不可逆損傷的重要途徑。

柴黃益腎顆粒基本功效為益氣活血，清熱利濕。研究[18]表明，柴黃益腎顆粒可改善腎小球的病理損害，減少蛋白尿，抑制巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的浸潤，下調(diào)TGF-β 和Ⅰ型膠原在腎小球的表達(dá)。然而，其對慢性腎病間質(zhì)纖維化的作用還未見報道。本研究采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）的方法，建立了腎臟纖維化模型，并予以柴黃益腎顆粒干預(yù)，以觀察柴黃益腎顆粒對慢性腎病纖維化的改善作用。結(jié)果表明，UUO 模型中腎小管損傷和腎臟間質(zhì)纖維化病變明顯，給予低劑量和高劑量柴黃益腎顆粒均能有效緩解腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死和脫落，并降低腎臟間質(zhì)纖維化程度。此外，纖維化關(guān)鍵指標(biāo)α-SMA 和Fn 的蛋白水平均在柴黃益腎顆粒干預(yù)后明顯下調(diào)。以上結(jié)果證實，柴黃益腎顆粒對慢性腎病腎臟損傷和纖維化具有明顯的治療作用，且高劑量組效果更佳。然而，其潛在的作用機(jī)制未明。

腎臟纖維化作為慢性腎病的關(guān)鍵病理變化，其在長期的演變過程中受到多種因素刺激和影響，其中炎癥就是慢性腎病腎臟中長期存在并誘導(dǎo)腎臟纖維化的重要因素[19]。為此，本研究采用ELISA法檢測柴黃益腎顆粒干預(yù)慢性腎病纖維化后腎臟組織中炎癥因子的濃度和表達(dá)，以及腎臟組織中關(guān)鍵炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的活性。結(jié)果表明，柴黃益腎顆?？擅黠@降低UUO 模型小鼠腎臟中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度，下調(diào)了這3個炎癥因子的mRNA表達(dá)水平，從基因表達(dá)到蛋白分泌均得到了有效的抑制。同時，Western Blot 結(jié)果證實柴黃益腎顆?？擅黠@抑制炎癥關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 蛋白的磷酸化水平，證明了柴黃益腎顆粒明顯的炎癥抑制作用，從而為腎纖維化的轉(zhuǎn)歸提供了穩(wěn)定的抗炎癥環(huán)境。

巨噬細(xì)胞作為一個關(guān)鍵的免疫炎癥響應(yīng)細(xì)胞，在多種疾病中具有促炎癥作用。其中巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)型C型凝集素Mincle是巨噬細(xì)胞上響應(yīng)炎癥刺激因素并激活炎癥的關(guān)鍵受體[20]。Mincle 與下游Syk/NF-κB形成炎癥響應(yīng)信號回路，促進(jìn)了急性腎損傷和慢性腎病的腎臟炎癥[13，21]。我們推測，柴黃益腎顆粒可能通過調(diào)控巨噬細(xì)胞Mincle，下調(diào)慢性腎病腎臟炎癥，進(jìn)而改善纖維化的形成。免疫熒光結(jié)果表明，Mincle在慢性腎病間質(zhì)中高表達(dá)，柴黃益腎顆粒干預(yù)后明顯下調(diào)了腎臟間質(zhì)中Mincle 的蛋白水平。Western Blot 結(jié)果也證實柴黃益腎顆?？上抡{(diào)UUO 誘導(dǎo)的Mincle 表達(dá)以及Syk磷酸化水平。進(jìn)一步的流式細(xì)胞實驗表明，F(xiàn)4/80 陽性的巨噬細(xì)胞中Mincle 的表達(dá)在柴黃益腎顆粒干預(yù)后明顯下調(diào)，且高劑量組效果較好，說明柴黃益腎顆?？擅黠@抑制巨噬細(xì)胞中的Mincle表達(dá)。為深入證明柴黃益腎顆粒是否可通過抑制巨噬細(xì)胞Mincle 的表達(dá)進(jìn)而下調(diào)炎癥改善纖維化，我們采用Mincle的激動劑TDB在體內(nèi)激活Mincle的表達(dá)，觀察激活Mincle 后柴黃益腎顆?？鼓I纖維化效果是否降低。病理結(jié)果表明，通過TDB 過表達(dá)Mincle后，柴黃益腎顆粒改善腎臟損傷和纖維化的作用被明顯減弱了，且纖維化相關(guān)指標(biāo)α-SMA和Fn的蛋白水平也在TDB作用后明顯上調(diào)，Mincle的下游信號Syk/NF-κB活性再度激活，腎臟中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的濃度也明顯增加。這些結(jié)果表明，激活的Mincle 表達(dá)可減弱柴黃益腎顆粒下調(diào)的慢性腎病腎臟炎癥和纖維化，證明柴黃益腎顆?？赏ㄟ^抑制巨噬細(xì)胞Mincle 調(diào)控的炎癥改善慢性腎病腎纖維化。

綜上所述，柴黃益腎顆粒能有效改善慢性腎病腎臟纖維化，并減輕炎癥反應(yīng)。其作用機(jī)制與下調(diào)腎臟巨噬細(xì)胞Mincle有關(guān)，其下游信號通路Syk/NF-κB的抑制可明顯降低慢性腎病炎癥以及纖維化的轉(zhuǎn)歸。本研究采用了單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)的腎臟纖維化模型，后續(xù)本研究組將采用更多的慢性腎病造模方法，在多種模型上進(jìn)行驗證。本研究有助于了解柴黃益腎顆粒對慢性腎病腎損傷和纖維化治療的潛在作用機(jī)制，為中藥干預(yù)慢性腎病炎癥與纖維化的轉(zhuǎn)歸研究拓展思路。