屈凌蕓 薛 蓉 宮靜雯 張瑋燁 季 徳 毛春芹 郭志俊 高 波 胡 雨 陸兔林

(1 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南京,210023; 2 華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司,深圳,518110; 3 安徽華潤(rùn)金蟾藥業(yè)股份有限公司,淮北,235000)

附子為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根加工品,具有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒止痛的功效[1]。附子有大毒,其毒性主要來(lái)自生物堿成分,黑順片為附子的主要炮制品,臨床應(yīng)用廣泛,其質(zhì)量?jī)?yōu)劣直接關(guān)聯(lián)臨床安全性與有效性,嚴(yán)格控制其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),對(duì)提高飲片質(zhì)量、保證其安全有效使用具有重要意義[2]。然而黑順片產(chǎn)地較多,炮制工藝步驟及其機(jī)制復(fù)雜,涉及毒效成分轉(zhuǎn)化,現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典》及各省市炮制規(guī)范未能全面反映其質(zhì)量?jī)?nèi)涵。

質(zhì)量標(biāo)志物(Quality Marker,Q-Marker)理論由劉昌孝院士于2016年提出[3],現(xiàn)已得到快速發(fā)展和完善,如從藥材-飲片-制劑進(jìn)行系統(tǒng)探索[4],從“性-效-物”三元關(guān)系和作用機(jī)制進(jìn)行研究[5],基于效-毒同時(shí)入手的Q-Marker研究策略等[6],黑順片毒性雖較附子已大幅降低,但其使用限量仍不明確,有產(chǎn)生不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn),Q-Marker的研究,有助于建立藥效-毒性-證候關(guān)聯(lián)性評(píng)價(jià),全面反映毒性中藥的生物效應(yīng)。指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別可對(duì)數(shù)據(jù)信息進(jìn)行矩陣式整合,描述藥材整體化學(xué)特征的同時(shí),反映質(zhì)量差異,可在一定程度上區(qū)分藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣,對(duì)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)理論,從基因、蛋白等不同水平對(duì)生物學(xué)事件進(jìn)行研究,其整體性與系統(tǒng)性特點(diǎn)和中醫(yī)藥整體觀思想不謀而合,可通過(guò)構(gòu)建藥物靶點(diǎn)之間相互作用的生物網(wǎng)絡(luò),快速預(yù)測(cè)中藥成分的潛在作用靶點(diǎn)和通路,并利用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證,為其機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)[8]。基于此,本研究收集大批量黑順片樣品,建立其化學(xué)成分的高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)指紋圖譜,結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別整體評(píng)價(jià)質(zhì)量,并進(jìn)一步結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),旨在為黑順片的質(zhì)量控制和后續(xù)開(kāi)發(fā)提供更為全面和可資借鑒的參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent Technologies 1200 Series全自動(dòng)高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司,美國(guó),貨號(hào):脫氣機(jī)G1322A;二元泵G1312B;自動(dòng)進(jìn)樣器G1367D;柱溫箱G1316B;檢測(cè)器G1315C);依利特SinoChrom ODS-BP色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)(大連依利特分析儀器有限公司,柱號(hào):E2020350);FA1104N型電子分析天平(上海菁海儀器有限公司,型號(hào):y201209056);KQ-500B型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司,貨號(hào):2018907000);DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司,貨號(hào):L-309435);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(南京科爾儀器設(shè)備有限公司,貨號(hào):1903023);循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司,貨號(hào):31931961586);TGL-16GB高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠,貨號(hào):75002445);Milli-Q Integral純水/超純水一體化系統(tǒng)(Millipore,美國(guó),貨號(hào):00071625)。

1.2 試藥 苯甲酰烏頭原堿(批號(hào):20092906,純度:98.75%)、苯甲酰新烏頭原堿(批號(hào):19062701,純度:99.36%)、苯甲酰次烏頭原堿(批號(hào):20091402,純度:98.23%)、烏頭堿(批號(hào):20092804,純度:98.46%)、新烏頭堿(批號(hào):20091403,純度:98.84%)、次烏頭堿(批號(hào):20062404,純度:97.50%),以上對(duì)照品均購(gòu)自南京金益柏生物科技有限公司;乙腈(Merck公司,德國(guó),批號(hào):JA108130)、四氫呋喃(TEDIA天地試劑公司,美國(guó),批號(hào):12100192)、甲醇(江蘇漢邦科技有限公司,批號(hào):212045),以上均為色譜純;氨水(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20140126)、異丙醇(上海申博化工有限公司,批號(hào):1606101)、乙酸乙酯(上海申博化工有限公司,批號(hào):1711101)、乙酸銨(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20181012)、乙酸(上海申博化工有限公司,批號(hào):1501101)、鹽酸(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20140220),以上均為分析純,水為純凈水。

1.3 分析樣品 本實(shí)驗(yàn)共收集25批不同產(chǎn)地的黑順片,由安徽華潤(rùn)金蟾藥業(yè)股份有限公司提供,由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根加工品。見(jiàn)表1。

表1 25批黑順片樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:依利特SinoChrom ODS-BP色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流動(dòng)相:流動(dòng)相A為乙腈-四氫呋喃(25∶15),流動(dòng)相B為0.1 mol/L醋酸銨溶液(每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL)。梯度洗脫程序:0～15 min,15%～20%B;15～20 min,20%～21%B;20～30 min,21%～25%B;30～45 min,25%～35%B;45～50 min,35%～15%B。柱溫:30 ℃。流速:1 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng):240 nm。進(jìn)樣量:10 μL。在該色譜條件下,各組分的分離度均>1.5,以苯甲酰新烏頭原堿計(jì)理論塔板數(shù)≥3 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿對(duì)照品適量,用0.05%鹽酸-甲醇溶解,配制成含烏頭堿2.593 μg/mL、新烏頭堿24.432 μg/mL、次烏頭堿18.738 μg/mL、苯甲酰新烏頭堿109.44 μg/mL、苯甲酰烏頭堿15.600 μg/mL、苯甲酰次烏頭堿12.552 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 分別取不同產(chǎn)地干燥黑順片適量,粉碎,過(guò)三號(hào)篩,取樣品約2 g,精密稱定,至具塞錐形瓶中,加氨試液3 mL浸潤(rùn),精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 mL,密塞,稱定重量,25 ℃以下水溫超聲處理30 min,放涼,再稱定重量,用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25 mL于圓底燒瓶中,35 ℃減壓回收溶劑至干,殘?jiān)芗尤?.05%鹽酸-甲醇溶液3 mL溶解,以離心力12 700×g,離心10 min,取上清液,即得。

2.4 參照峰的選擇 苯甲酰新烏頭原堿是黑順片的主要成分,在所建立的色譜條件下色譜峰分離度良好,峰面積適中,色譜保留時(shí)間穩(wěn)定,因此選擇其為參照峰,計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。

2.5 中間精密度試驗(yàn) 取黑順片粉末(S1)約2 g,精密稱定,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖。以苯甲酰新烏頭堿為參照峰,計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.09%,相對(duì)峰面積RSD均小于2.98%,表明儀器精密度良好。

2.6 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取黑順片粉末(S1)約2 g,精密稱定,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣分析,記錄色譜圖。以苯甲酰新烏頭堿為參照峰,計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.08%,相對(duì)峰面積RSD<4.90%,表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取黑順片粉末(S1)約2 g,精密稱定,共6份,按“2.3”項(xiàng)下方法,平行制備6份供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄色譜圖。以苯甲酰新烏頭堿為參照峰,計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation,RSD)均小于0.07%,相對(duì)峰面積RSD均小于3.40%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 耐用性試驗(yàn) 對(duì)上述色譜條件進(jìn)行耐用性考察,考察內(nèi)容包括Agilent 1200、Agilent 1260、島津LC-20ADXR 3種高效液相色譜儀和依利特SinoChrom ODS-BP、Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18、Hanbon Kromasil C183種色譜柱,在不同儀器和不同色譜柱上,均可重現(xiàn)出完整的圖譜,表明色譜條件耐用性良好。

2.9 樣品測(cè)定結(jié)果

2.9.1 指紋圖譜的建立 取25批不同產(chǎn)地的黑順片樣品,按“2.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次測(cè)定,記錄色譜圖。將25批黑順片樣品色譜圖結(jié)果以AIA格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012)”軟件,以S1為參照?qǐng)D譜,采用中位數(shù)法,進(jìn)行多點(diǎn)校正和特征峰匹配,獲得25批樣品的疊加圖譜并生成對(duì)照指紋圖譜,共標(biāo)定8個(gè)共有峰。見(jiàn)圖1。通過(guò)對(duì)照品比對(duì)指認(rèn)出6個(gè)共有峰,分別是苯甲酰新烏頭原堿(峰2)、苯甲酰烏頭原堿(峰3)、苯甲酰次烏頭原堿(峰4)、新烏頭堿(峰5)、次烏頭堿(峰6)、烏頭堿(峰7)。見(jiàn)圖2。

圖1 25批黑順片指紋圖譜

圖2 對(duì)照?qǐng)D譜(A)和混合對(duì)照品譜圖(B)

2.9.2 相似度評(píng)價(jià) 以生成的對(duì)照指紋圖譜為標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算25批黑順片樣品的相似度,25批黑順片樣品的相似度范圍是0.922～0.999,表明各產(chǎn)地黑順片的指紋圖譜相對(duì)穩(wěn)定。見(jiàn)表2。

表2 25批黑順片HPLC圖譜的相似度

2.9.3 聚類分析 以25批黑順片指紋圖譜中8個(gè)共有峰的峰面積作為描述樣品特征的變量,導(dǎo)入IBM SPSS Statistics軟件,采用組間連接法,利用歐式平方距離作為樣品的測(cè)度,進(jìn)行聚類分析。歐氏距離為10時(shí),樣品可聚為2類,來(lái)自陜西漢中的S4、來(lái)自四川江油的S10和來(lái)自云南麗江的S11聚為一類,其他樣品聚為一類,大部分來(lái)自四川,有少批來(lái)自云南麗江和陜西漢中。見(jiàn)圖3。

圖3 25批黑順片聚類分析

2.9.4 主成分分析 以25批黑順片指紋圖譜中8個(gè)共有峰的峰面積為變量,運(yùn)用IBM SPSS Statistics軟件,以特征值和累積貢獻(xiàn)率為依據(jù),進(jìn)行主成分因子分析,并計(jì)算綜合得分。以主成分特征值>1為提取標(biāo)準(zhǔn),得到2個(gè)主成分,主成分1特征值=4.263,方差貢獻(xiàn)率為53.285%,主成分2特征值=2.169,方差貢獻(xiàn)率為27.107%,累計(jì)貢獻(xiàn)率為80.392%,表明這2個(gè)主成分可反映出黑順片指紋圖譜8個(gè)共有峰的大部分信息。由旋轉(zhuǎn)后成分矩陣可知,主成分1信息主要來(lái)自共有峰1、2、3、4、8,主成分2信息主要來(lái)自共有峰5、6、7。以主成分對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重系數(shù)計(jì)算綜合得分,并進(jìn)行降序排列,S4、S11、S10得分顯著高于其他批次樣品,與聚類分析結(jié)果一致。見(jiàn)表3。

表3 綜合得分

2.10 基于成分-靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)分析

2.10.1 成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 指紋圖譜指認(rèn)出烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿6種成分,已有研究表明,以上生物堿成分為附子特有成分,存在于由附子至黑順片的炮制全過(guò)程中,且涉及一定的相互轉(zhuǎn)化,對(duì)黑順片的安全性和有效性至關(guān)重要,具有有效、特有、傳遞與溯源、可測(cè)和處方配伍的“五要素”,因此,以該6種成分作為候選Q-Marker,通過(guò)PubChem Compound數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)進(jìn)行搜索,將得到的化合物SMILES式輸入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(https://new.swisstargetprediction.ch/)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè),刪除重復(fù)靶點(diǎn),最終得到與6種化合物相關(guān)的靶點(diǎn)38個(gè)。

2.10.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選出的38個(gè)靶點(diǎn),導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/cgi/input.pl)進(jìn)行分析,選擇物種為“Homo sapiens”,combined score選擇默認(rèn)閾值0.4,獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。共獲得38個(gè)節(jié)點(diǎn),60條邊。將網(wǎng)絡(luò)圖信息導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件,利用“Network Analyzer”功能對(duì)其進(jìn)行可視化處理。圖中顏色越深、形狀越大的節(jié)點(diǎn)代表其度值(Degree)越大,意味著這個(gè)節(jié)點(diǎn)的度中心性越高,該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中就越重要,在整體中處于核心地位,CHRNA7、CHRM1、PIK3CG、SLC6A3等靶點(diǎn)基因可能在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。見(jiàn)圖4～5。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 核心靶點(diǎn)排序

2.10.3 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)對(duì)篩選出的靶點(diǎn),進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集分析共得到97個(gè)生物過(guò)程(Biological Process,BP)條目,28個(gè)細(xì)胞組分(Cell Components,CC)條目,34個(gè)分子功能(Molecular Function,MF)條目,設(shè)置P<0.05,FDR<0.05,共篩出22個(gè)BP、19個(gè)CC、20個(gè)MF,富集到GO本體功能上的靶點(diǎn)數(shù)最小為2,選取排名前10的條目進(jìn)行繪圖分析。見(jiàn)圖6。在BP層面上,這些靶點(diǎn)參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal Transduction)、化學(xué)突觸傳遞(Chemical Synaptic Transmission)、藥物反應(yīng)(Response to Drug)等生物過(guò)程。在CC層面上,主要涉及了質(zhì)膜(Plasma Membrane)、膜的整體成分(Integral Component of Membrane)、突觸(Synapse)等。在MF層面上,主要存在相同蛋白結(jié)合(Identical Protein Binding)、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性(Neurotransmitter Receptor Activity)、激酶活性(Kinase Activity)、G蛋白偶聯(lián)5-羥色胺受體活性(G-Protein Coupled Serotonin Receptor Activity)等。KEGG PATHWAY富集分析共得到99條通路,以P<0.05,FDR<0.05為篩選條件,共篩選出80條,其中富集到KEGG通路上靶點(diǎn)數(shù)最少為3,選取排名前20的通路進(jìn)行繪圖分析。見(jiàn)圖7。圖中顏色越深的點(diǎn)代表其富集程度越顯著,膽堿能突觸信號(hào)通路(Cholinergic Synapse)、阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease,AD)信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路(Calcium Signaling Pathway)、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B通路(Phosphatidylinositol-3-Kinase-Protein Kinase B Pathway,PI3K/PKB Pathway)、癌癥中心碳代謝(Central Carbon Metabolism in Cancer)為較為重要的幾條,此外還涉及急性髓細(xì)胞白血病(Acute Myeloid Leukemia)的發(fā)生、瞬時(shí)受體電位通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)(Inflammatory Mediator Regulation of TRP Channels)。表明這38個(gè)靶點(diǎn)主要通過(guò)調(diào)控這些通路發(fā)揮干預(yù)疾病的作用。

圖6 GO富集分析

圖7 KEGG富集分析

2.10.4 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)篩選出的6個(gè)成分、38個(gè)靶點(diǎn)和排名靠前的20條通路,運(yùn)用Cytoscape 3.9.1軟件,構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。見(jiàn)圖8。以化合物、靶點(diǎn)蛋白、信號(hào)通路的度值(Degree)為參考,次烏頭堿有最高的連接度(Degree=37)、烏頭堿次之(Degree=20)、其他4個(gè)成分連接度相近,均≥10,提示6種成分均可能是黑順片發(fā)揮藥效的活性物質(zhì);靶點(diǎn)PIK3CA(Degree=20)、PIK3CB(Degree=18)、PIK3CD(Degree=18)、MTOR(Degree=16)與各信號(hào)通路連接度較高,可能是作用于代謝途徑、阿爾茨海默病信號(hào)通路、癌癥通路、鈣離子信號(hào)通路、PI3K/PKB信號(hào)通路等的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖8 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

2.10.5 分子對(duì)接驗(yàn)證 利用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)及UniProt(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索蛋白結(jié)構(gòu),設(shè)置篩選條件,選取物種為“Homo sapiens”,構(gòu)象分辨率盡量≤2.5 A,序列盡量完整且復(fù)合體中有小分子配體信息。篩選出蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的PDB ID分別為PIK3CA(6I1S)、PIK3CD(6PYR)、MTOR(4DRI),PIK3B于UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得。運(yùn)用Auto Dock軟件,將篩選出的6個(gè)成分與4個(gè)度值最高的靶點(diǎn)依次進(jìn)行分子對(duì)接,同時(shí)以相應(yīng)靶蛋白的陽(yáng)性藥進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證,并將結(jié)果導(dǎo)入PyMOL繪圖軟件繪制結(jié)合模式。對(duì)接打分值代表受體與配體之間親和力,其值越小,則結(jié)合越容易。結(jié)果顯示,6個(gè)成分與4個(gè)核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均<-7 kJ/mol(1 cal=4.184 J),且與PIK3CB、PIK3CD的結(jié)合能均小于陽(yáng)性藥，與另外2個(gè)靶點(diǎn)的結(jié)合能與陽(yáng)性藥相近，說(shuō)明6種成分與4個(gè)核心靶點(diǎn)間均具有較好的結(jié)合活性，可自發(fā)結(jié)合。見(jiàn)圖9。

圖9 部分分子對(duì)接示意圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)附子項(xiàng)下色譜條件為基礎(chǔ),結(jié)合大量文獻(xiàn)[9-14]對(duì)其流動(dòng)相、洗脫梯度、提取溶劑、掃描波長(zhǎng)、柱溫等進(jìn)行優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)最佳pH值約為5.8,可有效分離各生物堿成分;240 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下基線更為平滑穩(wěn)定;異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)為提取溶劑,0.05%鹽酸-甲醇溶液為復(fù)溶劑時(shí),譜圖背景更干凈,且分離度良好,峰形對(duì)稱尖銳。

指紋圖譜的相似度結(jié)果顯示,大部分黑順片的指紋圖譜具有良好的一致性,說(shuō)明樣品質(zhì)量較為穩(wěn)定。聚類分析和主成分分析結(jié)果顯示,樣品S4、S10、S11可聚為一類,主成分分析中綜合得分和散點(diǎn)圖也將這3批樣品與其他樣品較好地分開(kāi),結(jié)果一致。四川是附子的道地產(chǎn)區(qū),云南、陜西也為附子主產(chǎn)地,這3批樣品分別來(lái)自3個(gè)產(chǎn)地,共有峰峰面積之和均顯著高于同產(chǎn)地的樣品,主要由苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿造成,推測(cè)由地域差異、炮制加工過(guò)程的不同等導(dǎo)致。附子炮制過(guò)程步驟繁多,尤其在蒸、煮環(huán)節(jié),是影響生物堿轉(zhuǎn)化與含量的關(guān)鍵步驟,2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》記載了黑順片的炮制流程,但并未明確規(guī)定各環(huán)節(jié)參數(shù),可能是造成產(chǎn)地相同的黑順片也存在較大差異的主要原因[15]。

目前尚無(wú)附子或黑順片質(zhì)量標(biāo)志物的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,僅有對(duì)真武湯、參附方等含附子的復(fù)方的質(zhì)量標(biāo)志物研究,其中,苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、次烏頭堿、烏頭堿、新烏頭堿均可作為質(zhì)量標(biāo)志物[16-17]。本實(shí)驗(yàn)基于指紋圖譜指認(rèn)成分,進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,建立“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖,根據(jù)度值大小,預(yù)測(cè)次烏頭堿等6種成分可能是黑順片發(fā)揮作用的主要活性物質(zhì),通過(guò)代謝途徑、鈣離子信號(hào)通路、PI3K-Art信號(hào)通路、腫瘤通路等多條通路,作用于PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、mTOR等關(guān)鍵靶點(diǎn)干預(yù)疾病,分子對(duì)接驗(yàn)證了這一結(jié)果。現(xiàn)代藥理研究表明,黑順片具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保護(hù)心血管、免疫調(diào)節(jié)的作用[18],而PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、MTOR等關(guān)鍵靶點(diǎn),癌癥通路、鈣離子信號(hào)通路、PI3K/PKB信號(hào)通路等關(guān)鍵通路,恰好在腫瘤發(fā)生與發(fā)展、抗炎、心臟功能調(diào)節(jié)、細(xì)胞糖代謝中起著重要作用[19-21],佐證了6種成分作為質(zhì)量標(biāo)志物的合理性。例如次烏頭堿可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1,抑制肺癌細(xì)胞A549的黏附、遷移和侵襲能力[22];通過(guò)抑制細(xì)胞高遷移率族蛋白B1的分泌和釋放,對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)皮損傷[23]。烏頭堿可通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24];通過(guò)ROS/JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)人骨肉瘤143B細(xì)胞發(fā)生凋亡[25];抑制核因子κB激酶亞基B、IκBα的磷酸化,從而抑制核因子κB信號(hào)通路活化,治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[26];還可通過(guò)激活SIRT3分子使其發(fā)揮去乙酰化作用,改善線粒體功能,調(diào)節(jié)能量代謝,保護(hù)心肌組織[27]。

然而,度值較高的2種生物堿均為毒性較大的雙酯型生物堿,在發(fā)揮療效時(shí),也可能造成嚴(yán)重的中毒反應(yīng),如適宜濃度的次烏頭堿對(duì)H2O2所致的心肌細(xì)胞凋亡有明顯的改善作用[28],用量過(guò)多則可能引起心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+升高和Cx43表達(dá)下降,誘發(fā)心律失常,或引起心肌細(xì)胞死亡[29-30]。不同的生物堿針對(duì)同一疾病也可能發(fā)揮截然相反的作用,如烏頭堿可抑制黑色素瘤B16細(xì)胞的生長(zhǎng)從而發(fā)揮抗癌作用[31],次烏頭堿則會(huì)通過(guò)瞬時(shí)電位受體香草素4介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流激活ROCK/MLC2信號(hào)軸,使黑色素瘤向遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[32]。

綜上所述,6種生物堿的含量范圍是黑順片質(zhì)量?jī)?yōu)劣的關(guān)鍵所在,如何避免減毒過(guò)度致藥效不佳,或炮制不及造成不良反應(yīng),可通過(guò)炮制工藝與生物評(píng)價(jià)相結(jié)合,研究關(guān)鍵步驟的量-毒-效關(guān)系與成分轉(zhuǎn)化機(jī)制,與實(shí)際病癥相結(jié)合,進(jìn)一步闡明黑順片安全性與有效性的科學(xué)內(nèi)涵。

利益沖突聲明:無(wú)。