王 芬 何華亮 劉銅華 吳麗麗

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,北京,100029; 2 中國人民解放軍武裝警察部隊北京總隊醫(yī)院,北京,100027; 3 北京中醫(yī)藥大學(xué)教育部中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)重點實驗室,北京,100029)

目前,2型糖尿病已成為世界范圍所面臨的嚴重的公共衛(wèi)生問題。據(jù)統(tǒng)計全球糖尿病的醫(yī)療成本已達人均醫(yī)療保健支出的3.2倍,而糖尿病并發(fā)癥的醫(yī)療成本已增加9.4倍[1]。國際糖尿病聯(lián)盟預(yù)計,2015年全球糖尿病患病率達4.15億,到2040年將增至6.42億人[2]。眾所周知,肥胖及超重與2型糖尿病發(fā)病密切相關(guān),因其數(shù)量的快速增長,已成為代謝性疾病風(fēng)險更高的預(yù)測因子[3-4]。現(xiàn)已公認,機體的慢性炎癥反應(yīng)參與了有關(guān)肥胖及胰島素抵抗的一系列病理過程,也是2型糖尿病的發(fā)病機制之一[5]。故有人呼吁將抗炎劑納入2型糖尿病的治療方案中[6]。為此,加強炎癥通路靶點的研究具有重大的現(xiàn)實意義。

中藥復(fù)方糖耐康是治療2型糖尿病的經(jīng)驗方,是以辨證論治為基礎(chǔ)并結(jié)合多年臨床經(jīng)驗及藥理研究成果組方而成。前期研究結(jié)果顯示,該方具有能夠改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)糖脂代謝、調(diào)節(jié)腸道菌群等的作用[7]。為進一步探究其作用機制,本研究選取與腸道菌群密切相關(guān)的脂多糖介導(dǎo)的Toll樣受體通路中部分炎癥介質(zhì)作為觀察指標(biāo),現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 10周齡無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級雄性KKAy小鼠65只,雄性C57BL/6J小鼠13只[北京華阜康生物科技有限股份公司,許可證號:SCXK(京)2014-0004],體質(zhì)量(35.5±3.0)g。在SPF級條件下,飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實驗動物中心。飼養(yǎng)條件:溫度(21±2)℃,濕度(60±10)%,12 h/12 h光照黑暗循環(huán)。合格證號:SYXK(京)2016-0021。符合實驗動物倫理委員會相關(guān)指導(dǎo)原則,由動物實驗倫理會審查批準(倫理審批號:2019-067)。普通飼料及高脂飼料(豬油10%、蛋黃粉10%、普通飼料80%)均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

1.1.2 藥物 中藥糖耐康顆粒由北京海德潤制藥有限公司制備。由人參、女貞子、夏枯草、三白草、番石榴葉,按1∶4∶2∶4∶2比例組成。3 g/袋,1 g顆粒相當(dāng)于生藥3.61 g。實驗前用蒸餾水配制,超聲30 min后4 ℃保存。阿卡波糖片(德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司,批號:BJ51061)。

1.1.3 試劑與儀器 IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司,批號:L150715400)。Formamide去離子甲酰胺(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司,批號:37B00160)、核酸染料(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司,批號:54D00150)、2×Taq PCR GreenMix(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司,批號:55H001200)。蛋白質(zhì)分子量Marker(Bio-rad,美國,批號:310007919),聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜(Millipore,德國,批號:K1EA1531FK)、磷酸化蛋白酶抑制劑(Roche公司,瑞典,批號:19987800),TLR4兔來源的多克隆抗體(Abcam公司,美國,批號:GR3218684-1),IKK兔來源的單克隆抗體(Abcam公司,美國,批號:GR3218250-2),GAPDH小鼠來源的單克隆抗體(Abcam公司,美國,批號:GR232949-14)。

紫外分光光度計(Eppendorf公司,德國,型號:Biophotometer),微量加樣器(Eppendorf公司,德國,型號:Eppendorf Research plus),生物分析儀(Agilent Technologies,Palo Alto,美國,型號:Agilent 2100),熒光定量儀(Invitrogen,Carlsbad,加拿大,型號:Qubit 2.0 Fluorometer),高通量測序儀(Illumina公司,美國,型號:HiSeq 2500型),高通量測序儀(Illumina公司,美國,型號:Illumina MiSeq),超凈工作臺(東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司,型號:DL-CJ-2NDI型),電子天平(Sartouris公司,德國,型號:BS224S型),垂直電泳槽(Bio-Rad公司,美國,型號:MP3型)、高速低溫離心機(Bio-Rad公司,美國,型號:3K15型),半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)印儀(Bio-Rad公司,美國,型號:TransBlot SD型),穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(Bio-Rad公司,美國,型號:Powerpac HQ型),梯度PCR儀(Bio-Rad公司,美國,型號:T100型)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周,以雄性C57B/6J小鼠設(shè)為正常組,喂養(yǎng)普通飼料;高脂飼料喂養(yǎng)雄性KKAy小鼠2周,以隨機平均血糖≥13.9 mmol/L,設(shè)為成模小鼠,共65只。設(shè)C57B/6J小鼠13只為正常組,KKAy小鼠按體質(zhì)量及血糖隨機分為5組,包括阿卡波糖組、糖耐康高劑量組、糖耐康中劑量組、糖耐康低劑量組、模型組,每組13只。

1.2.2 給藥方法 給藥劑量:阿卡波糖組按3.9 mg/kg,糖耐康高劑量組、糖耐康中劑量組、糖耐康低劑量組分別按4.68、2.34、1.17 g/kg,模型組按生理鹽水20 mL/kg。給藥組均按0.01 mL/g的體質(zhì)量標(biāo)準灌胃給藥1次,正常組和模型組給予等同劑量的生理鹽水灌胃1次,連續(xù)8周。過程中,中劑量組及模型組各死亡3只。喂養(yǎng)過程中,每周監(jiān)測小鼠血糖和體質(zhì)量,小鼠均自由取食、飲水。8周后,末次給藥后禁食不禁水12 h,于眶靜脈取血,分離血清備用。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 血糖及體質(zhì)量檢測 給藥期間,于第0、4、8周,禁食6 h后,血糖檢測以血糖儀尾靜脈取血進行;每周同一時間測量體質(zhì)量并記錄。

1.2.3.2 半定量酶聯(lián)免疫吸附試驗法及蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測 半定量酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測血漿中白細胞介素6(Interleukin,IL-6)及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(Glucose Transporter4,GluT4)的水平。各項操作均嚴格按照說明書操作。

2018年6月11日稗草1-3葉期，將4%氟嘧啶草醚+2.5%五氟磺草胺可分散油懸浮劑100毫升/畝。甩施，施藥后保持水層3-5厘米7天以上，田間管理同一般生產(chǎn)田。

蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測肝組織、肌肉組織中Toll樣受體4(Toll-likeReceptor4,TLR4)及核因子κB激酶β抑制物(Inhibitor of NF-kappaB Kinase Beta,IKKβ)水平。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳:上樣量約40 μg,90 V 45 min濃縮,150 V 80 min電泳分離。轉(zhuǎn)膜:按照海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿依次順序裝好轉(zhuǎn)膜裝置120 V、150 mA轉(zhuǎn)膜60 min。封閉:15 mL Blocking buffer TTBS 37 ℃輕搖1 h。加TLR4一抗(1∶1 000)、IKKβ一抗(1∶1 000),GAPDH為內(nèi)參(1∶5 000)。4 ℃孵育過夜,洗膜,加二抗,TLR4二抗(1∶2 000)、IKKβ二抗(1∶2 000),GAPDH為內(nèi)參(1∶3 000)。增強化學(xué)發(fā)光,Storm掃描,對掃描圖像測特異蛋白條帶的灰度值。以β-actin為內(nèi)參照,每個樣品重復(fù)測量3次。

2 結(jié)果

2.1 糖耐康對KKAy小鼠空腹血糖和體質(zhì)量的影響 與治療前比較,各給藥組血糖有明顯下降;與模型組比較,糖耐康高劑量組、阿卡波糖組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);除正常組外,各組體質(zhì)量均有不同程度上升,與模型組比較,各給藥組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組KKAy小鼠空腹血糖和體質(zhì)量比較

2.2 糖耐康對KKAy小鼠IL-6、TLR4、IKKβ水平的影響 與模型組IL-6比較,阿卡波糖組和糖耐康高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與正常組比較,模型組GluT4水平明顯下降(P<0.05);與模型組比較,糖耐康高劑量組與阿卡波糖組均能夠明顯上調(diào)GluT4水平(P<0.01)。見表2。

表2 各組KKAy小鼠IL-6、GluT4水平比較

2.3 糖耐康對KKAy小鼠TLR4、IKKβ水平的影響 與正常組比較,模型組TLR4、IKKβ水平顯著升高(P<0.01);與模型組比較,糖耐康高劑量組與阿卡波糖組能夠顯著下調(diào)TLR4、IKKβ水平(P<0.01)。見表3,圖1～2。

圖1 糖耐康對肝組織TLR4蛋白表達的影響

圖2 糖耐康對肌肉組織IKKβ蛋白表達的影響

表3 各組KKAy小鼠TLR4、IKKβ水平比較

3 討論

因肥胖導(dǎo)致腸道微生物群失調(diào),致細菌及其產(chǎn)物如脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)泄漏到脂肪組織,能夠激活脂肪細胞中的TLR,其中,TLR4作為細胞膜表面受體,能夠誘發(fā)機體產(chǎn)生各種細胞因子,尤其是炎癥介質(zhì)和相關(guān)酶類等[8-10]。已知經(jīng)典的TLR4通路主要參與LPS的識別和轉(zhuǎn)導(dǎo)[11-12],LPS在機體內(nèi)通過活化TLR4,降解IKB,來解除對核因子κB的抑制,而后進入核內(nèi)促進炎癥介質(zhì)包括TNF-α、IL-6等的轉(zhuǎn)錄,進一步促進核因子κB的活化,形成局部炎癥擴大的級聯(lián)效應(yīng)[13]。各種細胞因子和促炎趨化因子,一旦被激活,就會加劇炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,從而激活應(yīng)激激酶,有效地阻止胰島素受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并引起胰島素抵抗[14-15]。因此,調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì),可恢復(fù)胰島素的敏感性和改善異常血糖[16]。鑒于各種脂肪因子、細胞因子和趨化因子對疾病進展的影響,可將2型糖尿病視為一種自身炎癥性疾病,盡管它是由代謝失調(diào)引起的[17]。另外,GluT4是葡萄糖轉(zhuǎn)運體家族的成員之一,能夠轉(zhuǎn)移并定位在細胞膜上,促進葡萄糖的吸收,故在骨骼肌的葡萄糖轉(zhuǎn)運和代謝過程中發(fā)揮了重要作用[18]。胰島素抵抗時,因GluT4的轉(zhuǎn)位受阻,可影響糖脂代謝[19-20]。具體表現(xiàn)可見GluT4的易位受阻、表達減少,及含GluT4的囊泡不能與細胞膜融合,或者已融合但其活性降低等[21],這些都是胰島素抵抗的中心環(huán)節(jié)[22]。因此,上調(diào)GluT4的活性及轉(zhuǎn)位也是增強胰島素敏感性和改善骨骼肌代謝的有效途徑之一。

綜上所述,中藥糖耐康能夠明確改善2型糖尿病小鼠的血糖水平。在體質(zhì)量方面,KKAy小鼠組體質(zhì)量均有不同程度上升,考慮與其高脂飼料喂養(yǎng)有關(guān)。而與模型組比較,各給藥組具有明顯抑制體質(zhì)量增長的趨勢。對于IL-6水平,與模型組比較,阿卡波糖組與糖耐康高劑量組均具有明確的下調(diào)作用,其余給藥組有一定的下調(diào)趨勢。對于GluT4水平,與模型組比較,阿卡波糖組與糖耐康高劑量組具有明確的上調(diào)作用。對于TLR4及IKKβ水平,與模型組比較,各給藥組均有下調(diào)趨勢,其中糖耐康高劑量組及阿卡波糖組最為顯著。

糖耐康是由夏枯草、番石榴葉、三白草、女貞子及人參5味藥組成。方中君藥夏枯草,清肝火散郁結(jié)。主要針對消渴病熱盛內(nèi)郁的病機。番石榴葉、三白草為臣藥,番石榴葉能夠甘平養(yǎng)胃,生津止渴,斂澀固陰。早在1975年廣西醫(yī)學(xué)院糖尿病課題組就發(fā)現(xiàn)其有確切降糖作用,藥理研究已證實它能夠改善糖尿病胰島素抵抗。三白草清熱解毒、利水消腫。方中君、臣藥主要針對消渴病燥熱內(nèi)盛的病理基礎(chǔ)。佐藥人參、女貞子益氣養(yǎng)陰、生津止渴,針對氣陰虧虛的病理基礎(chǔ)。全方共湊清熱生津、益氣養(yǎng)陰之效。是在辨證論治與專藥專方相結(jié)合的基礎(chǔ)上,正對糖尿病及前期——胰島素抵抗的主要病機特征。

KKAy小鼠是自發(fā)性2型糖尿病動物模型,因其具有與人類糖尿病類似的遺傳特征及發(fā)病過程,個體差異性較小[23],成模穩(wěn)定,已在實踐過程中得到較好的論證,是研究該疾病理想的動物模型。

本研究結(jié)果證實,中藥糖耐康不僅能夠降低2型糖尿病小鼠的體質(zhì)量趨勢及血糖水平,而且能夠下調(diào)炎癥介質(zhì)IL-6及上調(diào)胰島素受體后通路中GluT4的水平,下調(diào)肝臟、肌肉組織中TLR4及IKKβ蛋白表達。說明其可能通過調(diào)節(jié)LPS介導(dǎo)的TLR4通路中關(guān)鍵炎癥介質(zhì)的水平,減輕炎癥反應(yīng),在一定程度上抑制炎癥級聯(lián)效應(yīng),從而減輕胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。當(dāng)然,腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變也參與其中。該結(jié)論為進一步加強中醫(yī)藥防治糖尿作用機制的研究提供理論依據(jù)。

利益沖突聲明:無。