王雪菱，王如月，李際紅，王錦楠，王冬月，牛牧歌，孫茂桐

（山東農業(yè)大學林學院/山東泰山森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站/黃河下游森林培育國家林業(yè)和草原局重點實驗室，山東泰安 271018）

0 引言

植物激素是植物體自身合成的一類微量有機物，在植物生長的各個階段起著重要作用。植物激素主要包括生長素、細胞分裂素、脫落酸、赤霉素、乙烯、獨腳金內酯等[1-2]。獨腳金內酯最初在寄生植物獨腳金屬的種子中發(fā)現并由此得名[3]。獨腳金內酯能促進種子萌發(fā)，刺激叢枝菌根真菌與寄主植物根的共生，抑制植物分枝，于2008年被鑒定為一種新的植物激素[4-6]。

在水稻、擬南芥等模式植物里，對獨角金內酯生物合成和信號轉導的機制研究已較為透徹[7-10]，在營養(yǎng)條件有限的情況下，植物根中合成的獨腳金內酯能促進根毛和側根生長，進而增加根部的營養(yǎng)物質吸收，同時獨腳金內酯被運輸到地上的部分可抑制側芽或分枝的形成，從而降低植物對營養(yǎng)物質的需求[11-12]。隨著在不同植物對獨腳金內酯突變體的研究，其信號轉導途徑逐漸變得清晰。其中，負責獨腳金內酯信號傳導的蛋白大體分為3 類：α/β折疊型水解酶DWARF14(D14)/DECREASED APICAL DOMINANCE2(DAD2)/RAMOSUS3(RMS3)，富亮氨酸重復序列F-box 蛋白DWARF3(D3)/MORE AXILLARY GROWTH2(MAX2)以及Clp 蛋白酶家族DWARF53(D53)/SUPPRESSOR OF MORE AXILLARY GROWTH2 LIKE I(SMXLs)[13-15]。在獨腳金內酯信號轉導過程中，D14和D3可以形成SCF復合體，SCF形成的開放小室可用來容納獨腳金內酯分子，并將其水解成共價連接的中間分子CLIM(Covalently Linked Inter Mediate Molecule)，促進D53/SMXLs的Clp蛋白酶家族降解，從而調節(jié)植物的分枝[16-18]。Clp 蛋白酶家族的D53/SMXLs 蛋白作為獨腳金內酯信號轉導復合體的重要成員，在獨角金內酯信號轉導過程中發(fā)揮著重要的作用。

1 D53/SMXLs的發(fā)現

水稻獨腳金內酯信號轉導相關的基因已被廣泛研究，而對水稻分枝的研究主要來源于兩種類型的突變體，即moc1突變體和Dwarf系列突變體[19-20]。2013 年李家洋和萬建民團隊同時發(fā)現了水稻的短莖顯性突變體Dwarf53(d53)，該突變體表現出矮化多分蘗。對該突變體進一步研究表明，這是由于D53/SMXLs基因發(fā)生顯性突變，突變后的蛋白不能被獨腳金內酯類似物GR24 降解，因此導致該表型的出現。由此人們推論D53/SMXLs是參與獨腳金內酯信號傳導的關鍵基因[7-8]。隨著基因組測序技術的不斷發(fā)展，人們發(fā)現大部分植物都含有D53基因家族，擬南芥(Arabidopsis thaliana)有3 個同源基因，水稻(Oryza sativa L.)中有2個，玉米(Zea maysL.)中有1 個，楊樹(Populus)中有3個，豌豆(Pisum sativumL.)中有3個[7,21-23]。隨著研究的不斷深入，D53基因被認為是一種參與獨腳金內酯信號轉導和調控植物分枝發(fā)育的抑制因子[7-8]。

2 D53/SMXLs的結構

D53/SMXLs 及其同源物與Clp 雙AAA 結構域域腺苷三磷酸酶(ATPase)家族成員具有相似的二級結構，他們都參與蛋白質分解和蛋白質重塑并具備保守序列[7-8]。AAA 蛋白的功能特征是依賴三磷酸腺苷(ATP)的蛋白質分解和蛋白質復合物組裝和分解活動，其中底物通過穿過中心孔從聚集體或復合物中分離出來[24-25]。許多AAA蛋白以DNA/蛋白復合物作為底物，具有轉錄抑制功能的雙AAA 蛋白可直接或間接地與轉錄因子相互作用[26]。D53蛋白結構上含有EAR-2和EAR-3 保守結構，EAR-2 由結合典型TPD 結合位點1的c端LxLxL基序和結合之前未識別的TPD結合位點2 的n 端DNLIYLDL 基序組成[27]。進一步研究表明，這兩個基序都參與抑制獨腳金內酯信號，但EAR-2可能對分蘗數更重要，而EAR-3可能對株高更重要。擬南芥SMXL7 保守的c 端EAR 基序的突變也導致了獨腳金內酯信號的部分缺失。EAR-2 可與TPD 蛋白溝結合抑制生長素和茉莉酸信號，或與TPD第二位點結合介導TPD 四聚體相互作用[7-8,27]。對水稻的研究表明，2個TPD結合位點的功能是相關的，證明EAR-2結合誘導TPD寡聚，此外，TPD可直接與組蛋白H3和H4以及核小體結合，TPD 的高水平組裝與D53 的EAR-2結構結合，使TPD復合核小體之間的相互作用更加穩(wěn)定[27]。如圖1所示。

3 D53/SMXLs功能

3.1 D53/SMXLs在獨腳金內酯信號傳導中的作用

研究表明，D53/SMXLs基因的主要功能是抑制獨角金內酯信號轉導[8]。當獨腳金內酯濃度足以激活獨角金內酯信號通路時，D14 蛋白將獨腳金內酯識別并水解為活性分子，D14 蛋白招募SCF(ASK1-CULLINF-BOX)復合體并與D3蛋白結合進一步形成SCFD14復合體，D3蛋白特異性識別并結合獨腳金內酯信號抑制因子D53/SMXLs，形成D53-D14-SCFD3蛋白復合體，D53/SMXLs通過泛素結合酶E2的泛素化修飾，并最終被26S 蛋白酶體降解，誘導下游靶基因的表達[7-8,28]（如圖2）。LIU[21]的最新研究表明，水稻OsD53的同源基因ZmD53在玉米中通過獨腳金內酯信號傳導與ZmD14A 和ZmD14B 相互作用，從而影響下游基因的表達。

圖2 獨腳金內酯促進D14-SCFD3介導的D53/SMXLs降解的示意圖模型

而在雙子葉植物中，D53/SMXLs基因在獨腳金內酯信號轉導通路中發(fā)揮著同樣的作用。擬南芥SMXL6、SMXL7和SMXL8作為抑制因子可調控葉片形態(tài)和植物分枝[9]。SMXL6/7/8作為MAX2(D3)下游的基因，經過泛素化過程后，通過26S 蛋白復合酶體將SMXL6/7/8降解，使獨腳金內酯抑制腋芽萌發(fā)，而當獨腳金內酯不存在時，則不會形成泛素化蛋白復合體，SMXL6/7/8可與TPL/TPR相結合，從而抑制獨腳金內酯的下游基因（如BES1和SPL9/15蛋白）的轉錄，進而調控腋芽發(fā)育[29]。在豌豆中，D53/SMXLs基因家族共包含3個成員，分別為PsSMXL6、PsSMXL7和PsSMXL8，PsSMXL7作用于RMS3(D14)和RMS4(D3)的下游[23]。

楊樹作為木本植物的模式植物，關于D53/SMXLs基因也有相關研究報道。楊樹的PagD53基因在腋芽和相關節(jié)點中表達量較高[22]。進一步研究表明，PagD53含有ClpB以及ClpA蛋白家族結構域，受體蛋白PagD14和PagD53可相互作用，PagD53蛋白通過獨腳金內酯的信號傳遞調節(jié)植物分枝發(fā)育[30]。然而PagD53在楊樹中的下游作用基因，以及其引起的獨腳金內酯在內的各種激素如生長素、細胞分裂素、赤霉素等的含量變化尚未明朗[30]。

已有研究表明，D53/SMXLs基因作為獨腳金內酯信號轉導的抑制因子，還可以此通路來調控其他激素。李家洋團隊發(fā)現，D53/SMXLs基因通過誘導獨腳金內酯進而拮抗細胞分裂素，降解OsCKX9酶基因的轉錄，促進細胞分裂素的積累[31]。近期的研究發(fā)現SMXL6,7,8 的EAR 基序抑制BRC1表達，降低脫落酸的含量[32]。其中，BRC1是抑制腋芽伸長的重要轉錄因子，它可使靶基因HB40表達，促進脫落酸的合成，進而減少植物分枝；而SMXL6的EAR基序可抑制BRC1基因表達，進而抑制脫落酸的合成，促進植物分枝[33]。當添加GR244DO激素時，可使SMXL6降解，從而釋放BRC1，激活HB40的表達，提高脫落酸含量，抑制植物分枝[33]。

豌豆有PSAFB4/5 依賴的根尖反饋信號，該信號上調獨腳金內酯生物合成基因的轉錄豐度[34]，并受到獨腳金內酯感知的負調控[35-36]，這個依賴于RMS 的信號被提議為IAA[37]。Psafb4/5-1是生長素受體家族成員中的一個突變體[38]。Dun等[36,39]發(fā)現與野生型相比，Psafb4/5-1主要在植物的上部節(jié)點有所降低，Pssmxl7-1突變幾乎完全恢復了Psafb4/5-1的莖分枝和高度，這表明Psafb4/5-1表型依賴于SMXL7，由此得出獨腳金內酯通過PsSMXL7抑制IAA水平。

綜上所述，單子葉和雙子葉植物中D53/SMXLs基因在獨腳金內酯信號轉導通路中發(fā)揮著同樣的作用，此外D53/SMXLs基因通過獨腳金內酯信號傳導調控ABA和IAA等激素，進而影響植物發(fā)育；在木本植物中D53/SMXLs基因在獨腳金內酯信號轉導通路的研究較少，其通過獨腳金內酯影響其他激素調控尚未報道。

3.2 D53/SMXLs在分枝發(fā)育中的功能

D53/SMXLs基因作為獨角金內酯信號轉導通路的抑制因子，在獨角金內酯下游靶基因調控中發(fā)揮著重要的作用[7-8]。TPL/TPR 是植物激素信號轉導通路中抑制基因轉錄的共抑制因子(co-repressor)[40]。水稻OsD53 含有3 個典型的EAR 基序，它們與TPL(TOPLESS)/TPR(TPL-RELATED PROTEIN)蛋白相互作用[8]。水稻基因組中有3個TPL/TPR，OsD53可以與TPL2和TPL3相互作用。OsD53可與TPL/TPR蛋白形成轉錄抑制復合物，協同抑制靶基因在獨腳金內酯信號通路下游的表達，使該信號通路下游的基因無反應[7]。進一步研究表明，該下游基因是轉錄因子IPA1，D53蛋白和TPL蛋白共同形成抑制因子可以結合轉錄因子IPA1 蛋白，抑制其轉錄激活，調控植物分枝[7,27,41]。IPA1，又稱OsSPL14，是SQUAMOSA啟動子結合蛋白樣(SPL)家族的成員，屬于植物特異性的轉錄因子[42]。IPA1編碼SPL14轉錄因子，它的表達受miRNA156和miRNA529的調控[43]，其中TB1被證明是IPA1的直接轉錄靶點[44]。IPA1能夠直接結合到水稻蘗芽生長的負調控基因OsTB1(TEOSINTE BRANCHED1)的啟動子(FC1)上，從而抑制水稻的分蘗[42,45]。SONG 等[40]檢測了IPA1對獨腳金內酯下游的潛在參與，他們發(fā)現D53/SMXLs在體內和體外都能與IPA1發(fā)生作用，進而抑制IPA1的轉錄因子活性。這些結果表明，獨腳金內酯信號通路與MIR156/SPL調控模塊在TB1/FC1/BRC1啟動子處匯合，協同調控植物分枝[46]。FANG 等[47]研究表明，水稻D53與OsBZR1相互作用，這種抑制依賴于OsBZR1的DNA 直接結合，OsBZR1將D53招募到水稻芽中的FC1啟動子上，進而調節(jié)水稻分枝。油菜素內酯(Brassinosteroids，BRs)通過促進水稻芽的生長而增強分蘗[47]。BRASSINAZOLE RESISTANT 1(BZR1)是BRs 下游轉錄因子[48]。在面包小麥中，水稻OsD53的同源基因TaD53可與TaSPL3和TaSPL17 蛋白相互作用，從而抑制了TaSPL3/TaSPL17介導的TaTB1表達的轉錄激活[49]。

HU 等[50]通過轉錄組學和遺傳分析等實驗表明BES1在獨腳金內酯中調控芽的分枝。擬南芥中當獨腳金內酯缺失時，SMXLs與磷酸化或未磷酸化的BES1相互作用，BES1與啟動子結合，SMXLs的EAR基序招募TPR2，從而抑制BRC1的表達，增加分枝數量。當獨腳金內酯存在時，SMXLs-BES1 復合物在感知獨腳金內酯后被AtD14-MAX2降解，從而表達BRC1，抑制芽分枝[50]。TCP 轉錄因子BRC1 及其同源物被認為是通過協調不同的環(huán)境和發(fā)育線索來調控芽生長的關鍵開關[51-52]。最新研究發(fā)現，擬南芥的抑制因子SMXL6也是轉錄因子，通過與轉錄因子D14、MAX2相互作用來抑制轉錄，也可以作為轉錄因子直接與SMXL6/7/8啟動子結合，形成負反饋環(huán)來維持SMXL6/7/8蛋白的穩(wěn)態(tài)[33]，當獨腳金內酯存在時，受體D14感知并水解獨腳金內酯生成活性激素，D14與SCFMAX2相互作用形成復合物，復合物招募SMXL6，促進其泛素化和降解，消除SMXL6 的表達抑制。新合成的SMXL6 直接與SMXL6、7、8的啟動子結合，形成負反饋回路，維持SMXL6/7/8蛋白的穩(wěn)態(tài)[33,53]。

在 玉米 中，IPA1的3 個同 源基 因UB2、UB3和TSH4在限制側枝原基啟動方面起著關鍵作用，從而影響玉米的分蘗和雄穗分枝數[54]。研究發(fā)現，ZmD53可以與UB3和TSH4相互作用，但與UB2不相互作用[21]。水稻OsD53可抑制IPA1的轉錄激活活性，導致下游基因FC1的表達降低，從而導致更多分蘗[44]，而TB1是玉米中的FC1同源物[55]，ZmD53通過抑制UB2/UB3/TSH4在TB1上的表達活性，促進分蘗形成，其中UB2、UB3和TSH4可相互作用，并且ZmD53直接調節(jié)TSH4的表達以形成正反饋回路[21]。

KERR等[23]發(fā)現豌豆PsSMXL7抑制RMS3(D14)下游的PsBRC1，通過獨腳金內酯調控PsBRC1的轉錄，從而調節(jié)枝條分枝，BRC1蛋白是一種轉錄因子，作用于獨腳金內酯下游，參與調控豌豆的分枝發(fā)育[56]。Pssmxl6和Pssmxl8對下游PsBRC1的調節(jié)途徑還有待研究[23]。進一步研究表明，PsSMXL7 蛋白通過抑制BRANCHED1(PsBRC1)的表達促進芽的生長，防止PsBRC1通過PsNCED2等下游反應基因抑制芽的生長，獨腳金內酯通過靶向PsSMXL7蛋白進行泛素化和降解來抑制芽的生長，PsSMXL7對PsSMXL7/8表達的負反饋調控導致獨腳金內酯處理后PsSMXL7/8轉錄上調[23]。

3.3 D53/SMXLs在其他生長發(fā)育中的功能

氮(N)是糧食作物必不可少的主要營養(yǎng)元素，水稻通過改變其根系形態(tài)（如根系伸長）來響應NO3ˉ的施用。SUN等[57]研究發(fā)現，與NH4+處理相比，NO3ˉ處理后的水稻根系中獨腳金內酯信號水平較高，D53 蛋白含量較低，進一步鑒定表明，SPL14的同源蛋白SPL17也與D53相互作用，其中PIN1b是IPA1(SPL14)的靶基因[58]。當NH4+存在時，D53與SPL14/17結合以抑制SPL14/17的轉錄活性并抑制根伸長，當NO3ˉ存在時，D14對獨腳金內酯的感知導致D53通過蛋白酶體系統(tǒng)降解，從而停止抑制SPL14/17介導的PIN1b轉錄并導致水稻根伸長[57]。

在玉米中，IPA1的3個同源基因UB2、UB3和TSH4在限制側枝原基啟動方面起著關鍵作用，從而影響玉米的分蘗和流蘇數[54]。玉米ZmD53是水稻D53的同源基因，它參與獨腳金內酯信號轉導通路。Liu等[21]通過酵母雙雜交實驗分析證明ZmD53可以與UB3和TSH4相互作用，但與UB2不相互作用。他們進一步研究表明，ZmD53抑制UB3/TSH4對UB2/UB3/TSH4啟動子的轉錄激活活性以調節(jié)流蘇分支數，通過將UB3過表達轉基因植物(UB3-OE)與純合Zmd53/Zmd53轉基因植物進行雜交證明ZmD53通過抑制UB3和TSH4的轉錄活性，從而減少雄穗分枝數。此外，在玉米純合子Zmd53/Zmd53轉基因植株研究中發(fā)現，植株穗狀花序分枝分生組織數量明顯減少，并伴有小穗對分生組織行排列紊亂，而正常的穗部發(fā)育過程中沒有以上現象，因此Zmd53影響雄性和雌性花序發(fā)育[21]。

4 D53/SMXLs在干旱脅迫中起負調控作用

干旱是對作物生長和產量的主要威脅，通過轉錄組分析，發(fā)現SMXL6、7、8參與了干旱響應，其中smxl6/smxl7/smxl8三突變體表現出了比野生型(WT)更強的耐旱性[59-60]。當葉片表面溫度升高，SMXL6,7,8基因功能的缺失導致獨腳金內酯信號增強，進而促進氣孔關閉[61]。與野生型相比，突變體植株葉片表面溫度更高，表皮通透性降低，干旱導致的水分流失和細胞膜損傷減少。從而提高抗旱性[61]。此外，smxl6/smxl7/smxl8對abl誘導的氣孔關閉和ABA反應敏感[33]。

蘋果的研究發(fā)現，D53/SMXLs的同源基因是MdSMXL8.2，其啟動子具有許多與脅迫相關的順式作用元件，如熱激響應元件HSE、干旱誘導MYB 結合MBS 等，經實驗表明MdSMXL8.2能夠響應鹽脅迫和干旱脅迫[62]。此外，研究表明獨腳金內酯可能通過調節(jié)細胞骨架和誘導關鍵基因AFL1調控植物抗旱性[33]，由此推測，D53/SMXLs作為獨腳金內酯的抑制因子為其提高植物抗旱性提供新的途徑。

5 總結

分枝的生長調控是優(yōu)化植物形態(tài)建成的重要因素，其中分枝的發(fā)生是高等植物生長發(fā)育過程中重要的生命活動。D53/SMXLs 蛋白作為獨腳金內酯信號轉導途徑的關鍵蛋白，在植物的分枝發(fā)育等多個生物過程中發(fā)揮著重要而作用。以往研究水稻和擬南芥中D53/SMXLs基因的調控機制居多，少有關于木本植物中D53/SMXLs基因的研究。木本植物的分枝發(fā)育可影響栽植密度，解決樹木與農作物的肥水、光照及生長等問題，從而滿足平原農區(qū)林業(yè)生產的需要，如在蘋果、櫻桃、柑橘等果樹作物方面，施用獨腳金內酯抑制劑可促進植物分枝，提高果業(yè)的質量和效率；在楊樹等實用樹種方面，通過培育窄冠、速生及干形好的理想品種，以實現最佳的觀賞實用價值。

筆者基于楊樹分枝發(fā)育相關的QTL 定位和楊樹不同分枝表型的定量結果發(fā)現，D53/SMXLs基因可能參與楊樹分枝發(fā)育的調控，已創(chuàng)制PagD53-OE和PagD53-ANTI等轉基因楊樹材料，明確PagD53表達量的改變對楊樹分枝發(fā)育的影響，并已創(chuàng)制PagD53啟動子和PagD53-GRF等轉基因楊樹材料，進而通過GUS染色和ChIP-seq技術分析PagD53組織表達模式和下游調控靶基因及分子機理，為木本植物D53/SMXLs基因的研究提供更多的理論依據。

關于獨腳金內酯信號途徑的許多步驟還有待完善與研究：（1）近年來研究發(fā)現，獨腳金內酯、乙烯和細胞分裂素等激素間很可能存在一個動態(tài)平衡，相互協同來調控植物的發(fā)育，D53/SMXLs基因作為獨腳金內酯抑制因子，是否通過細胞分裂素和乙烯調控植物分枝和生根？（2）擬南芥中的SMXL6作為轉錄因子可直接與SMXL6/7/8的啟動子結合，進而抑制SMXL6/7/8的表達，其他同源基因的植物中是否具有這種轉錄因子的功能有待進一步研究，而且SMXL6與SMXL6/7/8啟動子之間是否存在相互選擇的機制。（3）雖然D53/SMXLs基因已被證實參與獨腳金內酯的信號轉導途徑，但從類胡蘿卜素作為前體到與激素受體結合再到信號轉導是一個復雜的過程，D53/SMXLs基因是否與其他基因存在更多的酶促反應？獨腳金內酯完整的信號轉導途徑的發(fā)現，讓人們對植物分枝的調控有了新的理解，也將引發(fā)人們對作物改良的全新思考，為其在實際生產中的廣泛應用提供科學依據。