李吉博, 馮永文, 吳文峰, 范學(xué)政, 李海霞

[中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院(光明), 1. 重癥醫(yī)學(xué)科, 2. 神經(jīng)外科, 3. 急診科, 廣東 深圳, 518106]

腦卒中是危及人類生命健康的主要疾病之一,具有較高的致死率和致殘率[1-2]。原發(fā)性高血壓的臨床發(fā)病率較高且發(fā)病趨于年輕化,而腦卒中是自發(fā)性高血壓患者常見的并發(fā)癥[3]。自發(fā)性高血壓所致腦卒中目前尚無(wú)針對(duì)性的有效治療方法,因此,開發(fā)新藥物對(duì)治療自發(fā)性高血壓相關(guān)腦卒中具有重要意義。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(A Ⅲ)是一種天然草本生物活性化合物,具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用[4]。既往研究[5]發(fā)現(xiàn), A Ⅲ可減輕異氟烷誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元損傷,表明A Ⅲ對(duì)腦具有保護(hù)作用,但A Ⅲ能否治療自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)腦卒中尚不明確。相關(guān)研究[6-7]表明,自發(fā)性高血壓患者血漿中miRNA-296-5p表達(dá)水平顯著高于非自發(fā)性高血壓患者,且A Ⅲ通過(guò)上調(diào)微小RNA-296-5p(miR-296-5p)而抑制人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡。本研究探討A Ⅲ對(duì)SHR腦卒中的影響及其分子機(jī)制,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)SD大鼠12只, 6周齡,體質(zhì)量200～210 g, 購(gòu)自導(dǎo)科醫(yī)藥技術(shù)(廣東)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2022-0060。雄性SPF級(jí)SHR共96只, 6周齡,體質(zhì)量200～210 g, 購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已獲得本院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

A Ⅲ(規(guī)格1 g, 純度≥98%)購(gòu)自深圳虹彩祥根生物科技有限公司; miR-296-5p激動(dòng)劑(miR-296-5p agomir)及其陰性對(duì)照品(agomir NC)購(gòu)自百奧邁科生物技術(shù)有限公司; 尼莫地平購(gòu)自北京凱詩(shī)源生物科技有限公司。

1.3 SHR腦卒中模型構(gòu)建

使6周齡SHR連續(xù)2個(gè)月自由飲用0.9%氯化鈉溶液,然后給予1%氯化鈉溶液喂養(yǎng),若SHR出現(xiàn)肢體抽動(dòng)、癱瘓、全身震顫、軟癱甚至死亡等癥狀中的1種,則視為SHR腦卒中模型構(gòu)建成功[8]。本實(shí)驗(yàn)建模成功率為100%, 建模過(guò)程中未出現(xiàn)大鼠死亡情況。

1.4 動(dòng)物分組及處理

按照隨機(jī)數(shù)字表法將模型大鼠分為模型組(Model組)、A Ⅲ低劑量組(A Ⅲ-L組)、A Ⅲ高劑量組(A Ⅲ-H組)、陽(yáng)性藥物尼莫地平組(Nim組)、miR-296-5p激動(dòng)劑組(miR-296-5p agomir組)、agomir NC組、A Ⅲ-H+miR-296-5p agomir組、A Ⅲ-H+agomir NC組,每組12只。A Ⅲ-L組、A Ⅲ-H組大鼠分別尾靜脈注射2.22、6.66 mg/kg A Ⅲ, 且腹腔注射等量生理鹽水[9]; Nim組大鼠腹腔注射1 mg/kg尼莫地平,且尾靜脈注射等量生理鹽水[10]; agomir NC組、miR-296-5p agomir組大鼠分別尾靜脈注射300 μg agomir NC、300 μg miR-296-5p agomir, 腹腔注射等量生理鹽水[11]; A Ⅲ-H+agomir NC組大鼠尾靜脈注射6.66 mg/kg A Ⅲ和300 μg agomir NC, 腹腔注射等量生理鹽水; A Ⅲ-H+miR-296-5p agomir組大鼠尾靜脈注射6.66 mg/kg A Ⅲ和300 μg miR-296-5p agomir, 腹腔注射等量生理鹽水; Model組大鼠腹腔注射等量生理鹽水,尾靜脈注射等量生理鹽水。將正常飼養(yǎng)的12只SD大鼠設(shè)為對(duì)照組(NC組),分別腹腔注射和尾靜脈注射等量生理鹽水。各組大鼠給藥1次/d, 持續(xù)6周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 大鼠神經(jīng)癥狀評(píng)分: 參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行大鼠神經(jīng)癥狀評(píng)分。0分表示大鼠正常; 1分表示大鼠少動(dòng)或輕度激惹; 2分表示單側(cè)前肢或頭抽動(dòng),時(shí)跳時(shí)竄; 3分表示大鼠單側(cè)肢體癱瘓,行走困難; 4分表示大鼠四肢癱瘓,不能站立。

1.5.2 大鼠平均動(dòng)脈壓: 將大鼠固定于血壓計(jì)配套的保溫套中,待血壓監(jiān)測(cè)界面的脈搏波趨于穩(wěn)定時(shí),使用智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)測(cè)定尾動(dòng)脈血壓。

1.5.3 大鼠存活時(shí)間: 從給藥第1天開始,每天統(tǒng)計(jì)各組大鼠生存情況直至末次給藥結(jié)束,若出現(xiàn)死亡,記錄大鼠存活時(shí)間。

1.5.4 大鼠血小板黏附率: 末次處理24 h后,將所有大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,收集血液,使用XSN-R型血小板黏附-體外血栓兩用儀檢測(cè)各組大鼠血小板黏附率。

1.5.5 大鼠腦組織海馬CA1區(qū)病理變化: 采用蘇木素-伊紅(HE)染色法檢測(cè)。于大鼠死后或卒中后6周處死后,立即取海馬CA1區(qū)腦組織。各組隨機(jī)選取6只大鼠的海馬CA1區(qū)腦組織固定于4%多聚甲醛中,將組織標(biāo)本包埋于石蠟中,用切片機(jī)切成5 μm切片后進(jìn)行HE染色,使用光學(xué)顯微鏡觀察腦組織海馬CA1區(qū)病理變化。

1.5.6 大鼠腦組織海馬CA1區(qū)miR-296-5p表達(dá): 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)miR-296-5p表達(dá)。取各組剩余6只大鼠的海馬CA1區(qū)腦組織,利用TRIzol試劑提取腦組織勻漿總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR[12-13]。qRT-PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s, 95 ℃變性5 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 共45個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參基因,通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算miR-296-5p相對(duì)表達(dá)水平。U6正向引物(5′-3′)為CTCGCTTCGGCAGCACA,反向引物(5′-3′)為AACGCTTCACGAATTTGCGT; miR-296-5p正向引物(5′-3′)為GTATCCAGTGCAGGGTCCGA, 反向引物(5′-3′)為CGACGAGGGCCCCCCCT。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 A Ⅲ對(duì)大鼠神經(jīng)癥狀評(píng)分和平均動(dòng)脈壓的影響

與NC組比較,Model組大鼠神經(jīng)癥狀評(píng)分、平均動(dòng)脈壓升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與Model組比較, A Ⅲ-L組、A Ⅲ-H組、Nim組大鼠神經(jīng)癥狀評(píng)分、平均動(dòng)脈壓降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與A Ⅲ-L組比較, A Ⅲ-H組、Nim組大鼠神經(jīng)癥狀評(píng)分、平均動(dòng)脈壓降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與Model組、agomir NC組比較, miR-296-5p agomir組大鼠神經(jīng)癥狀評(píng)分、平均動(dòng)脈壓升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與A Ⅲ-H組、A Ⅲ-H+agomir NC組比較, A Ⅲ-H+miR-296-5p agomir組大鼠神經(jīng)癥狀評(píng)分、平均動(dòng)脈壓升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)癥狀評(píng)分和平均動(dòng)脈壓比較

2.2 A Ⅲ對(duì)大鼠存活時(shí)間和血小板黏附率的影響

與NC組比較, Model組大鼠存活時(shí)間縮短,血小板黏附率升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與Model組比較, A Ⅲ-L組、A Ⅲ-H組、Nim組大鼠存活時(shí)間延長(zhǎng),血小板黏附率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與A Ⅲ-L組比較, A Ⅲ-H組、Nim組大鼠存活時(shí)間延長(zhǎng),血小板黏附率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與Model組、agomir NC組比較, miR-296-5p agomir組大鼠存活時(shí)間縮短,血小板黏附率升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與A Ⅲ-H組、A Ⅲ-H+agomir NC組比較,A Ⅲ-H+miR-296-5p agomir組大鼠存活時(shí)間縮短,血小板黏附率升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表2。

表2 各組大鼠存活時(shí)間和血小板黏附率比較

2.3 A Ⅲ對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)病理?yè)p傷的影響

HE染色結(jié)果顯示, NC組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常; Model組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)紊亂,核固縮,神經(jīng)元數(shù)量減少; 與Model組比較, A Ⅲ-L組、A Ⅲ-H組、Nim組大鼠海馬CA1區(qū)病理?yè)p傷減輕; 與Model組、agomir NC組比較, miR-296-5p agomir組大鼠海馬CA1區(qū)病理?yè)p傷加劇; 與A Ⅲ-H組、A Ⅲ-H+agomir NC組比較, A Ⅲ-H+miR-296-5p agomir組大鼠海馬CA1區(qū)病理?yè)p傷嚴(yán)重,見圖1。

2.4 A Ⅲ對(duì)大鼠腦組織海馬CA1區(qū)miR-296-5p表達(dá)的影響

與NC組比較, Model組大鼠海馬CA1區(qū)miR-296-5p表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與Model組比較, A Ⅲ-L組、A Ⅲ-H組、Nim組大鼠海馬CA1區(qū)miR-296-5p表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與A Ⅲ-L組比較, A Ⅲ-H組、Nim組大鼠海馬CA1區(qū)miR-296-5p表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與Model組、agomir NC組比較, miR-296-5p agomir組大鼠海馬CA1區(qū)miR-296-5p表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與A Ⅲ-H組、A Ⅲ-H+agomir NC組比較,A Ⅲ-H+miR-296-5p agomir組大鼠海馬CA1區(qū)miR-296-5p表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表3。

表3 各組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)miR-296-5p表達(dá)比較

3 討 論

SHR是目前國(guó)際公認(rèn)的最接近于人原發(fā)性高血壓的動(dòng)物模型,也是藥物篩選及基礎(chǔ)研究的首選動(dòng)物模型[14]。本研究通過(guò)高鹽喂養(yǎng)SHR構(gòu)建SHR腦卒中模型,結(jié)果顯示,與NC組比較, Model組大鼠神經(jīng)癥狀評(píng)分、平均動(dòng)脈壓升高,存活時(shí)間縮短,海馬CA1區(qū)病理?yè)p傷嚴(yán)重,表明SHR腦卒中模型構(gòu)建成功。血小板黏附是指血小板可黏附于其他異物表面的特性,在正常生理情況下,血小板不與完整的血管內(nèi)皮發(fā)生黏附,病理狀態(tài)下血小板則可黏附至內(nèi)皮下基質(zhì)中的膠原上,進(jìn)而引發(fā)腦血管病變[15]。本研究發(fā)現(xiàn), Model組大鼠血小板黏附率顯著高于NC組,再次證實(shí)Model組大鼠存在腦血管病變。

A Ⅲ是從白術(shù)中發(fā)現(xiàn)的主要生物活性成分,已被證實(shí)具有抗氧化、抗腫瘤、抗過(guò)敏反應(yīng)、抗菌作用和認(rèn)知保護(hù)作用[16-17]。A Ⅲ可抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)[18], 可保護(hù)原代培養(yǎng)的神經(jīng)元免受同型半胱氨酸處理誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[19],可減輕神經(jīng)炎癥而改善小鼠腦缺血情況[20]。本研究結(jié)果顯示, A Ⅲ可降低腦卒中SHR的神經(jīng)癥狀評(píng)分、平均動(dòng)脈壓、血小板黏附率,延長(zhǎng)存活時(shí)間,減輕海馬CA1區(qū)病理?yè)p傷,且A Ⅲ劑量越高,對(duì)應(yīng)指標(biāo)的變化趨勢(shì)越顯著,表明A Ⅲ可減輕SHR腦卒中,或可成為治療自發(fā)性高血壓誘發(fā)腦卒中的潛在有效藥物。

既往研究[21]顯示, A Ⅲ可通過(guò)調(diào)控miR-466c-5p表達(dá)而抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化。為了進(jìn)一步探究A Ⅲ影響SHR腦卒中的分子機(jī)制,本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)與自發(fā)性高血壓相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行搜索,發(fā)現(xiàn)miR-296-5p表達(dá)與非洲綠猴的自發(fā)性高血壓有關(guān)[22], 且腦缺血損傷可刺激miR-296表達(dá)水平逐漸上調(diào)[23], 表明miR-296-5p可能與SHR腦卒中有關(guān)。本研究結(jié)果顯示, Model組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)miR-296-5p表達(dá)高于NC組,且相較于Model組、agomir NC組, miR-296-5p agomir組大鼠海馬CA1區(qū)miR-296-5p表達(dá)升高,神經(jīng)癥狀評(píng)分、平均動(dòng)脈壓、血小板黏附率升高,存活時(shí)間縮短,海馬CA1區(qū)病理?yè)p傷加劇,表明miR-296-5p確實(shí)參與了SHR腦卒中過(guò)程。本研究還發(fā)現(xiàn), A Ⅲ可抑制腦卒中SHR海馬腦組織CA1區(qū)miR-296-5p表達(dá),且A Ⅲ劑量越高,抑制作用越顯著,推測(cè)A Ⅲ可能通過(guò)抑制miR-296-5p表達(dá)減輕SHR腦卒中。為了驗(yàn)證該猜想,本研究在高劑量A Ⅲ作用的基礎(chǔ)上加用miR-296-5p agomir干預(yù)腦卒中SHR[24], 結(jié)果顯示, miR-296-5p agomir減弱了高劑量A Ⅲ對(duì)SHR腦卒中的改善作用,證實(shí)了猜想的正確性,即A Ⅲ可能通過(guò)抑制miR-296-5p表達(dá)而減輕SHR腦卒中。

綜上所述, A Ⅲ可能通過(guò)抑制miR-296-5p表達(dá)對(duì)SHR腦卒中起到治療作用,但A Ⅲ對(duì)SHR腦卒中的改善作用可能還涉及其他通路,有待未來(lái)深入開展后續(xù)研究加以探討。