張君臣, 徐武華, 鐘 麗

[1. 四川省中江縣人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 四川 德陽, 618100; 2. 暨南大學(xué)附屬廣州紅十字會醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科(神經(jīng)內(nèi)科二區(qū)), 臨床病態(tài)營養(yǎng)研究所, 廣東 廣州, 510220;3. 四川省宜賓市第二人民醫(yī)院, 四川 宜賓, 644002]

動脈粥樣硬化(AS)最初由內(nèi)皮功能障礙引發(fā),其特征是致AS脂蛋白成分的流入[1]。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)已被證明參與AS的形成過程,其誘發(fā)的血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)損傷是AS的早期發(fā)病機(jī)制之一[2]。減少ox-LDL誘導(dǎo)的EC損傷并進(jìn)一步解釋其機(jī)制可能是預(yù)防和治療AS的潛在策略。番茄紅素(LYC)是一種廣泛使用的抗氧化劑,可以修復(fù)動物生物體和細(xì)胞的氧化損傷。LYC對多種類型的疾病具有預(yù)防或治療作用,例如心腦血管疾病、癲癇、癌癥等[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn), LYC可通過減輕過氧化氫(H2O2)激活的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷,并抑制細(xì)胞凋亡,有助于預(yù)防AS。GUO W H等[5]發(fā)現(xiàn), LYC可減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人EC損傷。

RAS同源基因家族成員A(RhoA)/Rho相關(guān)激酶(ROCK)信號通路是研究AS的重要通路,抑制RhoA/ROCK信號通路可有效改善慢性間歇性缺氧(IH)加重的內(nèi)皮屏障損傷和AS[6]。BABAAHMADI-REZAEI H等[7]研究發(fā)現(xiàn), RhoA/ROCK信號通路抑制劑可以減少蛋白多糖合成和AS斑塊的形成, ROCK抑制劑可能在抑制或減緩AS形成方面具有潛在的治療作用。LYC是否可以通過調(diào)控RhoA/ROCK信號通路對人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMECs)產(chǎn)生影響還尚無報道。本研究探討LYC是否可以通過抑制RhoA/ROCK信號通路對HBMECs細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

HBMECs購自武漢賽奧斯生物科技有限公司; RhoA/ROCK信號通路激活劑溶血磷脂酸(LPA)購自深圳市健竹科技有限公司; LYC購自上海源葉生物科技有限公司; ox-LDL購自廣州奕源生物科技有限公司; 單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)購自武漢菲恩生物科技有限公司,人白細(xì)胞介素(IL)-6試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司; 血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)試劑盒購自上海生工; Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自弗元(上海)生物科技有限公司; CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司; 兔抗人RhoA一抗、兔抗人ROCK1一抗、兔抗人BCL-2相關(guān)X蛋白(Bax)一抗、兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)一抗、兔抗人裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-Caspase-3)一抗、兔抗人血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(CD31)一抗、兔抗人平滑肌(SM)22α一抗、兔抗人GAPDH抗體均購自英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將HBMECs置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,在補(bǔ)充有5%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的EGM-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)。采用50 mg/mL ox-LDL處理HBMECs[8],將采用ox-LDL處理的HBMECs分為ox-LDL組、LYC組(0.5 μmol/L LYC處理HBMECs)[5]、LPA組(5 μmol/L RhoA/ROCK信號通路激活劑LPA處理HBMECs)[9]、LYC+LPA組(0.5 μmol/L LYC以及5 μmol/L LPA共同處理HBMECs), 未做任何處理的HBMECs記為NC組,處理24 h后用于后續(xù)實驗。

1.3 觀察指標(biāo)

① 采用ELISA試劑盒檢測HBMECs中MCP-1、IL-6、VCAM-1的水平。② 采用CCK-8法檢測HBMECs增殖情況。將HBMECs接種在96孔板上(1×104個/孔),分組處理24 h后,添加10 μL CCK-8在37 ℃下孵育2 h。采用微孔板讀取器測量450 nm處的吸光度。③ 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測HBMECs凋亡率。收集各組HBMECs, 結(jié)合緩沖液重懸后(1×105個/mL), 添加10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI, 并在室溫下黑暗中進(jìn)行反應(yīng)15 min。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率是根據(jù)第2、4象限數(shù)據(jù)相加統(tǒng)計。④ Western blot檢測細(xì)胞CD31、SM22α、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3、RhoA/ROCK通路相關(guān)蛋白表達(dá)。采用RIPA裂解緩沖液裂解每組中的HBMECs。采用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì),然后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。將膜與5%脫脂乳緩沖液孵育1 h以防止非特異性結(jié)合,然后與一抗孵育: RhoA(1∶1 000)、ROCK1(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、cleaved-Caspase-3(1∶5 000)、Bcl-2(1∶500)、CD31(1∶1 000)、SM22α(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)抗體。在洗滌后,采用過氧化物酶偶聯(lián)的二級抗體(1∶1 000)孵育1 h后,通過增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測試劑檢測膜中的蛋白質(zhì)條帶,并通過Image J軟件檢測目的條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 LYC對細(xì)胞MCP-1、IL-6、VCAM-1水平的影響

與NC組相比, ox-LDL組MCP-1、IL-6、VCAM-1水平增高; 與ox-LDL組相比, LYC組MCP-1、IL-6、VCAM-1水平降低, LPA組MCP-1、IL-6、VCAM-1水平升高; 與LYC組相比, LYC+LPA組MCP-1、IL-6、VCAM-1水平升高; 上述組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 LYC對細(xì)胞MCP-1、IL-6、VCAM-1水平的影響 pg/mL

2.2 LYC組對細(xì)胞增殖的影響

與NC組相比, ox-LDL組OD值降低; 與ox-LDL組相比, LYC組OD值升高, LPA組OD值降低; 與LYC組相比, LYC+LPA組OD值降低; 上述組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 LYC組對細(xì)胞增殖的影響

2.3 LYC對細(xì)胞凋亡率以及凋亡蛋白水平的影響

與NC組相比, ox-LDL組HBMECs凋亡率及Bax、cleaved-Caspase-3水平增高, Bcl-2蛋白水平降低; 與ox-LDL組相比, LYC組HBMECs凋亡率及Bax、cleaved-Caspase-3水平降低, Bcl-2蛋白水平升高,而LPA組HBMECs凋亡率及Bax、cleaved-Caspase-3水平升高, Bcl-2蛋白水平降低; 與LYC組相比, LYC+LPA組HBMECs凋亡率及Bax、cleaved-Caspase-3水平增高, Bcl-2蛋白水平降低; 上述組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、圖2、表3。

表3 LYC對細(xì)胞凋亡率、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4 LYC對細(xì)胞CD31、SM22α蛋白水平的影響

與NC組相比, ox-LDL組細(xì)胞CD31蛋白水平下降, SM22α蛋白水平增加; 與ox-LDL組相比, LYC組CD31蛋白水平升高, SM22α蛋白水平降低,而LPA組CD31蛋白水平降低, SM22α蛋白水平升高; 與LYC組相比, LYC+LPA組細(xì)胞CD31蛋白水平下降, SM22α蛋白水平升高; 上述組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表4。

表4 LYC對細(xì)胞中CD31、SM22α蛋白表達(dá)的影響

2.5 LYC對細(xì)胞RhoA/ROCK信號通路蛋白水平的影響

與NC組相比, ox-LDL組RhoA、ROCK1蛋白水平上調(diào); 與ox-LDL組相比,LYC組RhoA、ROCK1蛋白水平下調(diào),而LPA組RhoA、ROCK1蛋白水平上調(diào); 與LYC組相比, LYC+LPA組RhoA、ROCK1蛋白水平上調(diào); 上述組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表5。

表5 LYC對細(xì)胞RhoA/ROCK信號通路蛋白水平的影響

3 討 論

AS是腦血管疾病的主要原因,其患病率較高,已成為全球關(guān)注的健康問題[10-11]。內(nèi)皮損傷和細(xì)胞凋亡是AS的主要病理過程,會引發(fā)血栓形成并加速AS斑塊的形成[12-14]。ox-LDL既是AS的觸發(fā)因素,也是AS的標(biāo)志[15]。ox-LDL被巨噬細(xì)胞和動脈EC吸收,促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成和EC損傷。早期研究[16]發(fā)現(xiàn), ox-LDL通過激活Caspase-3級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)EC凋亡。EC過度凋亡是AS發(fā)展的初步事件,可能是預(yù)防和治療AS的目標(biāo)。研究[17]表明,天然藥物通過抑制EC凋亡來治療AS具有巨大的潛力。LYC在AS的許多階段具有積極作用[18]。LIU H等[19]發(fā)現(xiàn), LYC通過抑制腸道膽固醇吸收表現(xiàn)出潛在的抗AS作用。LYC具有抗氧化活性,可以減少AS斑塊形成[20]。DUAN H等[17]也發(fā)現(xiàn)LYC可以通過抑制EC凋亡來治療AS。上述研究提示, LYC可能是治療AS的潛在治療藥物。本研究發(fā)現(xiàn), ox-LDL處理后HBMECs的OD值顯著下降,而LYC處理使HBMECs細(xì)胞OD值顯著升高,提示LYC可能促進(jìn)HBMECs的生長,對AS的治療起到積極影響。

ox-LDL通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮炎癥和細(xì)胞凋亡來促進(jìn)AS斑塊的形成和發(fā)展。ox-LDL對血管壁的損傷表現(xiàn)為促進(jìn)脂質(zhì)沉積、炎癥反應(yīng),釋放金屬蛋白酶,促進(jìn)EC、巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞凋亡[21]。在動脈壁的受傷區(qū)域發(fā)現(xiàn)了大量的ox-LDL積累,并且發(fā)現(xiàn)血管EC凋亡[22]。Bax、Bcl-2和Caspase-3在ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC中表達(dá)異常,這與ox-LDL誘導(dǎo)的EC損傷反應(yīng)有關(guān)。此外, ox-LDL可加速MCP-1、IL-6、VCAM-1和ICAM-1等黏附分子的表達(dá)[23]。正常EC對促炎因子的反應(yīng)是發(fā)生內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT), 其特征是成纖維細(xì)胞樣形態(tài)和細(xì)胞間連接重排[24]。在各種血管病變中, EC可能通過下調(diào)內(nèi)皮標(biāo)志物CD31 和上調(diào) SM22α來經(jīng)歷EndMT的表型轉(zhuǎn)換[25]。研究[26]表明, EndMT在心腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用,抑制EndMT可以對AS治療起到積極效果。本研究發(fā)現(xiàn), ox-LDL誘導(dǎo)的HBMECs凋亡率、MCP-1、IL-6、VCAM-1、Bax、cleaved-Caspase-3、SM22α水平顯著升高, Bcl-2、CD31水平顯著下降,而LYC治療后HBMECs凋亡率、MCP-1、IL-6、VCAM-1、Bax、cleaved-Caspase-3、SM22α水平顯著降低, Bcl-2、CD31水平顯著升高,表明ox-LDL促進(jìn)了HBMECs凋亡以及EndMT過程的發(fā)生, LYC可能通過抑制HBMECs炎癥因子水平、EndMT以及細(xì)胞凋亡來對HBMECs損傷起到保護(hù)作用。

研究[27]顯示RhoA/ROCK通路是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),參與細(xì)胞增殖、內(nèi)皮功能障礙、氧化應(yīng)激、炎癥、血管重塑和AS。既往研究[28]表明, AS的各種危險因素和病理介質(zhì)可以不同程度地激活RhoA/ROCK通路,并且抑制RhoA/ROCK通路可能是AS治療的潛在機(jī)制。此外, RhoA/ROCK通路對AS過程炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用已被研究[29]證實。本研究結(jié)果顯示, ox-LDL促進(jìn)細(xì)胞RhoA、ROCK1蛋白高表達(dá),而LYC治療后細(xì)胞RhoA、ROCK1蛋白水平顯著下降,表明ox-LDL可能通過下調(diào)RhoA/ROCK信號通路抑制HBMECs凋亡的發(fā)生。本研究使用RhoA/ROCK信號通路激活劑LPA處理ox-LDL誘導(dǎo)的HBMECs以及LYC治療后的HBMECs,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPA加重了ox-LDL誘導(dǎo)的HBMECs損傷,但減弱了LYC對ox-LDL誘導(dǎo)的EC凋亡的抑制作用。

綜上所述, LYC可能通過下調(diào)RhoA/ROCK信號通路抑制HBMECs凋亡以及EndMT, 對HBMECs損傷起到改善效果。