飛 翔, 哈斯巴拉, 道日娜, 郝建彬

(1. 內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市中心醫(yī)院 骨科, 內(nèi)蒙古 鄂爾多斯, 017000;2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市蒙醫(yī)醫(yī)院 消化病科, 內(nèi)蒙古 鄂爾多斯, 017000)

急性脊髓損傷(SCI)易導(dǎo)致?lián)p傷平面以下的感覺、運(yùn)動和自主神經(jīng)功能喪失甚至癱瘓[1], 目前除了支持治療和緊急手術(shù)以外尚無有效治療方法,SCI后神經(jīng)修復(fù)仍是醫(yī)學(xué)界亟待解決的難題[2]。SCI區(qū)域炎癥細(xì)胞浸潤,脊髓微環(huán)境處于嚴(yán)重應(yīng)激狀態(tài),多種不利因素導(dǎo)致脊髓周圍神經(jīng)元變性凋亡,嚴(yán)重影響患者肢體運(yùn)動功能[3-4]。因此,挽救凋亡神經(jīng)元是治療SCI的重要策略。蒙藥額爾敦·烏日勒(EW)又名珍寶丸,由多種名貴藥材組成,對腦癱、腦溢血、半身不遂、認(rèn)知能力減退等神經(jīng)系統(tǒng)疾病療效顯著,是歷史悠久的代表性珍貴蒙藥方劑[5]。EW具有抗炎、抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激、促進(jìn)脊髓神經(jīng)元修復(fù)等藥理作用,可有效干預(yù)SCI, 改善軸突生長微環(huán)境[6-7]。蛋白酪氨酸激酶(JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)通路是近年來備受關(guān)注的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑,多項研究[8-9]發(fā)現(xiàn)SCI可異常激活JAK2/STAT3信號通路,引發(fā)細(xì)胞凋亡。然而,EW是否通過抑制細(xì)胞凋亡在SCI中發(fā)揮作用目前尚未明確。本研究采用改良Allen法建立大鼠急性SCI模型,以期探討EW對急性SCI的治療潛力和調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

90只清潔級雄性SD大鼠, 8～10周齡,體質(zhì)量240～260 g, 購自北京華阜康實驗動物有限公司。將大鼠置于12 h光照與12 h黑暗交替循環(huán)的環(huán)境中(室溫約25 ℃, 相對濕度約50%)自由飲食,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。本研究實驗程序符合動物倫理標(biāo)準(zhǔn),且經(jīng)鄂爾多斯市中心醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑

額日敦·烏日勒(批號Z15020410, 內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司); JAK2抑制劑AG490(批號T3434, 美國Sigma公司); 原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號11684817910, 瑞士Roche Applied Science公司); BCA蛋白定量試劑盒(批號CW0014, 上海碧云天); 蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(批號G1120, 北京索萊寶); 抗Cleaved caspase-3、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bax)、磷酸化(p)-JAK2、p-STAT3抗體(批號分別為9661S、3498S、14796S、3776S、9145S, 美國CST公司); 抗β-actin抗體(批號A5441, Sigma公司); 辣根過氧化物酶(HPR, 批號PAB150011, 美國Bio-swamp公司)。正置光學(xué)顯微鏡(型號Ni-E, 日本尼康),數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)(型號DS-Ri1-U3,日本尼康)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及SCI模型制備: 將實驗大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、SCI組、EW低劑量組、EW中劑量組、EW高劑量組和EW高劑量+AG490組,每組15只。將大鼠術(shù)前禁食12 h, 以2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,俯臥位固定于小動物手術(shù)臺上,背部中線縱向切口暴露T9～T11節(jié)段棘突,顯微鏡下剝離椎旁肌肉,暴露棘突與椎板,切除T10椎板。采用改良Allen法構(gòu)建大鼠SCI模型[10],固定脊柱后,將10 g砝碼從3 cm高度自由落體損傷T10節(jié)段,脊髓出血、后肢伸直延遲和尾擺動提示模型建立成功。sham組大鼠僅切開椎板后縫合。SCI模型建立成功后,EW低劑量組、EW中劑量組、EW高劑量組分別于術(shù)后給予EW混懸液0.32、0.63、1.26 g/kg灌胃, sham組、SCI組僅給予等量蒸餾水灌胃, 2次/d, 連續(xù)給藥2周。藥物劑量根據(jù)臨床使用EW劑量確定[11], EW中劑量是人類劑量的7倍, EW低劑量是EW中劑量的0.5倍, EW高劑量是EW中劑量的2倍。

1.3.2 脊髓損傷運(yùn)動評分法(BBB)評估大鼠后肢運(yùn)動功能: 分別于SCI術(shù)后1、3、7、14 d通過BBB量表對各組大鼠損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)情況進(jìn)行評分[12]。將大鼠后肢運(yùn)動分為22個等級,評分范圍為0分(完全癱瘓)～21分(運(yùn)動正常)。雙盲模式下對每只大鼠進(jìn)行評分,時間為4 min, 2名實驗者對照評分表獨立評分后取平均值。

1.3.3 脊髓含水量檢測: 處死大鼠,取骨髓組織,稱得濕質(zhì)量后,立即置于65 ℃烘箱中,烘烤48 h, 稱得干質(zhì)量,每個樣本連續(xù)稱量3次,取平均值,計算損傷節(jié)段脊髓濕質(zhì)量/干質(zhì)量比值。

1.3.4 脊髓病理學(xué)觀察: 分離大鼠脊髓組織,室溫下用10%多聚甲醛固定24 h, 石蠟包埋后制備5 μm切片。室溫下用二甲苯和乙醇(70%、90%、100%)依次脫蠟水合,蘇木素染色5 min, 流水反藍(lán),伊紅染色1 min。用70%乙醇沖洗,光鏡下評估脊髓形態(tài)學(xué)變化。

1.3.5 TUNEL染色法檢測神經(jīng)元凋亡情況: 采用TUNEL凋亡檢測試劑盒檢測脊髓組織中凋亡細(xì)胞,組織切片用Triton-X 100洗滌并滲透,然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌。將脊髓組織切片浸入TUNEL檢測反應(yīng)混合液中,室溫孵育。熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的局部綠色熒光。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測脊髓組織Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、JAK2/STAT3蛋白表達(dá): 使用RIPA蛋白裂解液裂解脊髓組織,并使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒進(jìn)行濃度定量。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離40 μg蛋白,濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂牛奶封閉1 h; 分別加入Cleaved caspase-3(1∶200)、Bax(1∶200)、Bcl-2(1∶200)、p-JAK2(1∶300)、p-STAT3(1∶300)和β-actin(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜。次日,加入HRP山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)37 ℃孵育1 h, 然后使用紅外成像掃描儀對條帶進(jìn)行可視化分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)情況比較

術(shù)后各時點, SCI組、EW低劑量組、EW中劑量組、EW高劑量組大鼠BBB評分均低于sham組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 術(shù)后1 d時,EW低劑量組、EW中劑量組、EW高劑量組大鼠BBB評分與SCI組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); 術(shù)后3 d時, EW中劑量組、EW高劑量組BBB評分均高于SCI組、EW低劑量組,且EW高劑量組BBB評分高于EW中劑量組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 術(shù)后7、14 d時,EW低劑量組、EW中劑量組、EW高劑量組大鼠BBB評分均高于SCI組,且BBB評分升高具有劑量依賴性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表1。

表1 各組大鼠脊髓損傷運(yùn)動評分法評分比較 分

2.2 各組大鼠脊髓含水量情況比較

SCI組大鼠脊髓組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量比值大于sham組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); EW低劑量組、EW中劑量組、EW高劑量組大鼠脊髓組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量比值均小于SCI組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01), 見表2。

表2 各組大鼠脊髓濕質(zhì)量/干質(zhì)量比值比較

2.3 各組大鼠脊髓組織病理形態(tài)學(xué)比較

HE染色結(jié)果顯示, sham組脊髓結(jié)構(gòu)完整,神經(jīng)元形態(tài)正常; 與sham組相比, SCI組大鼠脊髓的損傷程度嚴(yán)重,結(jié)構(gòu)紊亂,水腫、出血和中性粒細(xì)胞浸潤明顯; EW低劑量組、EW中劑量組、EW高劑量組神經(jīng)元變性數(shù)量減少,組織相對完整,且脊髓的損傷程度隨著EW劑量增加而逐漸減輕,見圖1。

2.4 各組大鼠脊髓組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況比較

SCI組大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率高于sham組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); EW低劑量組、EW中劑量組、EW高劑量組大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率均低于SCI組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 見圖2。

A: TUNEL實驗結(jié)果(TUNEL染色法,放大400倍; 凋亡陽性細(xì)胞核呈綠色熒光,正常細(xì)胞核呈藍(lán)色); B: 各組大鼠(每組5只)脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比較(與SCI組比較, ??P<0.01; 與sham組比較, ##P<0.01)。圖2 各組大鼠脊髓組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況比較

2.5 各組大鼠脊髓組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

Western blot檢測結(jié)果顯示,與sham組相比, SCI組大鼠脊髓組織Cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)升高, Bcl-2蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); 相較于SCI組, EW低劑量組、EW中劑量組、EW高劑量組Cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)逐漸降低, Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖3、表3。

表3 各組大鼠脊髓組織凋亡蛋白相對表達(dá)量比較

表4 各組大鼠脊髓組織p-JAK2和p-STAT3蛋白相對表達(dá)量比較

2.6 EW對SCI大鼠脊髓組織p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示, SCI組大鼠脊髓p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)高于sham組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); 相較于SCI組,EW低劑量組、EW中劑量組、EW高劑量組大鼠脊髓組織p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)逐漸降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 見圖4、表4。

2.7 EW通過JAK2/STAT3信號通路抑制神經(jīng)元凋亡

與sham組相比,SCI組大鼠脊髓組織p-JAK2、p-STAT3、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào), Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); 與SCI組相比, EW高劑量組大鼠脊髓組織p-JAK2、p-STAT3、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào), Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); 與EW高劑量組相比, EW高劑量+AG490組大鼠脊髓組織p-JAK2、p-STAT3、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào), Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 見圖5、表5。

表5 各組大鼠神經(jīng)元凋亡通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較

3 討 論

急性SCI來源于脊髓的直接或間接損傷,具有較高的致殘率和致死率,可給患者及其家庭和社會帶來巨大負(fù)擔(dān)[1]。SCI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚未被完全闡明,但已有研究[13]證實SCI的發(fā)生發(fā)展過程涉及一系列分子和細(xì)胞事件,包括細(xì)胞凋亡、自噬和炎癥。減輕繼發(fā)性并發(fā)癥是目前SCI治療領(lǐng)域的研究熱點之一,而可逆性神經(jīng)元凋亡作為SCI的主要細(xì)胞死亡機(jī)制,與患者最終的神經(jīng)功能損傷程度密切相關(guān)。本研究建立大鼠SCI模型,旨在探討蒙藥EW對SCI的治療作用及其可能機(jī)制。

蒙醫(yī)理論認(rèn)為SCI屬于“薩病”“白脈病”范疇,損傷使得脊髓組織局部環(huán)境發(fā)生改變,引起體內(nèi)三根失調(diào),以琪素、協(xié)日亢盛,赫依與琪素相搏,氣血運(yùn)行、流通障礙為基本病機(jī),驟然上沖于腦,繼而損傷腦部黑脈并引起白脈之?！X缺血受損而致病[5]。蒙醫(yī)治療該病以調(diào)理三根、通脈活絡(luò)、散瘀活血、恢復(fù)白脈為原則[14]。EW由木香、丁香、降香、紫檀香、麝香、高良姜紅花等30多味蒙藥組成,具有舒筋活絡(luò)、安神、燥黃水、清陳舊熱等功能,是目前臨床治療白脈病的首選藥物[15]。多項臨床和基礎(chǔ)研究[16-19]表明EW治療對神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的神經(jīng)修復(fù)具有顯著促進(jìn)作用,但目前鮮有關(guān)于EW對急性SCI模型大鼠作用及機(jī)制的研究報道。本研究結(jié)果顯示, SCI大鼠經(jīng)EW灌胃治療后運(yùn)動功能逐漸恢復(fù),且隨著治療劑量的增加和治療時間的延長, SCI治療組大鼠BBB評分逐漸增高, SCI程度亦逐漸減輕,提示EW治療或可發(fā)揮一定的神經(jīng)修復(fù)作用。

越來越多的研究[20-21]表明, SCI后脊髓微環(huán)境損傷甚至神經(jīng)元細(xì)胞死亡可能是患者后續(xù)殘疾和死亡的主要原因,其中細(xì)胞凋亡是SCI的核心因素。研究[22]發(fā)現(xiàn),患者SCI 4 h后,多種損傷刺激可導(dǎo)致大量神經(jīng)元凋亡和功能失調(diào),并引起B(yǎng)ax、caspase和Bcl-2等凋亡調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)紊亂。EMERY E等[23]對15例傷后3 h至2個月死亡患者的脊髓進(jìn)行病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),神經(jīng)元凋亡參與了人SCI后的繼發(fā)性損傷過程,且凋亡細(xì)胞主要集中于損傷中心的邊緣和鄰近的白質(zhì)中。李璟璐等[24]對給予凋亡相關(guān)斑點樣蛋白寡聚阻斷劑的SCI小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),阻斷凋亡可通過抑制炎癥小體相關(guān)基因的表達(dá)直接或間接導(dǎo)致SCI急性期基因表達(dá)受抑制。由此表明,有效抑制神經(jīng)元凋亡可為防治SCI開辟一條嶄新途徑。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn), EW可減少SCI大鼠TUNEL染色陽性神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量,提示EW可抑制SCI大鼠的細(xì)胞凋亡。此外,經(jīng)EW處理后,促凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase-3表達(dá)下調(diào),抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)上調(diào),提示EW治療可顯著抑制SCI后脊髓神經(jīng)元凋亡,并有效調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。

JAK/STAT信號通路參與細(xì)胞免疫、分化、死亡和腫瘤發(fā)生等過程, JAK2與其特異性底物STAT3結(jié)合形成二聚體/四聚體并穿過核膜,特異性結(jié)合DNA上的反應(yīng)元件并隨后轉(zhuǎn)錄下游靶基因,調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動過程[25]。研究[26]發(fā)現(xiàn), SCI早期病理改變可能涉及神經(jīng)元炎癥反應(yīng)、自噬、凋亡以及JAK2/STAT3信號通路的活化,而靶向阻斷JAK2/STAT3通路可明顯減輕大鼠中樞和外周神經(jīng)組織創(chuàng)傷或缺血損傷,抑制神經(jīng)元凋亡,改善神經(jīng)功能。陳霄雷等[27]研究指出, SCI可異常激活JAK2/STAT3信號通路,應(yīng)用JAK2磷酸化抑制劑AG490干預(yù)可抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)大鼠雙下肢運(yùn)動功能恢復(fù)。張睿等[28]發(fā)現(xiàn),依達(dá)拉奉處理可抑制JAK2/STAT3信號通路激活,減少脊髓繼發(fā)損傷所致細(xì)胞凋亡,起到神經(jīng)保護(hù)作用。XIAO S N等[29]發(fā)現(xiàn),山姜素通過靶向JAK2/STAT3信號通路而抑制SCI后神經(jīng)炎癥和神經(jīng)細(xì)胞凋亡,提示JAK2/STAT3通路在SCI發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本研究檢測JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)后發(fā)現(xiàn), p-JAK2、p-STAT3在sham組脊髓組織中幾乎不表達(dá), SCI組大鼠脊髓組織JAK2/STAT3信號明顯激活,而不同劑量EW治療組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)均低于SCI組且具有劑量依賴性,給予JAK2抑制劑AG490則可進(jìn)一步改善EW的治療效果,提示SCI后JAK2/STAT3信號通路激活, EW治療則可通過抑制JAK2/STAT3信號通路而改善SCI大鼠的預(yù)后。

綜上所述,蒙藥EW對急性SCI大鼠神經(jīng)功能具有保護(hù)作用,這可能與EW調(diào)控JAK2/STAT3信號通路而抑制神經(jīng)元細(xì)胞過度凋亡有關(guān)。