李建男，郝若堯，樊麗婷，李玉萌，張勝男，孟建宇

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院旱寒區(qū)環(huán)境微生物學(xué)與技術(shù)實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011；2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

磷是植物生長必需的第二營養(yǎng)元素， 對植物的生長發(fā)育有著重要作用， 磷可以加速植物的根系和幼芽的生長，促進細胞分裂，促進植物的呼吸作用和養(yǎng)分和水分的吸收；促進植物脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物的代謝、合成、運轉(zhuǎn)；提高植物的抗旱、抗寒、抗病和抗鹽堿的能力，并增強植物的抗逆性，改善產(chǎn)品的品質(zhì)；縮短根瘤的發(fā)育和存活時間，增加根瘤的體積、數(shù)量和氮素同化量，促進豆科植物根系的生長，提高豆科植物產(chǎn)品的含氮量和產(chǎn)量。 磷元素往往以難溶性磷的形式存在，植物很難吸收利用，所以在低水平可利用磷素的樟子松林地， 可利用磷的缺失必定會嚴重影響其幼苗的生長[1]。

樟子松 （Pinus sylvestris） 是一種具有抗旱、耐寒、耐貧瘠、抗病蟲害等抗逆能力的針葉樹種[2]，在我國西北、華北、東北地區(qū)廣泛分布，在遏制土地荒漠化、保護當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)牧生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用。但是，近幾年樟子松固沙林出現(xiàn)了嚴重的退化[3]。 有研究表明， 樟子松固沙林土壤含磷量處于我國森林生態(tài)系統(tǒng)土壤磷素含量的最低水平[4]，生長在荒漠地區(qū)的樟子松生長本就受干旱脅迫影響， 再加上土壤中可利用的磷含量較低，嚴重影響了樟子松的生長。

大量研究表明， 土壤中存在大量的溶磷菌（Phosphate Solubilizing Bacteria，PSB）， 溶磷菌是指能夠?qū)⑼寥乐胁蝗苄粤邹D(zhuǎn)化為可被植物吸收利用的磷的一類細菌。 目前發(fā)現(xiàn)具有溶磷作用的細菌有芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞桿菌（Pseudomonas）、歐文氏菌（Erwinia）、土壤桿菌（Agrobacterium）、沙雷氏菌（Serratia）、 黃桿菌 （Flavobacterium）、 腸桿菌（Enterbacter）、 微球菌 （Micrococcus）、 固氮菌（Azotobacter）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）、沙門氏菌（Saimonella）、色桿菌（Clromobacterium）、產(chǎn)堿菌（Alcaligenes）、 節(jié)桿菌 （Arthrobacter）、 硫桿菌（Thiobacillus）、埃希氏菌（Escherichia）[5-6]等。 有研究發(fā)現(xiàn)，將溶磷菌接種于植物后能顯著增加土壤及植株的磷、鉀、鎂等礦質(zhì)元素含量[7-9]，而且溶磷菌還可以改善植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)，并對植物生理指標有積極影響[10]。 邢芳芳等[11]分離得到的解磷菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對白菜具有明顯的促生作用，經(jīng)其處理后，白菜葉片數(shù)、葉綠素，以及產(chǎn)量都得到明顯提高，這說明本研究具有一定的可行性。

鑒于此， 本研究對遼寧省彰武縣樟子松固沙林的土壤樣品中的溶磷菌進行分離鑒定、 測定溶磷能力、分析固沙林土壤中的溶磷菌類群，旨在為后續(xù)溶磷菌能否對植物尤其是生存環(huán)境較差的植物產(chǎn)生促生效果提供理論基礎(chǔ)， 在不破環(huán)生態(tài)環(huán)境的基礎(chǔ)上使用微生物對植物的生長產(chǎn)生積極影響， 并且可以豐富功能根際促生細菌資源庫以及開發(fā)新的改善土壤磷素營養(yǎng)的途徑， 并為后續(xù)微生物肥料研發(fā)及樟子松固沙林修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 土壤樣品采自遼寧省彰武縣章古臺試驗基地，利用多點采樣法，選取7 點去除土壤表面枯枝落葉，收集深度為0～20 cm 的土壤，裝入無菌采樣袋，混合均勻后，置于4 ℃車載冰箱中，運回實驗室進行溶磷細菌的分離和純化。

1.1.2 培養(yǎng)基配方[12]無機磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g·L-1，硫酸銨0.5 g·L-1，氯化鈉0.3 g·L-1，氯化鉀0.3 g·L-1，七水硫酸鎂0.3 g·L-1，磷酸鈣5 g·L-1，七水硫酸亞鐵0.03 g·L-1， 一水硫酸錳0.03 g·L-1， 瓊脂20 g·L-1，蒸餾水1 000 mL，pH 值7.4～7.6。

R2A 液體培養(yǎng)基：酵母粉0.5 g·L-1，蛋白胨0.5 g·L-1，酸水解酪蛋白胨0.5 g·L-1，葡萄糖0.5 g·L-1，淀粉0.5 g·L-1，磷酸氫二鉀0.3 g·L-1，丙酮酸鈉0.3 g·L-1，七水硫酸鎂0.05 g·L-1，TES 2 mL，蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤細菌分離 稱取土樣1 g，加入100 mL，無菌水，放入搖床中振蕩30 min，靜置至土壤全部沉淀，吸取上清液依次按照1∶10 的比例稀釋。 取土壤懸浮液100 μL， 分別涂布在無機磷固體培養(yǎng)基上，每個梯度的稀釋液做3 組重復(fù)，倒置放入培養(yǎng)箱中，在28 ℃條件下，培養(yǎng)3～5 d。挑取形態(tài)不同的單一菌落進行劃線純化培養(yǎng)。

1.2.2 菌株的16S rDNA 的鑒定及其同源性分析按照試劑盒TIANamp Bacteria DNA Kit（China）的操作步驟提取DNA。 取細菌培養(yǎng)液3 mL，10 000 r·min-1離心1 min，吸上清液。 向沉淀物中加入200 μL 緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮。 向離心管中加入20 μL proteinase K 溶液，混勻。加入緩沖液GB 220 μL，振蕩15 s，在70 ℃水浴鍋中放置10 min，待離心管中溶液變清澈后， 短暫離心。 加入無水乙醇220 μL，振蕩15 s。將之前獲得的溶液及絮狀沉淀加入到一個CB3 吸附柱中，然后放入離心管中，12 000 r·min-1離心30 s， 倒掉廢液， 將吸附柱放入收集管中。 向CB3 吸附柱中加入緩沖液GD 500 μL，12 000 r·min-1離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。 向CB3 吸附.柱加入漂洗液PW 500 μL，12 000 r·min-1離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。 將吸附柱放入收集管中，12 000 r·min-1離心2 min，倒掉廢液，將CB3 吸附柱置.于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干吸附柱中的漂洗液。 將CB3 吸附柱放入一個干凈的離心管中， 向吸附膜的中間懸空滴加洗脫緩沖液TE 120 μL， 室溫靜置5 min，12 000 r·min-1離心2 min，將溶液收集到離心管中。 至此對細菌DNA 提取完成。 接下來對菌株的16S rDNA 進行擴增。 菌株的16S rDNA 基因擴增引物為細菌通用引物27F 和1492R。 PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序得到的16S rDNA 序列通過Blast-n （Nucleotide BLAST: Search nucleotide databases using a nucleotide query(nih.gov)）與Nucleotidecollection（Home-Nucleotide-NCBI（nih.gov））數(shù)據(jù)庫進行比對，用MEGA 6.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株的溶磷能力測定 將分離純化的溶磷菌接種至R2A 液體培養(yǎng)基中， 待菌株濃度生長至1×108CFU·mL-1時， 按1%接種量接種至無機磷液體培養(yǎng)基中， 放入溫度為28.5 ℃， 轉(zhuǎn)速為180 r·min-1的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。 吸取上清液10.00 mL 于25 mL 比色管中， 緩慢加入鉬銻抗顯色劑5.00 mL，緩慢搖動，排出二氧化碳后，加水定容至25.00 mL，充分搖勻。 在室溫高于20 ℃處， 放置30 min， 用1 cm 光徑玻璃比色皿在波長880 nm 處比色，測量吸光度。

吸取磷標準溶液 （磷標準使用液）0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL， 于25 mL 色管中，加入NaHCO3浸提劑10.00 mL， 鉬銻抗顯色劑5.00 mL，慢慢搖動，排出二氧化碳，后加水定容至25.00 mL。此系列溶液中磷的濃度依次為0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 μg·mL-1。 將溶液放置在室溫高于20～30 ℃處，放置30 min，用1 cm 光徑玻璃比色皿在波長880 nm 處比色，用系列溶液的零濃度調(diào)節(jié)儀器零點，測量吸光值，繪制標準曲線并計算回歸方程。 計算公式如下：

有效磷測定值（mg·kg-1）=（ρ×V×D）/（m×103）×103式中，ρ 為溶液中磷的質(zhì)量濃度 （μg·mL-1）；V 為顯色液體積，25 mL；D 為分取倍數(shù)， 即試樣提取液體積/顯色時分取體積，本試驗為50/10；M 為風(fēng)干試樣質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷菌的篩選

本研究從遼寧省彰武縣樟子松固沙林地土壤樣本中共分離獲得3 株具有較強溶磷能力的細菌，其編號分別為30-3、30-4 和36-5（表1）。 其中，菌株30-3 和30-4 的溶磷能力較強， 溶磷量均為37.63 mg·L-1；菌株36-5 的溶磷能力相對較弱，其溶磷量為32.24 mg·L-1。本研究分離到的菌株都是常見的具有溶磷能力的菌屬，溶磷能力屬于中等水平。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)16S rDNA 的測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫進行比對， 對菌株30-3、30-4、36-5 進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹（圖1）。 由圖1 可知，菌株30-3 與Bacillus aryabhattai處于同一分支，親緣關(guān)系較近，其序列同源性為99%；菌株30-4 與Paenibacillus tyrfis處于同一分支，親緣關(guān)系較近，其序列同源性為99%；菌株36-5 與Rhizobium jaguaris處于同一分支， 親緣關(guān)系較近， 其序列同源性為99%。 因此，3 株菌株分屬芽孢桿菌屬（Bacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）和根瘤菌屬（Rhizobium）。

圖1 基于16SrDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

3 討論與結(jié)論

本研究對遼寧省彰武縣樟子松固沙林土壤中的可培養(yǎng)溶磷細菌進行分離純化和鑒定， 獲得3 株具有較強溶磷能力的細菌， 其編號和近緣種分別為30-3（Bacillus aryabhattai）、30-4（Paenibacillustyrfis）和36-5（Rhizobium jaguaris）。 藺寶珺等[13]從高寒草甸土壤中分離出數(shù)量最多的溶磷菌為芽孢桿菌屬（Bacillus.sp）；孟建宇等[14]從內(nèi)蒙古荒漠灌木根內(nèi)分離出12 株具有溶磷能力的菌株，其中有5 株細菌屬于芽孢桿菌屬 （Bacillus.sp）， 占分離總菌株數(shù)的41.67%；孟建宇等[15]從內(nèi)蒙古鄂爾多斯荒漠5 種灌木根際土中分離出62 株具有溶磷能力的細菌，其中芽孢桿菌屬（Bacillus.sp）為優(yōu)勢屬，占分離總菌株數(shù)的17.74%。 本研究也分離得到一株芽孢桿菌，說明芽孢桿菌屬可能在溶磷菌中占有較大的百分比。 本研究結(jié)果表明， 菌株30-3 （Bacillus aryabhattai）和30-4（Paenibacillus tyrfis）具有較強的溶磷能力，且溶磷量都為37.63 mg·L-1； 菌株36-5（Rhizobium jaguaris）也具有一定的溶磷能力，其溶磷量為32.24 mg·L-1，說明芽孢桿菌屬（Bacillus）與類芽孢桿菌屬（Paenibacillus） 的溶磷能力可能強于根瘤菌屬（Rhizobium）。 有研究表明，Bacillus對難溶性磷酸鹽的溶解量為647.8 mg·L-1， 溶解有機磷的溶磷量為26.6 mg·L-1[16]。陳俊等[17]從紅樹林植物根際中分離出Paenibacillus ginsengagri，溶磷量為52.88 mg·L-1。 李劍鋒等[18]從蘭州市西北部屬溫帶半干旱大陸性氣候分離出Rhizobiumsp.，溶磷量為6.98 mg·L-1。通過以上的研究結(jié)果對比可知， 篩選出來的溶磷菌溶磷能力差異可能與其生存環(huán)境有關(guān)。 有研究表明，Bacillus除了具有溶磷作用之外，還具有一定的耐鹽性，可在20%NaCl 濃度下生長[19]。周妍等[20]發(fā)現(xiàn)，從綠豆根際土中分離的溶磷菌能夠促進植物在鹽脅迫下生長。 閆楊等[21]發(fā)現(xiàn)，Bacillus對土壤關(guān)鍵酶活性有一定的影響；Paenibacillus具有解鉀能力[22]，可以分泌植物體內(nèi)重要的激素-吲哚乙酸 （IAA）[23]，IAA不僅可以促進植物生長同時可以增強植物干旱脅迫抗性[24]。 王志剛等[25]從齊齊哈爾龍江縣辣椒根際土中得到3 株具有產(chǎn)IAA 能力的溶磷菌；Rhizobium具有耐堿能力[26]以及固氮能力[27]。根據(jù)16S rDNA的測序結(jié)果與NCBI BLAST 數(shù)據(jù)庫進行比對， 對菌株30-3、30-4 和36-5 進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹， 本研究發(fā)現(xiàn)菌株30-3 與Bacillusaryabhattai親緣關(guān)系較近；菌株30-4 與Paenibacillus tyrfis親緣關(guān)系較近； 菌株36-5 與Rhizobium jaguaris親緣關(guān)系較近。 吳倩倩等[28]在荒漠地區(qū)錦雞兒屬植物中篩選出Bacillus，且是6 種不同錦雞兒內(nèi)生菌的優(yōu)勢菌群。 李麗[29]從中國西北地區(qū)分離到159 株根瘤內(nèi)生細菌， 其中Paenibacillus有31 株，而且除了具有溶磷能力之外還具有產(chǎn)蛋白酶的能力；Rhizobium有25 株，除了具有溶磷能力之外，還具有固氮的能力，對植物生長都有著積極的影響，但是其能力是隨機的而且不穩(wěn)定。 綜上所述，土壤中存在具有溶磷能力的細菌，這些溶磷菌不僅可以提高土壤中可溶磷的含量，同時還能通過分泌自身代謝產(chǎn)物來促進植物生長，并提高植物的抗逆能力。

本研究從遼寧省彰武縣樟子松固沙林中分離出3 株溶磷細菌， 編號分別為30-3、30-4 和36-5，其最近緣物種分別為Bacillus aryabhattai、Paenibacillus tyrfis和Rhizobium tropici， 經(jīng)過測定均具有較強的溶磷能力。由此可知，遼寧省彰武縣樟子松固沙林土壤中具有較多種類的溶磷細菌， 將溶磷菌用于微生物肥料， 可為微生物磷肥的生產(chǎn)和開發(fā)提供菌種資源， 為解決樟子松人工固沙林土壤可溶磷含量低的問題提供理論依據(jù)， 對促進綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。