林 麗，馬雪寧，任宇坤，楊素清，閆景東，安月鵬

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是臨床常見的一種慢性、瘙癢性、炎癥性皮膚病，亦稱異位性濕疹。其病情遷延纏綿，給患者的生活造成嚴(yán)重影響[1]。AD的病因多與遺傳因素、環(huán)境因素、免疫因素及皮膚功能障礙相關(guān)[2]，現(xiàn)許多學(xué)者認(rèn)為輔助型T細(xì)胞1（helper T cell 1，Th1）/輔助型T細(xì)胞2（helper T cell 2，Th2）炎癥漂移是其免疫因素中的關(guān)鍵機(jī)制[3]。臨床上常應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及生物制劑等對AD進(jìn)行治療，但存在一定的不良反應(yīng)且容易復(fù)發(fā)，在臨床應(yīng)用中受到一定的限制[4]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為AD發(fā)病與血熱密不可分，且在血熱的基礎(chǔ)上，又經(jīng)風(fēng)邪襲表，入里化熱，成血熱風(fēng)燥之勢[5]。地黃飲出自《醫(yī)宗金鑒》，由生地黃、熟地黃、玄參、當(dāng)歸、白蒺藜、牡丹皮、紅花、僵蠶、陳皮、甘草組成。全方養(yǎng)血活血，祛風(fēng)止癢，與AD的病機(jī)吻合[6]。本研究采用2，4-二硝基氯苯（2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB）反復(fù)刺激的方法誘導(dǎo)AD小鼠模型，觀察地黃飲對模型小鼠的皮損炎癥程度、臟器指數(shù)、病理變化、肥大細(xì)胞浸潤情況的調(diào)控作用，同時檢測血清IgE、Th1型細(xì)胞因子IFN-γ及Th2型細(xì)胞因子IL-4水平并對其與皮損炎癥程度的相關(guān)性進(jìn)行分析，以探尋地黃飲對AD小鼠的藥效作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SPF級雌性BALB/c小鼠36只，體質(zhì)量（20±2）g，6周齡，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2020-0001。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境空氣流動，12 h/12 h明暗交替，溫度（22±2）℃，相對濕度50%～70%，自由飲水進(jìn)食，食用標(biāo)準(zhǔn)飼料，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。本次實驗通過黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：20200911-06）。

1.2 試劑與藥物 地黃飲（方藥組成：制何首烏10 g，生地黃25 g，熟地黃15 g，玄參15 g，當(dāng)歸15 g，白蒺藜20 g，牡丹皮15 g，紅花5 g，僵蠶15 g，陳皮20 g，甘草10 g），購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院草藥局，由王萍主任藥師鑒定藥材為正品。潤燥止癢膠囊（批號：2206032）購自國藥集團(tuán)同濟(jì)堂（貴州）制藥有限公司；石蠟（批號：2203167）購自Leica公司；無水乙醇（批號：B221117-1）購自天津永大化學(xué)試劑有限公司；蘇木素伊紅染色試劑盒（批號：081622221111）購自Beyotime公司；甲苯胺藍(lán)（批號：20220721）購自Solarbio公司；DNCB（批號：P2067548）購自damas-beta公司；小鼠免疫球蛋白E（IgE）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號：11/2022-YJ037602）、小鼠白介素-4（IL-4）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號：11/2022-YJ063156）、小鼠γ 干擾素（IFN-γ）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號：11/2022-YJ002277）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 儀器 4 ℃冰箱（海爾集團(tuán)電器有限公司，型號：SC-320D）；-80 ℃冰箱（日本Panasonic公司，型號：MDF-382E）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型號：SW-CJ-ZFD）；電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，型號：ME104E）；高壓蒸汽滅菌器（日本Panasonic公司，型號：MLS-3751L-PC）；純水系統(tǒng)（美國Millipore公司，型號：TANKPE0600）；移液槍（德國Eppendorf公司，型號：3120000）；顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號：BX53）；制冰機(jī)（常熟雪科電器有限公司，型號：IMS-50）；脫水機(jī)[科迪制冷設(shè)備（昆山）有限公司，型號：KD-TS3A]；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國Leica公司，型號：HistoCore MULTICUT）；生物組織攤烤烘片機(jī)[科迪制冷設(shè)備（昆山）有限公司，型號：KD-TI]；冷凍包埋機(jī)[科迪制冷設(shè)備（昆山）有限公司，型號：KD-BMIII]；恒溫振蕩器（上海一恒科技有限公司，型號：THZ-98AB）；低溫離心機(jī)（美國Thermo公司，型號：SORVALL ST8/8R）；酶標(biāo)儀（美國Thermo公司，型號：Mulitiskan FC）。

1.4 分組及造模 36只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、對照組、地黃飲低劑量組、地黃飲中劑量組、地黃飲高劑量組，每組6只。參考文獻(xiàn)建模方法[7-8]，將小鼠背部3 cm×2 cm區(qū)域進(jìn)行脫毛處理，除空白組外，其余各組第1、4、7天用移液槍向背部涂抹150 μL 1%DNCB溶液進(jìn)行致敏激發(fā)皮損，并于第15、17、19、21、23、25、27天用移液槍向背部涂抹150 μL 0.5% DNCB溶液維持皮損；空白組在相同時間節(jié)點、相同位置涂抹等劑量的基質(zhì)[V（丙酮）：V（橄欖油）=1:4]。實驗共28 d，于第29天取材。若模型組小鼠背部出現(xiàn)水腫剝脫、糜爛滲液或干燥鱗屑，且皮損炎癥程度評分與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），則造模成功。

1.5 藥物制備及給藥 地黃飲每劑藥量為155 g，加入8倍蒸餾水并浸泡40 min，冷凝回流1 h提取藥液并濾出；再加入6倍蒸餾水，冷凝回流40 min提取藥液并濾出。將2次濾液合并混勻，于70～80 ℃恒溫水浴箱中濃縮至1 g/mL，存于4 ℃冰箱中備用。對照組予潤燥止癢膠囊，將3 g潤燥止癢膠囊與5 mL 0.5%CMC-Na共同放入研缽，研磨至不會堵塞灌胃針即可，將溶液轉(zhuǎn)置于10 mL量瓶后定容搖勻備用。于第15～28天每日09:00:00—10:00:00進(jìn)行灌胃，1次/d。按照人與大鼠體表面積比例計算大鼠給藥劑量，地黃飲低、中、高劑量組劑量分別為10.08、20.15、40.30 g（/kg·d）（劑量約為體質(zhì)量70 kg成年人正常用量的0.5、1、2倍）；對照組劑量為780 mg/kg（劑量約為體質(zhì)量70 kg成年人正常用量的1倍）；空白組、模型組予等體積生理鹽水灌胃，3.42 mL（/kg·d）。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 皮損炎癥程度評分 從第1天起每日拍照記錄小鼠背部皮損變化。參照臨床EASI評分方法，于實驗第7、14、21、28天進(jìn)行皮損嚴(yán)重程度評分，包括紅斑、水腫/丘疹，表皮剝脫/抓痕，鱗屑/干燥4個方面，每項評分按0～3分的4級評分法，分值越大則皮損炎癥程度越高，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 皮損炎癥程度評分表

1.6.2 臟器指數(shù) 第28天給藥后禁食12 h，第29天稱取小鼠體質(zhì)量，以1%戊巴比妥鈉腹腔注射（50 mg/kg）麻醉小鼠，眼球目內(nèi)眥取血后處死，摘取脾臟及胸腺，稱量質(zhì)量，并計算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.6.3 皮膚組織病理變化 將各組小鼠受損皮膚組織置于4%多聚甲醛溶液中固定后，制備成4 μm皮損組織石蠟切片，經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及梯度乙醇脫蠟，蘇木素染色5 min，伊紅染色2 min后梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化并采集圖像進(jìn)行分析。

1.6.4 肥大細(xì)胞浸潤情況 將各組小鼠受損皮膚組織切片、脫蠟，甲苯胺藍(lán)染色5min，蒸餾水沖洗5min，95%乙醇分化2min，分別浸入無水乙醇Ⅰ、Ⅱ及二甲苯Ⅰ、Ⅱ各2 min，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察肥大細(xì)胞浸潤情況并采集圖像進(jìn)行分析統(tǒng)計。

1.6.5 血清IgE、IFN-γ、IL-4水平 采用ELISA法檢測小鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4水平，將各組小鼠的血液置于2 mL圓底離心管，在4 ℃、3 000 r/min、離心半徑138 mm的條件下離心10 min分離血清。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)孔加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣本孔先加樣品稀釋液40 μL，再加待測樣品10 μL，每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同），37 ℃溫育60 min，洗滌，每孔先后加入顯色劑A、B各50 μL，37 ℃避光顯色15 min，加終止液50 μL終止反應(yīng)，450 nm波長依序測量各孔OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算IgE、IFN-γ、IL-4含量。

1.7 相關(guān)性分析 分別將血清IgE、IFN-γ、IL-4與皮損炎癥程度評分進(jìn)行雙變量回歸分析，計算出相應(yīng)的回歸曲線方程和相關(guān)系數(shù)（r），探討其與皮損之間的相關(guān)性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 通過SPSS 26.0及GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行處理，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示。應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，LSD-t檢驗進(jìn)行兩兩比較，重復(fù)測量計量資料采用重復(fù)測量資料的方差分析，雙變量線性回歸分析進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠皮損炎癥程度評分比較 所有小鼠不同時間皮損炎癥程度評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），即存在時間效應(yīng)。各組小鼠皮損炎癥程度評分總體比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），即存在分組效應(yīng)。空白組小鼠背部未出現(xiàn)皮損，整體狀態(tài)良好；模型組小鼠背部出現(xiàn)水腫剝脫及糜爛滲液，部分可見干燥鱗屑及苔蘚樣變，與AD典型表現(xiàn)相符，皮損炎癥程度評分高于空白組（P＜0.05），說明DNCB能夠有效誘導(dǎo)AD，造模成功。經(jīng)治療后，與模型組比較，其余各組皮損均呈不同程度改善。第21、28天，對照組及地黃飲低、中、高劑量組小鼠皮損炎癥程度評分均低于模型組（P＜0.01或P＜0.05）；地黃飲中、高劑量組皮損炎癥程度評分低于對照組（P＜0.05）。時間因素與分組因素存在交互效應(yīng)（P＜0.01），即各組小鼠皮損炎癥程度評分降低幅度不一致。（見表2，圖1～2）

圖1 各組小鼠皮損圖

圖2 皮損炎癥程度評分交互效應(yīng)輪廓圖

表2 各組小鼠皮損炎癥程度評分比較 （，分）

表2 各組小鼠皮損炎癥程度評分比較 （，分）

注：F時間主效應(yīng)=9.501，P時間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=34.486；P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=3.767；P交互效應(yīng)=0.000；與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與對照組比較，dP＜0.05。

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2.2 各組小鼠臟器指數(shù)比較 模型組小鼠脾臟指數(shù)高于空白組（P＜0.05）；對照組及地黃飲中、高劑量組胸腺指數(shù)低于模型組（P＜0.01）；對照組及地黃飲低、中、高劑量組脾臟指數(shù)均低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）；地黃飲高劑量組脾臟指數(shù)低于對照組及地黃飲低、中劑量組（P＜0.01）。（見表3）

表3 各組小鼠臟器指數(shù)比較 （，mg/g）

表3 各組小鼠臟器指數(shù)比較 （，mg/g）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與對照組比較，dP＜0.05。

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2.3 皮膚組織病理變化 空白組小鼠皮膚表皮較薄，表皮與真皮交界清晰，無水腫及淋巴細(xì)胞浸潤；模型組小鼠表皮較厚，角質(zhì)層存在角化過度或不全，棘層肥厚、水腫，真皮層較厚且伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤，提示造模成功；對照組及地黃飲低、中、高劑量組表皮及真皮輕度肥厚，存在少量炎癥細(xì)胞浸潤。（見圖3）

圖3 各組小鼠皮膚組織形態(tài) （HE，×200）

2.4 肥大細(xì)胞浸潤情況 空白組小鼠皮膚真皮層中可見零星肥大細(xì)胞；模型組小鼠皮損部位真皮層肥大細(xì)胞數(shù)量高于空白組（P＜0.05），部分呈脫顆粒狀態(tài)；對照組及地黃飲低、中、高劑量組肥大細(xì)胞浸潤程度較低，肥大細(xì)胞數(shù)量低于模型組（P＜0.01）。（見表4，圖4）

圖4 各組小鼠皮膚真皮層中肥大細(xì)胞浸潤情況（免疫組化，×200）

表4 各組小鼠皮膚組織中肥大細(xì)胞數(shù)目比較 （，個）

表4 各組小鼠皮膚組織中肥大細(xì)胞數(shù)目比較 （，個）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.01；與對照組比較，cP＜0.05。

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2.5 各組小鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4水平比較 模型組小鼠血清IgE、IL-4水平高于空白組（P＜0.05），血清IFN-γ水平低于空白組（P＜0.05）；對照組與地黃飲低、中、高劑量組小鼠血清IgE、IL-4水平均低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），血清IFN-γ水平均高于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。（見表5）

表5 各組小鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4 水平比較 （）

表5 各組小鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4 水平比較 （）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與對照組比較，dP＜0.05。

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2.6 相關(guān)性分析 通過對治療后模型組、對照組及地黃飲低、中、高劑量組小鼠血清中IgE、IFN-γ、IL-4水平與各組小鼠皮損炎癥程度評分進(jìn)行雙變量回歸分析，求得直線回歸方程：Y=0.981bX+12.521（r=0.552，P＜0.05）；Y=-61.337bX+1214.837（r=-0.568，P＜0.05）；Y=7.865bX+204.306（r=0.558，P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。（見圖5）

圖5 血清IgE、IFN-γ、IL-4 含量與小鼠皮損炎癥程度評分相關(guān)性分析散點圖與直線擬合

3 討論

AD是一種全身炎癥性疾病，常在兒童期初發(fā)，可持續(xù)至成年，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[9-10]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病與機(jī)體免疫功能、遺傳基因和皮膚屏障等因素相關(guān)，但具體發(fā)病機(jī)制尚不明確[11]。目前西醫(yī)治療特應(yīng)性皮炎多采用糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、光療和生物制劑等手段[1]，雖可以取得確切治療效果，但其療效持續(xù)時間較短，易產(chǎn)生藥物依賴現(xiàn)象，停藥后易反彈，且費用較高，導(dǎo)致患者接受度有限。中醫(yī)藥治療AD可顯著減輕皮損與瘙癢程度，減少遷延，在緩解癥狀及降低復(fù)發(fā)率方面具有一定的優(yōu)勢。

中醫(yī)藥治療AD經(jīng)歷了長期的臨床實踐。《醫(yī)宗金鑒·外科心法要訣》記載：“血風(fēng)瘡證生遍身，粟形搔癢脂水淫，肝肺脾經(jīng)風(fēng)濕熱，久郁燥癢抓血津。”“此證由肝、脾二經(jīng)濕熱，外受風(fēng)邪，襲于皮膚，郁于肺經(jīng)，致遍身生瘡。形如粟米，瘙癢無度，抓破時，津脂水浸淫成片?！憋L(fēng)濕熱邪侵襲肝、脾、肺經(jīng)，郁久化風(fēng)，內(nèi)外風(fēng)邪共盛，耗血生火，灼燒陰津，瘙癢難耐，而致本病遷延難愈。本病患者內(nèi)受濕熱之邪，外感風(fēng)邪，為本虛標(biāo)實之證，與機(jī)體脾氣不盛，正氣不足相關(guān)[12]。故中醫(yī)學(xué)認(rèn)為AD患者平素稟賦不耐，脾土運化不利，濕熱內(nèi)生，又外感風(fēng)邪，入里化熱，而成血熱風(fēng)燥之勢，治宜涼血活血，搜風(fēng)止癢[13-14]。地黃飲出自《醫(yī)宗金鑒》。方中生地黃、熟地黃滋陰養(yǎng)血為君藥。熟地黃偏補(bǔ)血，生地黃偏涼血，兩者同用補(bǔ)而不燥[15-16]。何首烏生于春氣，為風(fēng)木之化而通肝經(jīng)，生用重補(bǔ)益，制用重養(yǎng)血，臨床實際應(yīng)用時因其存在肝腎毒性，可酌情去之[17]。三者共為君藥。當(dāng)歸補(bǔ)血活血，紅花活血調(diào)經(jīng)，兩者助熟地黃養(yǎng)血活血之力。玄參濡潤，既能滋陰，又能降浮火，與熟地黃相合攻補(bǔ)兼施。當(dāng)歸、紅花、玄參共為臣藥。僵蠶、白蒺藜祛風(fēng)止癢平肝，牡丹皮清熱涼血，陳皮順氣燥濕，共為佐藥。甘草為使藥，起調(diào)和之用。全方?jīng)鲅钛?，疏風(fēng)止癢，補(bǔ)而不燥，涼潤以滋養(yǎng)一身之肌表，攻補(bǔ)兼施，調(diào)理脾氣，標(biāo)本同治。藥理學(xué)研究表明，生地黃、熟地黃、何首烏均具有調(diào)控免疫系統(tǒng)作用。目前，地黃飲已廣泛應(yīng)用于特應(yīng)性皮炎的臨床治療，臨床療效佳，但其治療AD的作用機(jī)制研究較為少見?；诖?，本研究擬制備AD小鼠模型，以地黃飲進(jìn)行干預(yù)，探討地黃飲治療AD的效果，并基于Th1/Th2免疫失衡機(jī)制進(jìn)一步探索其可能作用機(jī)制。

免疫失衡為AD發(fā)生發(fā)展過程中最為重要的病理環(huán)節(jié)，尤以Th1/Th2失衡為主。兩者失去動態(tài)平衡并向以Th2型細(xì)胞為主的免疫環(huán)境傾斜[18-19]。Th2型細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量IgE及IL-4等炎癥細(xì)胞因子[20-21]，IL-4亦可間接活化肥大細(xì)胞[22]。活化的肥大細(xì)胞可產(chǎn)生一系列炎癥因子，與B淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞等相互作用，進(jìn)一步引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)[23-24]。同時，大量分泌的Th2型細(xì)胞因子與以IFN-γ為主的Th1型細(xì)胞因子形成拮抗[25]。此外，經(jīng)上述反應(yīng)后，效應(yīng)T細(xì)胞在外周血中呈高表達(dá)狀態(tài)，可誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞凋亡并使Th2型細(xì)胞含量上升[26-27]。因此，抑制Th2型細(xì)胞因子表達(dá)、調(diào)控肥大細(xì)胞活化、減輕炎癥反應(yīng)在抑制AD的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，在DNCB的刺激下，小鼠真皮層增厚并伴大量炎癥細(xì)胞浸潤，皮損炎癥程度評分升高，肥大細(xì)胞數(shù)量增加，脾臟指數(shù)上升，小鼠血清IgE、Th2型細(xì)胞因子IL-4水平上升，Th1型細(xì)胞因子IFN-γ水平下降，說明DNCB能夠加速肥大細(xì)胞脫顆粒進(jìn)程，促進(jìn)其活化，并同時對Th1/Th2炎癥平衡造成影響。結(jié)果顯示，地黃飲可改善小鼠皮膚組織炎炎癥細(xì)胞浸潤情況，降低皮損炎癥程度評分，減少肥大細(xì)胞數(shù)量，降低小鼠血清IgE、IL-4水平而升高IFN-γ水平，說明地黃飲能夠減輕肥大細(xì)胞活化，并可能通過影響脾臟功能而降低淋巴細(xì)胞的募集，促進(jìn)傾斜于Th2型細(xì)胞的免疫環(huán)境回正，改善炎癥反應(yīng)。且地黃飲高劑量組的效果較優(yōu)。同時，血清IgE、IL-4與小鼠皮損炎癥程度評分呈正相關(guān)關(guān)系，IFN-γ與小鼠皮損炎癥程度評分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，亦證明地黃飲可能通過調(diào)控Th1/Th2免疫平衡環(huán)境而對AD起到治療作用。

綜上所述，地黃飲能夠明顯減輕AD小鼠的皮膚炎癥細(xì)胞浸潤，改善皮膚病理情況，降低淋巴細(xì)胞募集、B細(xì)胞的產(chǎn)生及肥大細(xì)胞活化，降低血清IgE水平并調(diào)控炎癥環(huán)境。地黃飲可能通過減少肥大細(xì)胞浸潤，使免疫環(huán)境向Th2型細(xì)胞偏移的程度降低，減少Th2型炎癥因子分泌而對AD起到治療作用。