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        地黃飲對特應(yīng)性皮炎模型小鼠的藥效作用研究*

        2023-12-18 14:19:52馬雪寧任宇坤楊素清閆景東安月鵬
        中醫(yī)藥導(dǎo)報 2023年11期
        關(guān)鍵詞:肥大細(xì)胞皮損小鼠

        林 麗,馬雪寧,任宇坤,楊素清,閆景東,安月鵬

        (1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

        特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis,AD)是臨床常見的一種慢性、瘙癢性、炎癥性皮膚病,亦稱異位性濕疹。其病情遷延纏綿,給患者的生活造成嚴(yán)重影響[1]。AD的病因多與遺傳因素、環(huán)境因素、免疫因素及皮膚功能障礙相關(guān)[2],現(xiàn)許多學(xué)者認(rèn)為輔助型T細(xì)胞1(helper T cell 1,Th1)/輔助型T細(xì)胞2(helper T cell 2,Th2)炎癥漂移是其免疫因素中的關(guān)鍵機(jī)制[3]。臨床上常應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及生物制劑等對AD進(jìn)行治療,但存在一定的不良反應(yīng)且容易復(fù)發(fā),在臨床應(yīng)用中受到一定的限制[4]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為AD發(fā)病與血熱密不可分,且在血熱的基礎(chǔ)上,又經(jīng)風(fēng)邪襲表,入里化熱,成血熱風(fēng)燥之勢[5]。地黃飲出自《醫(yī)宗金鑒》,由生地黃、熟地黃、玄參、當(dāng)歸、白蒺藜、牡丹皮、紅花、僵蠶、陳皮、甘草組成。全方養(yǎng)血活血,祛風(fēng)止癢,與AD的病機(jī)吻合[6]。本研究采用2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene,DNCB)反復(fù)刺激的方法誘導(dǎo)AD小鼠模型,觀察地黃飲對模型小鼠的皮損炎癥程度、臟器指數(shù)、病理變化、肥大細(xì)胞浸潤情況的調(diào)控作用,同時檢測血清IgE、Th1型細(xì)胞因子IFN-γ及Th2型細(xì)胞因子IL-4水平并對其與皮損炎癥程度的相關(guān)性進(jìn)行分析,以探尋地黃飲對AD小鼠的藥效作用及機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 動物 健康SPF級雌性BALB/c小鼠36只,體質(zhì)量(20±2)g,6周齡,購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(遼)2020-0001。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境空氣流動,12 h/12 h明暗交替,溫度(22±2)℃,相對濕度50%~70%,自由飲水進(jìn)食,食用標(biāo)準(zhǔn)飼料,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。本次實驗通過黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:20200911-06)。

        1.2 試劑與藥物 地黃飲(方藥組成:制何首烏10 g,生地黃25 g,熟地黃15 g,玄參15 g,當(dāng)歸15 g,白蒺藜20 g,牡丹皮15 g,紅花5 g,僵蠶15 g,陳皮20 g,甘草10 g),購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院草藥局,由王萍主任藥師鑒定藥材為正品。潤燥止癢膠囊(批號:2206032)購自國藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司;石蠟(批號:2203167)購自Leica公司;無水乙醇(批號:B221117-1)購自天津永大化學(xué)試劑有限公司;蘇木素伊紅染色試劑盒(批號:081622221111)購自Beyotime公司;甲苯胺藍(lán)(批號:20220721)購自Solarbio公司;DNCB(批號:P2067548)購自damas-beta公司;小鼠免疫球蛋白E(IgE)酶聯(lián)免疫試劑盒(批號:11/2022-YJ037602)、小鼠白介素-4(IL-4)酶聯(lián)免疫試劑盒(批號:11/2022-YJ063156)、小鼠γ 干擾素(IFN-γ)酶聯(lián)免疫試劑盒(批號:11/2022-YJ002277)均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

        1.3 儀器 4 ℃冰箱(海爾集團(tuán)電器有限公司,型號:SC-320D);-80 ℃冰箱(日本Panasonic公司,型號:MDF-382E);超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司,型號:SW-CJ-ZFD);電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司,型號:ME104E);高壓蒸汽滅菌器(日本Panasonic公司,型號:MLS-3751L-PC);純水系統(tǒng)(美國Millipore公司,型號:TANKPE0600);移液槍(德國Eppendorf公司,型號:3120000);顯微鏡(日本OLYMPUS公司,型號:BX53);制冰機(jī)(常熟雪科電器有限公司,型號:IMS-50);脫水機(jī)[科迪制冷設(shè)備(昆山)有限公司,型號:KD-TS3A];輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國Leica公司,型號:HistoCore MULTICUT);生物組織攤烤烘片機(jī)[科迪制冷設(shè)備(昆山)有限公司,型號:KD-TI];冷凍包埋機(jī)[科迪制冷設(shè)備(昆山)有限公司,型號:KD-BMIII];恒溫振蕩器(上海一恒科技有限公司,型號:THZ-98AB);低溫離心機(jī)(美國Thermo公司,型號:SORVALL ST8/8R);酶標(biāo)儀(美國Thermo公司,型號:Mulitiskan FC)。

        1.4 分組及造模 36只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、對照組、地黃飲低劑量組、地黃飲中劑量組、地黃飲高劑量組,每組6只。參考文獻(xiàn)建模方法[7-8],將小鼠背部3 cm×2 cm區(qū)域進(jìn)行脫毛處理,除空白組外,其余各組第1、4、7天用移液槍向背部涂抹150 μL 1%DNCB溶液進(jìn)行致敏激發(fā)皮損,并于第15、17、19、21、23、25、27天用移液槍向背部涂抹150 μL 0.5% DNCB溶液維持皮損;空白組在相同時間節(jié)點、相同位置涂抹等劑量的基質(zhì)[V(丙酮):V(橄欖油)=1:4]。實驗共28 d,于第29天取材。若模型組小鼠背部出現(xiàn)水腫剝脫、糜爛滲液或干燥鱗屑,且皮損炎癥程度評分與空白組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),則造模成功。

        1.5 藥物制備及給藥 地黃飲每劑藥量為155 g,加入8倍蒸餾水并浸泡40 min,冷凝回流1 h提取藥液并濾出;再加入6倍蒸餾水,冷凝回流40 min提取藥液并濾出。將2次濾液合并混勻,于70~80 ℃恒溫水浴箱中濃縮至1 g/mL,存于4 ℃冰箱中備用。對照組予潤燥止癢膠囊,將3 g潤燥止癢膠囊與5 mL 0.5%CMC-Na共同放入研缽,研磨至不會堵塞灌胃針即可,將溶液轉(zhuǎn)置于10 mL量瓶后定容搖勻備用。于第15~28天每日09:00:00—10:00:00進(jìn)行灌胃,1次/d。按照人與大鼠體表面積比例計算大鼠給藥劑量,地黃飲低、中、高劑量組劑量分別為10.08、20.15、40.30 g(/kg·d)(劑量約為體質(zhì)量70 kg成年人正常用量的0.5、1、2倍);對照組劑量為780 mg/kg(劑量約為體質(zhì)量70 kg成年人正常用量的1倍);空白組、模型組予等體積生理鹽水灌胃,3.42 mL(/kg·d)。

        1.6 觀察指標(biāo)

        1.6.1 皮損炎癥程度評分 從第1天起每日拍照記錄小鼠背部皮損變化。參照臨床EASI評分方法,于實驗第7、14、21、28天進(jìn)行皮損嚴(yán)重程度評分,包括紅斑、水腫/丘疹,表皮剝脫/抓痕,鱗屑/干燥4個方面,每項評分按0~3分的4級評分法,分值越大則皮損炎癥程度越高,評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

        表1 皮損炎癥程度評分表

        1.6.2 臟器指數(shù) 第28天給藥后禁食12 h,第29天稱取小鼠體質(zhì)量,以1%戊巴比妥鈉腹腔注射(50 mg/kg)麻醉小鼠,眼球目內(nèi)眥取血后處死,摘取脾臟及胸腺,稱量質(zhì)量,并計算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量。

        1.6.3 皮膚組織病理變化 將各組小鼠受損皮膚組織置于4%多聚甲醛溶液中固定后,制備成4 μm皮損組織石蠟切片,經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及梯度乙醇脫蠟,蘇木素染色5 min,伊紅染色2 min后梯度乙醇脫水,中性樹膠封片,于顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化并采集圖像進(jìn)行分析。

        1.6.4 肥大細(xì)胞浸潤情況 將各組小鼠受損皮膚組織切片、脫蠟,甲苯胺藍(lán)染色5min,蒸餾水沖洗5min,95%乙醇分化2min,分別浸入無水乙醇Ⅰ、Ⅱ及二甲苯Ⅰ、Ⅱ各2 min,中性樹膠封片,于顯微鏡下觀察肥大細(xì)胞浸潤情況并采集圖像進(jìn)行分析統(tǒng)計。

        1.6.5 血清IgE、IFN-γ、IL-4水平 采用ELISA法檢測小鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4水平,將各組小鼠的血液置于2 mL圓底離心管,在4 ℃、3 000 r/min、離心半徑138 mm的條件下離心10 min分離血清。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)孔加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μL,樣本孔先加樣品稀釋液40 μL,再加待測樣品10 μL,每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同),37 ℃溫育60 min,洗滌,每孔先后加入顯色劑A、B各50 μL,37 ℃避光顯色15 min,加終止液50 μL終止反應(yīng),450 nm波長依序測量各孔OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算IgE、IFN-γ、IL-4含量。

        1.7 相關(guān)性分析 分別將血清IgE、IFN-γ、IL-4與皮損炎癥程度評分進(jìn)行雙變量回歸分析,計算出相應(yīng)的回歸曲線方程和相關(guān)系數(shù)(r),探討其與皮損之間的相關(guān)性。

        1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 通過SPSS 26.0及GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行處理,計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”()表示。應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行組間比較,LSD-t檢驗進(jìn)行兩兩比較,重復(fù)測量計量資料采用重復(fù)測量資料的方差分析,雙變量線性回歸分析進(jìn)行相關(guān)性分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組小鼠皮損炎癥程度評分比較 所有小鼠不同時間皮損炎癥程度評分比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),即存在時間效應(yīng)。各組小鼠皮損炎癥程度評分總體比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),即存在分組效應(yīng)。空白組小鼠背部未出現(xiàn)皮損,整體狀態(tài)良好;模型組小鼠背部出現(xiàn)水腫剝脫及糜爛滲液,部分可見干燥鱗屑及苔蘚樣變,與AD典型表現(xiàn)相符,皮損炎癥程度評分高于空白組(P<0.05),說明DNCB能夠有效誘導(dǎo)AD,造模成功。經(jīng)治療后,與模型組比較,其余各組皮損均呈不同程度改善。第21、28天,對照組及地黃飲低、中、高劑量組小鼠皮損炎癥程度評分均低于模型組(P<0.01或P<0.05);地黃飲中、高劑量組皮損炎癥程度評分低于對照組(P<0.05)。時間因素與分組因素存在交互效應(yīng)(P<0.01),即各組小鼠皮損炎癥程度評分降低幅度不一致。(見表2,圖1~2)

        圖1 各組小鼠皮損圖

        圖2 皮損炎癥程度評分交互效應(yīng)輪廓圖

        表2 各組小鼠皮損炎癥程度評分比較 (,分)

        表2 各組小鼠皮損炎癥程度評分比較 (,分)

        注:F時間主效應(yīng)=9.501,P時間主效應(yīng)=0.000;F分組主效應(yīng)=34.486;P分組主效應(yīng)=0.000;F交互效應(yīng)=3.767;P交互效應(yīng)=0.000;與空白組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05,cP<0.01;與對照組比較,dP<0.05。

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        2.2 各組小鼠臟器指數(shù)比較 模型組小鼠脾臟指數(shù)高于空白組(P<0.05);對照組及地黃飲中、高劑量組胸腺指數(shù)低于模型組(P<0.01);對照組及地黃飲低、中、高劑量組脾臟指數(shù)均低于模型組(P<0.05或P<0.01);地黃飲高劑量組脾臟指數(shù)低于對照組及地黃飲低、中劑量組(P<0.01)。(見表3)

        表3 各組小鼠臟器指數(shù)比較 (,mg/g)

        表3 各組小鼠臟器指數(shù)比較 (,mg/g)

        注:與空白組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05,cP<0.01;與對照組比較,dP<0.05。

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        2.3 皮膚組織病理變化 空白組小鼠皮膚表皮較薄,表皮與真皮交界清晰,無水腫及淋巴細(xì)胞浸潤;模型組小鼠表皮較厚,角質(zhì)層存在角化過度或不全,棘層肥厚、水腫,真皮層較厚且伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤,提示造模成功;對照組及地黃飲低、中、高劑量組表皮及真皮輕度肥厚,存在少量炎癥細(xì)胞浸潤。(見圖3)

        圖3 各組小鼠皮膚組織形態(tài) (HE,×200)

        2.4 肥大細(xì)胞浸潤情況 空白組小鼠皮膚真皮層中可見零星肥大細(xì)胞;模型組小鼠皮損部位真皮層肥大細(xì)胞數(shù)量高于空白組(P<0.05),部分呈脫顆粒狀態(tài);對照組及地黃飲低、中、高劑量組肥大細(xì)胞浸潤程度較低,肥大細(xì)胞數(shù)量低于模型組(P<0.01)。(見表4,圖4)

        圖4 各組小鼠皮膚真皮層中肥大細(xì)胞浸潤情況(免疫組化,×200)

        表4 各組小鼠皮膚組織中肥大細(xì)胞數(shù)目比較 (,個)

        表4 各組小鼠皮膚組織中肥大細(xì)胞數(shù)目比較 (,個)

        注:與空白組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.01;與對照組比較,cP<0.05。

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        2.5 各組小鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4水平比較 模型組小鼠血清IgE、IL-4水平高于空白組(P<0.05),血清IFN-γ水平低于空白組(P<0.05);對照組與地黃飲低、中、高劑量組小鼠血清IgE、IL-4水平均低于模型組(P<0.05或P<0.01),血清IFN-γ水平均高于模型組(P<0.05或P<0.01)。(見表5)

        表5 各組小鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4 水平比較 ()

        表5 各組小鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4 水平比較 ()

        注:與空白組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05,cP<0.01;與對照組比較,dP<0.05。

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        2.6 相關(guān)性分析 通過對治療后模型組、對照組及地黃飲低、中、高劑量組小鼠血清中IgE、IFN-γ、IL-4水平與各組小鼠皮損炎癥程度評分進(jìn)行雙變量回歸分析,求得直線回歸方程:Y=0.981bX+12.521(r=0.552,P<0.05);Y=-61.337bX+1214.837(r=-0.568,P<0.05);Y=7.865bX+204.306(r=0.558,P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(見圖5)

        圖5 血清IgE、IFN-γ、IL-4 含量與小鼠皮損炎癥程度評分相關(guān)性分析散點圖與直線擬合

        3 討論

        AD是一種全身炎癥性疾病,常在兒童期初發(fā),可持續(xù)至成年,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[9-10]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病與機(jī)體免疫功能、遺傳基因和皮膚屏障等因素相關(guān),但具體發(fā)病機(jī)制尚不明確[11]。目前西醫(yī)治療特應(yīng)性皮炎多采用糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、光療和生物制劑等手段[1],雖可以取得確切治療效果,但其療效持續(xù)時間較短,易產(chǎn)生藥物依賴現(xiàn)象,停藥后易反彈,且費用較高,導(dǎo)致患者接受度有限。中醫(yī)藥治療AD可顯著減輕皮損與瘙癢程度,減少遷延,在緩解癥狀及降低復(fù)發(fā)率方面具有一定的優(yōu)勢。

        中醫(yī)藥治療AD經(jīng)歷了長期的臨床實踐。《醫(yī)宗金鑒·外科心法要訣》記載:“血風(fēng)瘡證生遍身,粟形搔癢脂水淫,肝肺脾經(jīng)風(fēng)濕熱,久郁燥癢抓血津。”“此證由肝、脾二經(jīng)濕熱,外受風(fēng)邪,襲于皮膚,郁于肺經(jīng),致遍身生瘡。形如粟米,瘙癢無度,抓破時,津脂水浸淫成片?!憋L(fēng)濕熱邪侵襲肝、脾、肺經(jīng),郁久化風(fēng),內(nèi)外風(fēng)邪共盛,耗血生火,灼燒陰津,瘙癢難耐,而致本病遷延難愈。本病患者內(nèi)受濕熱之邪,外感風(fēng)邪,為本虛標(biāo)實之證,與機(jī)體脾氣不盛,正氣不足相關(guān)[12]。故中醫(yī)學(xué)認(rèn)為AD患者平素稟賦不耐,脾土運化不利,濕熱內(nèi)生,又外感風(fēng)邪,入里化熱,而成血熱風(fēng)燥之勢,治宜涼血活血,搜風(fēng)止癢[13-14]。地黃飲出自《醫(yī)宗金鑒》。方中生地黃、熟地黃滋陰養(yǎng)血為君藥。熟地黃偏補(bǔ)血,生地黃偏涼血,兩者同用補(bǔ)而不燥[15-16]。何首烏生于春氣,為風(fēng)木之化而通肝經(jīng),生用重補(bǔ)益,制用重養(yǎng)血,臨床實際應(yīng)用時因其存在肝腎毒性,可酌情去之[17]。三者共為君藥。當(dāng)歸補(bǔ)血活血,紅花活血調(diào)經(jīng),兩者助熟地黃養(yǎng)血活血之力。玄參濡潤,既能滋陰,又能降浮火,與熟地黃相合攻補(bǔ)兼施。當(dāng)歸、紅花、玄參共為臣藥。僵蠶、白蒺藜祛風(fēng)止癢平肝,牡丹皮清熱涼血,陳皮順氣燥濕,共為佐藥。甘草為使藥,起調(diào)和之用。全方?jīng)鲅钛?,疏風(fēng)止癢,補(bǔ)而不燥,涼潤以滋養(yǎng)一身之肌表,攻補(bǔ)兼施,調(diào)理脾氣,標(biāo)本同治。藥理學(xué)研究表明,生地黃、熟地黃、何首烏均具有調(diào)控免疫系統(tǒng)作用。目前,地黃飲已廣泛應(yīng)用于特應(yīng)性皮炎的臨床治療,臨床療效佳,但其治療AD的作用機(jī)制研究較為少見?;诖?,本研究擬制備AD小鼠模型,以地黃飲進(jìn)行干預(yù),探討地黃飲治療AD的效果,并基于Th1/Th2免疫失衡機(jī)制進(jìn)一步探索其可能作用機(jī)制。

        免疫失衡為AD發(fā)生發(fā)展過程中最為重要的病理環(huán)節(jié),尤以Th1/Th2失衡為主。兩者失去動態(tài)平衡并向以Th2型細(xì)胞為主的免疫環(huán)境傾斜[18-19]。Th2型細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量IgE及IL-4等炎癥細(xì)胞因子[20-21],IL-4亦可間接活化肥大細(xì)胞[22]。活化的肥大細(xì)胞可產(chǎn)生一系列炎癥因子,與B淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞等相互作用,進(jìn)一步引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)[23-24]。同時,大量分泌的Th2型細(xì)胞因子與以IFN-γ為主的Th1型細(xì)胞因子形成拮抗[25]。此外,經(jīng)上述反應(yīng)后,效應(yīng)T細(xì)胞在外周血中呈高表達(dá)狀態(tài),可誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞凋亡并使Th2型細(xì)胞含量上升[26-27]。因此,抑制Th2型細(xì)胞因子表達(dá)、調(diào)控肥大細(xì)胞活化、減輕炎癥反應(yīng)在抑制AD的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示,在DNCB的刺激下,小鼠真皮層增厚并伴大量炎癥細(xì)胞浸潤,皮損炎癥程度評分升高,肥大細(xì)胞數(shù)量增加,脾臟指數(shù)上升,小鼠血清IgE、Th2型細(xì)胞因子IL-4水平上升,Th1型細(xì)胞因子IFN-γ水平下降,說明DNCB能夠加速肥大細(xì)胞脫顆粒進(jìn)程,促進(jìn)其活化,并同時對Th1/Th2炎癥平衡造成影響。結(jié)果顯示,地黃飲可改善小鼠皮膚組織炎炎癥細(xì)胞浸潤情況,降低皮損炎癥程度評分,減少肥大細(xì)胞數(shù)量,降低小鼠血清IgE、IL-4水平而升高IFN-γ水平,說明地黃飲能夠減輕肥大細(xì)胞活化,并可能通過影響脾臟功能而降低淋巴細(xì)胞的募集,促進(jìn)傾斜于Th2型細(xì)胞的免疫環(huán)境回正,改善炎癥反應(yīng)。且地黃飲高劑量組的效果較優(yōu)。同時,血清IgE、IL-4與小鼠皮損炎癥程度評分呈正相關(guān)關(guān)系,IFN-γ與小鼠皮損炎癥程度評分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,亦證明地黃飲可能通過調(diào)控Th1/Th2免疫平衡環(huán)境而對AD起到治療作用。

        綜上所述,地黃飲能夠明顯減輕AD小鼠的皮膚炎癥細(xì)胞浸潤,改善皮膚病理情況,降低淋巴細(xì)胞募集、B細(xì)胞的產(chǎn)生及肥大細(xì)胞活化,降低血清IgE水平并調(diào)控炎癥環(huán)境。地黃飲可能通過減少肥大細(xì)胞浸潤,使免疫環(huán)境向Th2型細(xì)胞偏移的程度降低,減少Th2型炎癥因子分泌而對AD起到治療作用。

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