王小會，苗貴東，彭紫威，龍曉武，王封瑞，劉顯威

（1.黔西南州生物遺傳資源挖掘與分子育種重點實驗室，貴州 興義 562400；2.興義民族師范學院生物與化學學院，貴州 興義 562400）

昆明裂腹魚（Schizothorax grahami） 是鯉科裂腹魚屬的一種魚類。迄今全球共發(fā)現(xiàn)裂腹魚類15 屬100 余種，我國有11 屬76 種。昆明裂腹魚僅分布于西南地區(qū)，在貴州省主要分布于南、北盤江的上游支流、烏江上游以及金沙江下游干支流，現(xiàn)已被列為貴州省重點保護魚類之一。昆明裂腹魚野生種群資源極少，人工繁育及養(yǎng)殖成為種群資源維持的重要手段[1]。

FGF 基因，最早發(fā)現(xiàn)它能夠刺激卵巢成纖維細胞的分裂增殖，所以又稱為成纖維細胞生長因子[2]。研究表明FGF 基因還參與其他的生物學過程，如生長、發(fā)育、性別決定和分化、增值、遷移，并且對個體的胚胎發(fā)育、卵泡發(fā)育、生殖細胞的成熟、能量代謝、器官的發(fā)育和形成、組織修復、骨骼發(fā)育以及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用[3]。通過對昆明裂腹魚FGF 基因的研究將為昆明裂腹魚發(fā)育、生殖及性別調(diào)控機制揭示起到重要的推動作用。

1 實驗材料與方法

本研究昆明裂腹魚采自中國科學院昆明動物研究所珍稀魚類保育研究基地，取其魚鰭95%酒精脫水，-20℃保存?zhèn)溆肹4]。對全長轉錄組文庫第二代、第三代高通量聯(lián)合測序結果解析得到的FGF 基因全長序列，根據(jù)所獲的序列設計引物，進行PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物直接雙向測序驗證該基因序列。對測序獲得的準確的FGF 基因序列進行結構解析與基因進化分析。

2 實驗結果

2.1 昆明裂腹魚基因組DNA 提取

取適量組織，采用天根生物海洋動物組織基因組提取試劑盒，按照試劑盒使用方法提取高質(zhì)量基因組DNA，-20 ℃保存用于后續(xù)實驗?；蚪MDNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1。主條帶清晰，點樣孔較干凈，表明基因組DNA 質(zhì)量良好，滿足后續(xù)實驗要求。

圖1 基因組DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

2.2 FGF 基因引物合成與測序驗證

根據(jù)全長轉錄組基因文庫，利用Primer Premier 5.0 進行FGF 基因引物設計，將設計好的引物送至華大基因進行引物合成。引物信息見表1。利用設計的引物進行PCR 擴增（見圖2），并優(yōu)化至最優(yōu)結果，PCR 產(chǎn)物直接測序驗證基因序列。

圖2 昆明裂腹魚引物LFFGF PCR 擴增結果

表1 昆明裂腹魚FGF 基因引物信息

2.3 PCR 產(chǎn)物測序結果

將上述PCR 產(chǎn)物送生工生物（上海） 有限公司進行測序，測序結果如圖3 所示。

圖3 昆明裂腹魚FGF 基因測序（片段）結果

2.4 昆明裂腹魚FGF 基因的測序結果分析

2.4.1 堿基分析

根據(jù)正反向測序結果，利用BioEdit 軟件進行序列拼接[5]，得到787 bp 的基因序列。經(jīng)比對表明測序序列與三代測序結果一致，三代高通量測序具有較高的質(zhì)量，能夠用于基因結構分析。使用在線分析工具確定該FGF 基因中，得到A 為553 個，占比27%；T 為549 個，占比28%；G 為507 個，占比24%；C 為428 個，占比21%。

2.4.2 FGF 基因蛋白表達預測分析

利用NCBI 提供的ORF finder 工具預測[6]，F(xiàn)GF基因全長轉錄組序列有一個完整的ORF，長度為699 bp，一共編碼232 個氨基酸；使用Prot-Param在線軟件分析得到FGF 基因蛋白分子式為C1180-H1885N339O328S11，相對分子質(zhì)量為26 421.68 Da；等電點（PI） 為9.99；不穩(wěn)定系數(shù)為51.98，該蛋白的結構較為不穩(wěn)定。利用在線軟件Expasy-ProtScal 對FGF 基因編碼的氨基酸序列進行親疏水性的預測，結果如圖4，由圖中疏水值判斷，F(xiàn)GF基因編碼的蛋白親水性氨基酸數(shù)量要多于疏水性氨基酸的數(shù)量，初步判定此蛋白為親水性蛋白。

圖4 FGF 蛋白親水性/疏水性分析結果

利用編碼的氨基酸序列在NCBI 上進行蛋白質(zhì)同源性比對，結果顯示與鯉魚的FGF13 基因一致性達到99.50%，初步確定此昆明裂腹魚FGF 基因為FGF13 基因；FGF13 基因有FGF13a-1、FGF13a-2、FGF13b 等3 種基因，進一步比對發(fā)現(xiàn)，該基因與FGF13a-2 同源性最高，為99.01%，與FGF13b、FGF13a-1 比對，同源性分別為86.84%、98.52%。由此確定該基因為FGF13a-2 基因。

使用Conserved Domain 軟件對編碼的氨基酸序列進行蛋白質(zhì)結構域預測[7]，結構域預測表明昆明裂腹魚FGF 基因含有受體結合位點和肝素結合位點等2 個結構域，結構域分別位于基因的前半部分和后半部分，F(xiàn)GF 基因編碼的蛋白屬于FGF 轉錄因子超家族成員。

使用SOPMA 在線工具對FGF 編碼蛋白的二級結構進行預測[8]，結果如圖5 所示。FGF 基因編碼蛋白的二級結構共有4 種，α-螺旋有52 個氨基酸，占比為22.41%；β-轉角有19 個氨基酸，占比為8.19%；延伸鏈有50 個氨基酸，占比為21.55%；無規(guī)卷曲占比為47.84%。

圖5 FGF 蛋白二級結構分析

FGF 蛋白的三級結構預測結果表明其蛋白質(zhì)中主要為無規(guī)則卷曲，有少量的α-螺旋、β-轉角、延伸鏈，與預測的FGF 基因蛋白二級結構相似，如圖6 所示。

圖6 FGF 基因的三級結構預測分析

2.4.3 FGF 基因核酸序列進化分析

利用NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得金線鲃（Sinocyclocheilus grahami）、鯉魚（Cyprinus carpio）、鯽魚（Carassius auratus）、斑馬魚（Danio rerio）、紅腹食人魚（Pygocentrus nattereri）、大蓋巨脂鯉（Colossoma macropomum）、墨西哥脂鯉（Astyanax mexicanus）、遮目魚（Chanos chanos）、斑點叉尾鮰（Ictaluruspunctatus）、巴丁魚（Pangasianodon hypophthalmus）、大西洋鮭（Salmo salar） FGF 基因的核酸序列，運用MEGA 軟件與昆明裂腹魚FGF 基因序列進行進化分析[9]，核苷酸序列的同源性如圖7 所示。

3 分析與討論

利用PCR 產(chǎn)物直接測序與三代測序結果對比分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF 基因787 bp 序列僅有2 bp 的堿基差別，表明三代全長轉錄文庫測序所得基因序列具有較高的準確性，可以實現(xiàn)對基因結構的初步預測與分析。FGF 基因ORF 長度為699 bp，編碼232 個氨基酸，分子式為C1180H1885N339O32-8S11；相對分子質(zhì)量為26 421.68 Da；等電點（PI） 為9.99；不穩(wěn)定系數(shù)為51.98。對獲得的基因序列與相關近源物種及區(qū)域品種構建進化樹，確立其進化關系，結果顯示與金線鲃、鯉魚、鯽魚、斑馬魚的親緣關系較近。通過氨基酸序列比對，與鯉魚的FGF13 基因同源性最高，為99.50%；將FGF13a-1、FGF-13a-2、FGF13b 等3 種基因與FGF 基因全長編碼的氨基酸序列進行同源性比對，結果顯示與FGF13a-2 同源性最高，為99.01%，與FGF13b、FGF13a-1 比對，同源性分別為86.84%、98.52%。由此初步確定昆明裂腹魚FGF 基因為FGF13a-2 基因。該研究結果與FGF13 基因的同源性較高，可確定所獲得FGF基因為FGF13 基因家族成員[10]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF 基因含有受體結合位點和肝素結合位點2 個結構域，對FGF 基因編碼的蛋白質(zhì)進行親疏水性預測以及二級結構、三級結構預測，結果表明，昆明裂腹魚FGF 蛋白具有轉錄因子超家族成員的蛋白結構特征[11]。昆明裂腹魚FGF 基因的研究為進一步分析基因在組織中的表達及基因功能的深入研究奠定基礎，也為昆明裂腹魚相關基因與發(fā)育關系研究奠定了一定基礎。